Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Deze methode kan helpen bij het aanpakken van belangrijke uitdagingen op het gebied van kankerimmunotherapie door de ontwikkeling van oncolyctische vectoren voor gerichte immunomodulatie te vergemakkelijken. Het belangrijkste voordeel van het toegepaste omgekeerde genetische systeem is de veelzijdigheid; daarom kunnen vectoren worden aangepast om verschillende onderzoeksvragen aan te pakken en tumoren met diverse immuunhandtekeningen te targeten. De virus voortplanting stappen met name het bepalen van de optimale tijd punt om het oogst virus zijn moeilijk te leren van een tekst protocol, omdat syncytia vorming moet visueel worden beoordeeld na verloop van tijd.

Om te beginnen met het ontwerpen en klonen van recombinante immunomodulatory vectoren zoals beschreven in het manuscript. Dit protocol beschrijft specifieke stappen voor de ontwikkeling van een oncolytische mazelenvaccinvector, die een bispecifieke T-celinschakelaar codeert. Om mazelenvirus te redden van cDNA, 24 uur voor transfectie plaat mazelen virus producent cellen gelijkmatig op een 6 muur plaat.

Zaad 200, 000 cellen in 2 milliliter DMEM met 10 procent FBS per goed tot 65 tot 75 procent samenvloeiing te bereiken op het moment van transfectie. Meng 5 microgram recombinant DNA dat het mazelenvirusantifoom codeert dat zal worden gebruikt om de cellen te transfecteren. Geschikte plasmiden en een fluorescerende verslaggever in een totaal volume van 200 microliters van DMEM.

Voeg 18,6 microliter liposomale transfectiereagens op het mengsel en veeg onmiddellijk met de buis om te mengen. Broed deze transfectiemix gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur. Om de MV producent cellen transfect verwijder het medium uit de 6 goed plaat gegroeid tot 65 tot 75 procent samenvloeiing en voeg 1,8 milliliter DMEM met 2 procent FBS en 50 microgram per milliliter Kanamycine per goed.

Voeg vervolgens de transfectiemix dropwise toe aan elke put en draai voorzichtig. Incubeer de cellen 's nachts op 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide. Op de volgende dag vervang het medium met 2 milliliter verse DMEM met 2 procent FBS en 50 microgram per milliliter Kanamycine en herhaal dit wanneer medium wordt zuur herkend door de gele kleur.

Gebruik een microscoop om cellen dagelijks te observeren voor reporter genexpressie en syncytia vorming. Wanneer grote syncytia bestaande uit 20 of meer cellen zichtbaar zijn of wanneer cellen te dicht worden oogst het virus. 24 uur voor het verwachte oogstzaad ongeveer 1,5 miljoen MV-producentencellen in 12 milliliter DMEM met 10 procent FBS op 10 centimeter schotels om 65 tot 75 procent samenvloeiing te bereiken op het moment van virusinenting.

Om het virus progyny te verzamelen gebruik maken van een cel schraper om zorgvuldig schraap aanhangende producent cellen van de 6 wandplaat met getransfecteerde cellen. Breng het medium met de geschraapte cellen over in een centrifugebuis. Centrifugeren gedurende ten minste 2500 keer G en 4 graden Celsius gedurende 5 minuten om celafval te verwijderen.

Meng na centrifugatie de celvrije supernatant met serumvrij medium tot een eindvolume van 4 milliliter om entmateriaal voor te bereiden. Verwijder het medium uit de schaal van 10 centimeter met MV-producentencellen en voeg het entmateriaal toe aan de cellen. Incubeer voor ten minste 2 uur bij 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide.

Na incubatie voeg 6 milliliter DMEM met 10 procent FBS en incubbaat cellen 's nachts. Vervang vervolgens het medium door 12 milliliter verse DMEM met 10 procent FBS en incubeer bij 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide tot de oogst. Observeer de cellen ten minste tweemaal per dag.

Voordat syncytia barstte wanneer membraanverstoring zichtbaar wordt oogst het virus. Om de eerste passage te oogsten verwijder supernatant van de plaat en voeg 600 microliters serumvrij medium toe. Gebruik vervolgens een cellifter om de cellen te schrapen en over te dragen aan een schone buis.

Onmiddellijk na die bevriezing van het virus suspensie in vloeibare stikstof en op te slaan op 80 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur om een grondige bevriezing te garanderen. Om titers van virusvoorraden in octuplicates per aliquot te bepalen gebruikend 96 muurplaten. Trek eerst de producentcellen uit T75 celkweekkolven in 50 milliliter conische buis.

Tel de cellen en pas de celsuspensie aan tot 150.000 cellen per milliliter in DMEM met 10 procent FBS. Voeg 90 microliter DMEM toe met 10 procent FBS per put van een 96 wandplaat. Voeg vervolgens 10 microliter van een aliquot van het virus voorraad aan alle 8 putten in de eerste kolom van de plaat.

Meng grondig door pipetting op en neer ten minste 10 keer. Gebruik een multichannel pipet om 10 microliter van elke put over te brengen, van de eerste naar de tweede kolom, en meng grondig door op en neer te pipezen. Herhaal dit voor elke kolom om seriële tienvoudige verdunningen van het virus te verkrijgen met behulp van verse pipettips voor elke verdunningsstap.

Gooi 10 microliter uit elke put van de laatste kolom. Voeg 100 microliter celsuspensie met 150.000 cellen per milliliter toe aan elke put om er zeker van te zijn dat er geen celklontjes zijn. Incubeer bij 37 graden Celsius, 5 procent kooldioxide gedurende 48 uur.

Controleer op syncytia met behulp van een lichtmicroscoop. Tel syncytia in elke put van de kolom met de hoogste verdunningsfactor die zichtbare syncytia bevat. Voor virussen die een fluorescerende reporter coderen, kan syncytia worden geteld met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Voor analyse van mazelenvirus replicatie kinetiek een dag voorafgaand aan infectie zaad 100,000 vero cellen in 1 milliliter van DMEM met 10 procent FBS per goed op 12 wandplaten met ten minste 2 putten voor elke keer punt van belang. Om de cellen te infecteren vervang het medium door 300 microliters van serumvrij medium dat de respectieve hoeveelheid van het virus bevat. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide gedurende ten minste 2 uur.

Verwijder inoculum en voeg 1 milliliter DMEM toe met 10 procent FBS en zet incubatie voort. Op relevante tijd punten na infectie oogst virale progynie door direct schrapen cellen in het medium. Breng de inhoud van elke put over naar een individuele buis.

Snap bevriezen in vloeibare stikstof en op te slaan op 80 graden Celsius tot titratie en ga dan verder zoals beschreven in het manuscript. Om te beginnen met de evaluatie van BTE geïnduceerde cel gemedieerde cytotoxiciteit door LDH release, eerst isoleren van afgescheiden transgene producten uitgedrukt door virus geïnfecteerde doelcellen en isoleren immuuneffector cellen zoals beschreven in het manuscript. Dan zaad doelcellen in een U-bodem 96 wandplaat en omvatten monsters zoals beschreven in het manuscript.

Voeg eerder geïsoleerde immunomodulatoren bij gewenste concentraties toe aan de respectievelijke monsters. Voeg immuun overloper cellen op de gewenste verhoudingen en voeg medium tot een totaal volume van 100 microliter per goed. Incubeer voor de gewenste eerder bepaalde termijnen bij 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide.

Voeg 45 minuten voor monsterverzameling 10 microliters 10x Lysis-oplossing toe aan putten met T max-monsters en de bijbehorende medium-controles en zet de incubatie voort. Centrifugeren de cellen op 250 keer G gedurende 4 minuten. Breng 50 microliter supernatant van elke put naar putten van een platte bodem 96 wandplaat ervoor te zorgen dat de cellen niet over te dragen.

Na het bereiden van substraatoplossing volgens de fabrikant voeg 50 microliters aan elke put. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten of totdat T max monsters dieprood worden. Na incubatie voeg 50 microliters van stop oplossing aan elke put.

Centrifugeren gedurende 1 minuut bij 4000 keer G en gebruik vervolgens een uitgeholde naald om luchtbellen te verwijderen. Meet optische absorptie op 490 nanometer en bereken zoals beschreven in het manuscript. Na inenting met ongewijzigde en BTE codering oncolytische mazelen virussen groeicurven van de vergeleken vectoren op vero cellen lijken vergelijkbaar.

Cel levensvatbaarheid bochten op mc38 murine colorectale carcinoom cellen stabiel uitdrukken van menselijke carcinoembryonic antigeen en de MV receptoren CD46 na inenting blijkt dat lytische activiteit van de transgene codering virus achterblijft in de murine tumor cellijn. Flow cytometrie van doelantigeen uitdrukken cellen geïncubeerd met BTE's op vijf verschillende verdunningen toonde BTE binding door cellen in een concentratie afhankelijke manier. In immunoblot na magnetische pull down van BTE-geassocieerde cellen bleek dat wanneer niet-gericht BTE's werden gebruikt, er geen detecteerbare hoeveelheden cellen waren;overwegende dat bij het richten van BTE-monsters gebonden cellen in de elutiefractie aanwezig waren.

BTE bemiddelde doelantigeen specifieke en concentratieafhankelijke cytotoxiciteit van murine T cellen wordt aangegeven door representatieve LDH release test en toont aan dat in het huidige voorbeeld 15 procent specifieke celdoden werd bereikt bij een relatief hoge BTE-concentratie van 1 microgram per milliliter in vergelijking met referentiecellen. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om regelmatig cellen te controleren om de progressie van infectie te controleren. Vergeet niet dat recombinant mazelen vaccin stammen hoewel verzwakt kan gevaarlijk zijn vooral voor immuunonderdrukte individuen.

Vermijd blootstelling door het volgen van de juiste bioveiligheidsprocedures. Personen die met virussen omgaan, moeten worden gevaccineerd voordat ze deze methoden uitvoeren. Na deze procedure virale expressie van verdere transgens kan worden bereikt om virus hosts interacties en therapeutische effecten te analyseren.

De ontwikkeling van deze technieken heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van biotherapie om de effecten van lokaal uitgedrukte immunomodulatoren in tal van tumorachtige entiteiten te onderzoeken;In Vitro, In Vivo, en ook in klinische studies.