Antimicrobiële synergie testen door de Inkjet Printer-bijgewoonde geautomatiseerde dambord matrix en de handmatige methode van de tijd-kill

Handmatige checkerboard array synergie testen is een arbeidsintensieve en foutgevoelige methode. Onze geautomatiseerde inkjetprintergebaseerde dambordmethode verbetert daarentegen de snelheid, nauwkeurigheid en doorvoer aanzienlijk. De geautomatiseerde dambordmethode maakt het mogelijk om grote aantallen geneesmiddelen te screenen op synergetische combinaties, terwijl de time-kill-methode de activiteit van deze combinaties kan bevestigen en verder kan verkennen.

Nieuwe antibiotica ontdekking is niet gelijke tred houden met de verspreiding van resistentie, maar het onderzoek van synergetische combinaties biedt een mogelijkheid voor het bergen van bestaande geneesmiddelen om resistente bacteriën te behandelen. Hoewel we deze techniek met antibacteriële stoffen demonstreren, kan het ook worden gebruikt met andere klassen van antimicrobiële stoffen of zelfs voor verschillende soorten combinatiegeneevingsmiddel of samengestelde tests. In deze video demonstreren we een geautomatiseerde checkerboard array methode en een handmatige time-kill methode.

We raden aan om eerst checkerboard array studies uit te voeren om veelbelovende combinaties te identificeren en deze vervolgens verder te onderzoeken met time-kill studies. Om te beginnen, maken antimicrobiële voorraad oplossingen van colistine en minocycline, en voer vervolgens kwaliteitscontrole op de voorraad oplossingen zoals beschreven in de begeleidende tekst protocol. Voeg vervolgens ongeveer een milliliter natriumchloride van 0,9% toe, zoute, tot 12-millimeter-bij-75-millimeter ronde bodemglas kweekbuizen.

Selecteer een of twee kolonies uit een nachtplaat van bacteriën, en plaats ze in de cultuur buizen. Vortex de buizen voorzichtig om de bacteriën op te schorten in de oplossing. Controleer de concentratie van bacteriën met behulp van een McFarland lezer.

Pas de concentratie aan door meer zout of meer bacteriën toe te voegen om een 0,5 McFarland troebelheidsmeting te bereiken. Verdun de bacteriën vervolgens één tot 300 door 100 microliter van de suspensie toe te voegen tot 30 milliliter kationaal-aangepast Mueller-Hinton-bouillon in een conische buis van 50 milliliter om een uiteindelijke celdichtheid van vijf keer 10 tot de vijfde kolonievormende eenheden per milliliter te bereiken. Bereid nu de antimicrobiële stoffen voor op afdrukken door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol.

Sla het protocol op en klik linksboven op de knop Uitvoeren, gevolgd door de knop Start. Laad een 384-put plaat in de plaathouder en druk geladen onder de Load Plate 1 Synergy prompt. Plaats vervolgens een T8+-cassette in de cassettesleuf en druk onder de prompt Load a T8+Cassette.

Voeg desgevraagd een oplossing voor de antibioticavoorraad toe aan de aangegeven reservoirs op de cassette. Nadat elke oplossing is toegevoegd, drukt u op de knop Gevuld. Zodra de D300 Dispenser heeft toegevoegd antibioticum voorraad in de juiste volumes aan elke put en de Run Completed vak verschijnt, klik op Sluiten, verwijder de plaat, en schakel de D300.

Giet vervolgens de eerder voorbereide bacteriële suspensie in een steriel reagensreservoir. Gebruik een multichannel pipet om 50 microliters van de suspensie toe te voegen aan alle putten in de checkerboard array. Voeg vervolgens 50 microliter kationen-aangepaste Mueller-Hinton bouillon zonder bacteriën toe aan een lege put.

Dit zal de negatieve controle goed om steriliteit van de media te bevestigen. Incubeer in een 35-graden Celsius omgevingslucht incubator voor 16 tot 20 uur. Om de test te analyseren, volgt u het bijbehorende tekstprotocol.

Voor de time-kill synergie test, opnieuw voor te bereiden op de antimicrobiële voorraad oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak vervolgens een 0.5 McFarland suspensie van het testorganisme in steriele zoutoplossing. Voeg 100 microliter van de 0,5 McFarland-suspensie toe aan vijf milliliter CAMHB in een glazen ronde bodemcultuurbuis van 25 bij 150 millimeter met roestvrijstalen sluiting en vortex voorzichtig te mengen.

Met behulp van een steriele inentingslus, isolatie streep een druppel van de verdunde suspensie op een bloed agar plaat, en de plaat inbroed op 35 graden Celsius in de omgevingslucht om de entmateriaal zuiverheid te bevestigen. Vervang de sluiting op de buis en broed deze in een reageerbuisrek op een shaker bij 35 graden Celsius in de omgevingslucht gedurende ten minste 3 uur, totdat de groei van de logaritmische fase is bereikt. Terwijl de oorspronkelijke cultuur is uitbroeden, voeg 10 milliliter van kation-aangepaste Mueller-Hinton bouillon aan vijf autoclaved glazen cultuur buizen.

Voor een time-kill synergie studie, ten minste een drug moet worden op een concentratie die niet van invloed op de groeicurve individueel. Dit kan worden bepaald door de effecten van individuele medicijnconcentraties voorafgaand aan de synergiestudie te evalueren. Voeg aan de eerste buis 10 microliter van één milligram-per-milliliter colistinevoorraad toe om een definitieve colistineconcentratie van één microgram per milliliter te verkrijgen, omdat dit een concentratie is die niet effectief is tegen de stam die in dit voorbeeld wordt gebruikt.

Voeg voor de tweede buis 10 microliter van één milligram-per-milliliter minocyclinevoorraad toe om een uiteindelijke concentratie van één microgram per milliliter te verkrijgen. Deze concentratie is ook niet effectief tegen de stam die in dit voorbeeld wordt gebruikt. Voeg aan de derde buis 10 microliter van één milligram-per-milliliter minocyclinevoorraad en 10 microliter van één milligram-per-milliliter colistinevoorraad toe.

Dit is dezelfde hoeveelheid colistine en minocycline gebruikt in buizen een en twee. Voeg in de vierde en vijfde buis geen antibiotica toe. Dit zal respectievelijk de groeicontrole en de negatieve controlebuizen zijn.

Bereid vervolgens 96 diep-goed polypropyleen platen met twee milliliter putten voor seriële verdunningen door het toevoegen van 900 microliters van steriele zoutlijn aan rijen B door H van kolommen een tot vier met een multichannel pipet. Wanneer de cultuur zich in de logaritmische groeifase bevindt, verwijder dan de kweekbuis uit de shaker en draaikolk het voorzichtig. Breng een milliliter van de ophanging naar een 12-bij-75-millimeter glazen kweekbuis, en controleer de dichtheid met een McFarland lezer.

Als de dichtheid minder dan 1.0 McFarland is, breng de buis terug naar de shaker en incubaal langer. Als het groter is dan 1.0 McFarland, voeg kation-aangepaste Mueller-Hinton bouillon aan de buis, vortex voorzichtig, en opnieuw monster totdat de schorsing is op 1.0 McFarland. Het is belangrijk dat de cultuur zich in de logaritmische groeifase bevindt bij de voorbereiding van het startenoculum.

U een groeicurve construeren om te bepalen wanneer een organisme deze fase bereikt. Voeg vervolgens 100 microliters van de 1.0 McFarland-ophanging toe aan buizen één tot en met vier en draai ze voorzichtig. Onmiddellijk na het mengen en op een, twee, vier, zes, en 24 uur, verwijder een 150-microliter aliquot uit elke cultuurbuis door het kantelen van de buis, zodat alleen de steriele pipet tip komt in de buis en niet de niet-steriele pipettor schacht tijdens aliquot terugtrekking.

Voeg aliquots, respectievelijk, aan opeenvolgende putten in de eerste rij van de eerder voorbereide 96 deep-well plaat. Breng buizen terug naar een reageerbuisrek op een shaker in een 35-graden Celsius omgevingslucht incubator onmiddellijk na het verwijderen van aliquots op elk moment punt. Verwijder met behulp van een multichannel pipet 100 microliters uit rij A van de plaat en voeg deze toe aan rij B, met 900 microliter zout, waardoor een één-op-10 verdunning ontstaat.

Pipette de oplossing op en neer vier tot vijf keer te mengen, en vervolgens gooi de tips. Ten eerste, label Mueller-Hinton agar platen met de antibiotica voorwaarden en verdunning te verguld. Dan, plaat de verdunde monsters voor kolonie telt met behulp van de druppelplaat methode, met behulp van een multichannel pipet met extra lange tips.

Verwijder 10 microliter uit elke put in kolom een, en zorgvuldig afzien in een rij op de juiste gelabelde plaat. Ga door totdat alle rijen op borden zijn uitgedeeld. Bovendien, op het 24-uurs tijdpunt, plaats een 10-microliter druppel die rechtstreeks uit de negatieve controlebuis op de voor deze plek is geplaatst om te testen op steriliteit.

Dan, omkeren alle platen, en incubeer ze 's nachts op 35 graden Celsius in de omgevingslucht. Tel vervolgens het aantal kolonies op elk gebied en bereken de celdichtheid. Mark kolonies met een fine-tip permanente marker op de achterzijde van de plaat om te voorkomen dat dubbel tellen of ontbrekende kolonies.

Voor elke verdunningsreeks, identificeren druppels met drie tot 30 kolonies. Tel de kolonies in deze druppels, en neem de telling samen met de verdunningsfactor. Hier is een raster van een dambord array synergie experiment waarin minocycline in concentraties van nul tot 32 microgram per milliliter werd gecombineerd met colistine bij concentraties van nul tot 16 microgram per milliliter en getest tegen een stam van E.coli.

Putten met OD600-waarden onder 07 vertegenwoordigen geen groei en zijn rood in de schaduw, terwijl putten met OD600-waarden boven of gelijk aan 07 groei vertegenwoordigen en groen in de schaduw staan. Voor elk medicijn is de minimale remmende concentratie de laagste concentratie van geneesmiddelen die de bacteriële groei remt. Voor minocycline is dit 32 microgram per milliliter, en voor colistine is het acht microgram per milliliter.

De arcering blijft hier behouden, maar waarden binnen de putten waarin de groei wordt geremd worden vervangen door fractionele remmende concentratie, of FIC, indexwaarden. In elke put wordt de FIC-index van elk medicijn berekend door de concentratie antibiotica in die put te delen door de minimale remmende concentratie van het medicijn. Putten met een FIC-index van minder dan of gelijk aan 0,5, die wordt beschouwd als de cutoff voor synergie, worden aangegeven met een gebroken lijn grens, en de put met de laagste FIC-index wordt vett.

Omdat de minimale FIC-waarde zich in het synergetische bereik bevindt, wordt de combinatie als synergetisch beschouwd. Een voorbeeld van een geval dat geen synergie aantoont, wordt hier getoond, aangezien de minimale FIC-index waarbij de groei wordt geremd, er een is, die groter is dan 0,5. Ten slotte, in dit voorbeeld, verschillende overgeslagen putten opgetreden, die bacteriële groei die wordt geremd vertegenwoordigt, ondanks de aanwezigheid van bacteriële groei in aangrenzende putten met hogere concentraties van antibiotica.

Als er meer dan één goed is overgeslagen in een checkerboardarray, moeten de resultaten worden verwijderd en wordt de test herhaald. Een voorbeeld van een grafiek die resultaten van een time-kill synergie test toont, wordt hier gepresenteerd. Zie het bijbehorende tekstprotocol voor meer informatie over de interpretatie van de synergietest van time-kill.

Verdere informatie over de activiteit van synergetische combinaties kan worden verkregen door evaluaties van farmacokinetiek en farmacodynamica en door middel van in vivo studies met diermodellen. Volg altijd de juiste veiligheidsprocedures, inclusief het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, bij het werken met bacteriën. Als u aerosolen genereert of risicovolle ziekteverwekkers gebruikt, voert u al het werk uit in een bioveiligheidskast.