Name: Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Leer oncolytische mazelenvirusvectoren genereren voor tumorgerichte immunomodulatie met bispecifieke T-cel-engagers. Dit protocol versnelt de ontwikkeling van veelzijdige immunovirotherapieën voor kankerbehandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze methoden werden opgericht in de een groep geleid door Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts aan het National Center for Tumor ziekten in Heidelberg. We zijn dank verschuldigd aan hem en alle leden van het team van het laboratorium, met name Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler, en Jessica Albert. Dit werk werd gesteund door de anders Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 aan C.E. Engeland) en de Duitse National Science Foundation (DFG, nl 1119/2-1 toekennen C.E. Engeland). J.P.W. Heidbuechel ontvangt een toelage van de Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

C.E. Engeland wordt vermeld als mede-uitvinder van een octrooi met betrekking tot RNA virussen voor kanker Immunovirotherapy eigendom van de Universiteit van Heidelberg. J.P.W. Heidbuechel heeft niets te onthullen.

Oncolytische immunotherapie (dwz., Overurentar in combinatie met immunomodulatie) houdt grote belofte voor de behandeling van kanker, veeleisende verdere ontwikkeling en optimalisatie van oncolytische virussen codering immunomodulerende eiwitten. Dit protocol wordt beschreven methoden om te genereren en valideren van dergelijke vectoren voor het daaropvolgende testen in relevante preklinische modellen en potentiële toekomstige klinische traduction roman anti-kanker therapieën.
Talrijk...

Oncolytische virussen (OVs) worden ontwikkeld als anti-kanker therapieën die specifiek repliceren binnen en doden tumorcellen terwijl gezonde weefsels intact blijven. Het is inmiddels gemeenschappelijk begrip dat oncolytische een (Overurentar), in de meeste gevallen, niet afhankelijk is van de lysis van de volledige tumor uitsluitend door efficiënte replicatie en verspreiding van het virus, maar vergt extra mechanismen van actie voor de behandeling succes, met inbegrip van vasculaire en stromale targeting en, belangrijker, immuun stimulatie1,,2,,3,4. Terwijl vele vroege OV studies ongewijzigde virussen gebruikt, heeft huidige onderzoek geprofiteerd van een verbeterde biologische begrip, virus biobanken die potentieel bevatten roman OVs, en de mogelijkheden aangeboden door genetische manipulatie om te maken van geavanceerde OV platformen5,6,7.
Gezien het recente succes van immunotherapie, zijn immunomodulerende transgenen van bijzonder belang met betrekking tot de genetische modificatie van OVs. Gerichte uitdrukking van dergelijke genproducten door OV-geïnfecteerde tumorcellen vermindert toxiciteit in vergelijking met systemische toediening. Gericht op wordt bereikt met behulp van virussen met inherente oncoselectivity of door aanpassing van virale tropisme8. Lokale immunomodulatie verbetert de veelzijdige anti-tumor mechanismen van Overurentar. Bovendien is deze strategie instrumenteel in het ondervragen van de wisselwerking tussen virussen, tumorcellen, en het immuunsysteem van de gastheer. Dit protocol biedt daartoe een toepasselijke en instelbare workflow te ontwerpen, kloon, redden, propageren, en valideren van oncolytische paramyxovirus (specifiek Mazelenvirus) vectoren codering van dergelijke transgenen.
Modulatie van de immuunrespons kan worden bereikt door een breed scala aan transgenic producten gericht op de verschillende stappen van de kanker-immuniteit cyclus9, waaronder verbetering van de tumor antigeen erkenning [bv. tumor-geassocieerde antigenen (TAAs) of inductoren van grote histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen] over ondersteuning van dendritische cel rijping voor efficiënte antigeen presentatie (cytokines); werven en activeren van gewenste immune cellen zoals cytotoxische en helper T cellen [chemokines, bispecifieke T cel engagers (BTEs)]; gericht op onderdrukkende cellen zoals regulatoire T-cellen, suppressor myeloïde-afgeleide cellen, tumor-geassocieerde macrofagen en fibroblasten kanker-geassocieerde (antilichamen, BTEs, cytokines); en het voorkomen van effector cel inhibitie en uitputting (checkpoint-remmers). Een overvloed aan biologische agentia is dus beschikbaar. Evaluatie van dergelijke immunomodulators virus-gecodeerd met betrekking tot de therapeutische werking en mogelijke synergie, evenals het begrip van de respectieve mechanismen is nodig ter verbetering van kankertherapie.
Negatieve zin single-stranded RNA virussen uit de familie van de Paramyxoviridae worden gekenmerkt door verschillende functies dat bevorderlijk is voor hun gebruik als oncolytische vectoren. Het gaat hierbij om een natuurlijke oncotropism, grote genomic capaciteit voor transgenen (meer dan 5 kb)10,11, efficiënte verspreiding met inbegrip van de vorming van syncytia en hoge immunogeniciteit12. Daarom OV platformen op basis van canine distemper virus13, bof virus14, Newcastle disease virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518en Tupaia paramyxovirus19 zijn ontwikkeld. Meest prominent, levende verzwakte mazelen virus vaccin stammen (MV) vorderingen preklinische en klinische ontwikkeling20,21 gemaakt hebben. Deze virusstammen zijn gebruikt voor decennia voor routinematige immunisatie met een uitstekende veiligheid record22. Bovendien is er geen risico voor dat mutagenese als gevolg van de strikt cytosolische replicatie van paramyxovirussen. Een veelzijdige omgekeerde genetica-systeem op basis van anti-genomic cDNA dat voorziet in de invoeging van transgenen in extra transcriptie eenheden (ATUs) is beschikbaar11,23,24. MV vectoren Natriumjodide symporter (MV-NOS) codering voor beeldvorming en radiotherapie of oplosbare carcino antigeen (MV-CEA) als een surrogaat marker voor virale genexpressie zijn momenteel geëvalueerd in klinische proeven (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 en NCT00408590). Veilige beheer is bevestigd en gevallen van anti-tumor werkzaamheid hebben gemeld in vorige studies25,26,27,28,29, 30 (herzien door Msaouel et al.31), de weg vrijmaakt voor extra oncolytische mazelen virussen die zijn ontwikkeld en getest preclinically. MV immunomodulerende moleculen gericht op de verschillende stappen van de cyclus voor kanker-immuniteit is aangetoond dat de vertraging van de tumorgroei en/of verlengen van overleven in muizen, met bewijs voor immuun-gemedieerde werkzaamheid en lange-termijn beschermende immuun geheugen in syngeneic codering Muismodellen. Vector-gecodeerde transgenen omvatten granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF)32,33, H. pylori neutrofiele-activeren eiwit34, immuun checkpoint remmers35, interleukine-12 (IL-12)36, TAAs37BTEs38, die een tumor cross-link oppervlakte-antigeen met CD3 en dus induceren anti-tumor activiteit door polyklonale T-cellen, ongeacht de T cel receptor specificiteit en co-stimulatie ( Figuur 1). De veelbelovende preklinische resultaten voor deze constructies vraag verder translationeel inspanningen.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), een type ik herpes simplexvirus GM-CSF, codering is de enige oncolytische therapeutische goedgekeurd door de Amerikaanse Food en Drug Administration (FDA) and Europese geneesmiddelen Agentschap (EMA). De fase III studie leidt tot goedkeuringen in eind 2015 heeft alleen geen werkzaamheid op de site van intra-tumoral injectie, maar ook abscopal effecten (dwz, remissies van niet-geïnjecteerde laesies) in geavanceerde melanoom39getoond. T-VEC gekomen sindsdien bijkomende proeven voor toepassing in andere entiteiten van de tumor (bijvoorbeeld, niet-melanoom huidkanker, NCT03458117, alvleesklierkanker, NCT03086642) en voor de evaluatie van combinatie therapieën, vooral met immuun checkpoint remmers (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 en Ribas et al.40).
Hieruit blijkt dat niet alleen het potentieel van oncolytische immunotherapie, maar ook de noodzaak van verder onderzoek om te identificeren van superieure combinaties van Overurentar en immunomodulatie. Rationeel ontwerp van aanvullende vectoren en hun ontwikkeling voor preklinische testen is de sleutel tot deze onderneming. Dit zal ook verder inzicht in de onderliggende mechanismen en gevolgen heeft voor de progressie naar meer gepersonaliseerde behandeling van kanker. Te dien einde presenteert deze publicatie de methodologie voor de wijziging en de ontwikkeling van paramyxovirussen voor gerichte kanker immunotherapie en, meer in het bijzonder, oncolytische mazelen virussen codering van T-cel-boeiende antilichamen (Figuur 2).

<table><tbody><tr><td>Rapid DNA Dephos &amp; Ligation Kit</td><td>Roche Life Science, Mannheim, Duitsland</td><td>4898117001</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET PCR Cloning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>K1231</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN, Hilden, Duitsland</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>NEB 10-beta Competent E. coli</td><td>New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Duitsland</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>LB medium naar Lennox</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland</td><td>X964.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Miniprep Kit</td><td>QIAGEN, Hilden, Duitsland</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Restrictienezym HindIII-HF</td><td>New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Duitsland</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen, Darmstadt, Duitsland</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Biosera, Boussens, Frankrijk</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Promega, Mannheim, Duitsland</td><td>E2311</td><td>kan worden vervangen door een transfectiereagens naar keuze</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland</td><td>K0129</td><td></td></tr><tr><td>Vero cellen</td><td>ATCC, Manassas, VA, VS</td><td>CCL81</td><td></td></tr><tr><td>B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td><td>J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td><td></td><td>beschikbaar op aanvraag</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ, Braunschweig, Duitsland</td><td>ACC 342</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (serumvrij medium)</td><td>Gibco Life Technologies, Darmstadt, Duitsland</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Colorimetrische Celviabiliteitskit III (XTT)</td><td>PromoKine, Heidelberg, Duitsland</td><td>PK-CA20-300-1000</td><td>bevat XTT-reagens</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco Life Technologies, Darmstadt, Duitsland</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td><td>QIAGEN, Hilden, Duitsland</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membraan, 10&nbsp;kDa</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>BCA-eiwit-assaykit</td><td>Merck Milipore</td><td>71285-3</td><td></td></tr><tr><td>IgG uit humaan serum</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-PE</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-092-257</td><td>RRID: AB_871939</td></tr><tr><td>Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrine geconjugeerd, Clone MOPC-21-antilichaam</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland</td><td>555749</td><td>RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>Anti-HA-biotine antilichaam, clone 3F10</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland</td><td>12158167001</td><td>RRID: AB_390915</td></tr><tr><td>Anti-biotine MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>MS-kolommen</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>RIPA-buffer</td><td>Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, VS</td><td>MB-030-0050</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td><td>Promega, Mannheim, Duitsland</td><td>G1780</td><td>bevat 10x lysisoplossing, substraatoplossing (substraatmix en assaybuffer) en stopoplossing</td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning, Reynosa, Mexico</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>10 cm schalen</td><td>Corning, Oneonta, NY, VS</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 cm schalen</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Duitsland</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>96-wells platen, U-bodem</td><td>TPP, Trasadingen, Zwitserland</td><td>92097</td><td></td></tr><tr><td>96-wells platen, platte bodem</td><td>Neolab, Heidelberg, Duitsland</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>6-wells platen</td><td>Neolab, Heidelberg, Duitsland</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-wells platen</td><td>Neolab, Heidelberg, Duitsland</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>50 mL buisjes</td><td>nerbe plus, Winsen/Luhe, Duitsland</td><td>02-572-3001</td><td></td></tr><tr><td>T175 celcultuurkolven</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m filters</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

paramyxovirussen voor tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie ex vivo

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Succesvolle kanker immunotherapie heeft het potentieel om op lange termijn tumor controle. Ondanks recente klinische successen blijft er een dringende behoefte aan veilige en effectieve therapieën die zijn toegesneden op individuele tumor immuun profielen. Oncolytische virussen kunnen de inductie van anti-tumor immuunresponsen evenals tumor-beperkte genexpressie. Dit protocol beschrijft de generatie en ex vivo analyse van immunomodulerende oncolytische vectoren. Focussen op mazelen vaccin virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld, kan de algemene methodologie worden aangepast aan andere soorten van het virus en de transgenen. De gepresenteerde workflow omvat het ontwerp, klonen, redding en verspreiding van recombinante virussen. Testen om replicatie kinetiek en lytische activiteit van de vector en de functionaliteit van de geïsoleerde immunomodulator ex vivo te analyseren zijn opgenomen, waardoor de generatie van nieuwe agenten voor de verdere ontwikkeling in preklinische modellen en uiteindelijk klinische vertaling.

Figuur 1 illustreert het werkingsmechanisme van oncolytische mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering. Een stroomdiagram beeltenis van de workflow van dit protocol wordt weergegeven in Figuur 2. Figuur 3 toont een voorbeeld van een gewijzigde oncolytische mazelen virusgenoom. Dit biedt een visuele weergave van de specifieke wijzigingen toegepast op de mazelen virus anti...

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Deze methode kan helpen bij het aanpakken van belangrijke uitdagingen op het gebied van kankerimmunotherapie door de ontwikkeling van oncolyctische vectoren voor gerichte immunomodulatie te vergemakkelijken. Het belangrijkste voordeel van het toegepaste omgekeerde genetische systeem is de veelzijdigheid; daarom kunnen vectoren worden aangepast om verschillende onderzoeksvragen aan te pakken en tumoren met diverse immuunhandtekeningen te targeten. De virus voortplanting stappen met name het bepalen van de optimale tijd punt om het oogst virus zijn moeilijk te leren van een tekst protocol, omdat syncytia vorming moet visueel worden beoordeeld na verloop van tijd.Om te beginnen met het ontwerpen en klonen van recombinante immunomodulatory vectoren zoals beschreven in het manuscript. Dit protocol beschrijft specifieke stappen voor de ontwikkeling van een oncolytische mazelenvaccinvector, die een bispecifieke T-celinschakelaar codeert. Om mazelenvirus te redden van cDNA, 24 uur voor transfectie plaat mazelen virus producent cellen gelijkmatig op een 6 muur plaat.Zaad 200, 000 cellen in 2 milliliter DMEM met 10 procent FBS per goed tot 65 tot 75 procent samenvloeiing te bereiken op het moment van transfectie. Meng 5 microgram recombinant DNA dat het mazelenvirusantifoom codeert dat zal worden gebruikt om de cellen te transfecteren. Geschikte plasmiden en een fluorescerende verslaggever in een totaal volume van 200 microliters van DMEM.Voeg 18,6 microliter liposomale transfectiereagens op het mengsel en veeg onmiddellijk met de buis om te mengen. Broed deze transfectiemix gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur. Om de MV producent cellen transfect verwijder het medium uit de 6 goed plaat gegroeid tot 65 tot 75 procent samenvloeiing en voeg 1,8 milliliter DMEM met 2 procent FBS en 50 microgram per milliliter Kanamycine per goed.Voeg vervolgens de transfectiemix dropwise toe aan elke put en draai voorzichtig. Incubeer de cellen 's nachts op 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide. Op de volgende dag vervang het medium met 2 milliliter verse DMEM met 2 procent FBS en 50 microgram per milliliter Kanamycine en herhaal dit wanneer medium wordt zuur herkend door de gele kleur.Gebruik een microscoop om cellen dagelijks te observeren voor reporter genexpressie en syncytia vorming. Wanneer grote syncytia bestaande uit 20 of meer cellen zichtbaar zijn of wanneer cellen te dicht worden oogst het virus. 24 uur voor het verwachte oogstzaad ongeveer 1,5 miljoen MV-producentencellen in 12 milliliter DMEM met 10 procent FBS op 10 centimeter schotels om 65 tot 75 procent samenvloeiing te bereiken op het moment van virusinenting.Om het virus progyny te verzamelen gebruik maken van een cel schraper om zorgvuldig schraap aanhangende producent cellen van de 6 wandplaat met getransfecteerde cellen. Breng het medium met de geschraapte cellen over in een centrifugebuis. Centrifugeren gedurende ten minste 2500 keer G en 4 graden Celsius gedurende 5 minuten om celafval te verwijderen.Meng na centrifugatie de celvrije supernatant met serumvrij medium tot een eindvolume van 4 milliliter om entmateriaal voor te bereiden. Verwijder het medium uit de schaal van 10 centimeter met MV-producentencellen en voeg het entmateriaal toe aan de cellen. Incubeer voor ten minste 2 uur bij 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide.Na incubatie voeg 6 milliliter DMEM met 10 procent FBS en incubbaat cellen 's nachts. Vervang vervolgens het medium door 12 milliliter verse DMEM met 10 procent FBS en incubeer bij 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide tot de oogst. Observeer de cellen ten minste tweemaal per dag.Voordat syncytia barstte wanneer membraanverstoring zichtbaar wordt oogst het virus. Om de eerste passage te oogsten verwijder supernatant van de plaat en voeg 600 microliters serumvrij medium toe. Gebruik vervolgens een cellifter om de cellen te schrapen en over te dragen aan een schone buis.Onmiddellijk na die bevriezing van het virus suspensie in vloeibare stikstof en op te slaan op 80 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur om een grondige bevriezing te garanderen. Om titers van virusvoorraden in octuplicates per aliquot te bepalen gebruikend 96 muurplaten. Trek eerst de producentcellen uit T75 celkweekkolven in 50 milliliter conische buis.Tel de cellen en pas de celsuspensie aan tot 150.000 cellen per milliliter in DMEM met 10 procent FBS. Voeg 90 microliter DMEM toe met 10 procent FBS per put van een 96 wandplaat. Voeg vervolgens 10 microliter van een aliquot van het virus voorraad aan alle 8 putten in de eerste kolom van de plaat.Meng grondig door pipetting op en neer ten minste 10 keer. Gebruik een multichannel pipet om 10 microliter van elke put over te brengen, van de eerste naar de tweede kolom, en meng grondig door op en neer te pipezen. Herhaal dit voor elke kolom om seriële tienvoudige verdunningen van het virus te verkrijgen met behulp van verse pipettips voor elke verdunningsstap.Gooi 10 microliter uit elke put van de laatste kolom. Voeg 100 microliter celsuspensie met 150.000 cellen per milliliter toe aan elke put om er zeker van te zijn dat er geen celklontjes zijn. Incubeer bij 37 graden Celsius, 5 procent kooldioxide gedurende 48 uur.Controleer op syncytia met behulp van een lichtmicroscoop. Tel syncytia in elke put van de kolom met de hoogste verdunningsfactor die zichtbare syncytia bevat. Voor virussen die een fluorescerende reporter coderen, kan syncytia worden geteld met behulp van fluorescentiemicroscopie.Voor analyse van mazelenvirus replicatie kinetiek een dag voorafgaand aan infectie zaad 100,000 vero cellen in 1 milliliter van DMEM met 10 procent FBS per goed op 12 wandplaten met ten minste 2 putten voor elke keer punt van belang. Om de cellen te infecteren vervang het medium door 300 microliters van serumvrij medium dat de respectieve hoeveelheid van het virus bevat. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide gedurende ten minste 2 uur.Verwijder inoculum en voeg 1 milliliter DMEM toe met 10 procent FBS en zet incubatie voort. Op relevante tijd punten na infectie oogst virale progynie door direct schrapen cellen in het medium. Breng de inhoud van elke put over naar een individuele buis.Snap bevriezen in vloeibare stikstof en op te slaan op 80 graden Celsius tot titratie en ga dan verder zoals beschreven in het manuscript. Om te beginnen met de evaluatie van BTE geïnduceerde cel gemedieerde cytotoxiciteit door LDH release, eerst isoleren van afgescheiden transgene producten uitgedrukt door virus geïnfecteerde doelcellen en isoleren immuuneffector cellen zoals beschreven in het manuscript. Dan zaad doelcellen in een U-bodem 96 wandplaat en omvatten monsters zoals beschreven in het manuscript.Voeg eerder geïsoleerde immunomodulatoren bij gewenste concentraties toe aan de respectievelijke monsters. Voeg immuun overloper cellen op de gewenste verhoudingen en voeg medium tot een totaal volume van 100 microliter per goed. Incubeer voor de gewenste eerder bepaalde termijnen bij 37 graden Celsius en 5 procent kooldioxide.Voeg 45 minuten voor monsterverzameling 10 microliters 10x Lysis-oplossing toe aan putten met T max-monsters en de bijbehorende medium-controles en zet de incubatie voort. Centrifugeren de cellen op 250 keer G gedurende 4 minuten. Breng 50 microliter supernatant van elke put naar putten van een platte bodem 96 wandplaat ervoor te zorgen dat de cellen niet over te dragen.Na het bereiden van substraatoplossing volgens de fabrikant voeg 50 microliters aan elke put. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten of totdat T max monsters dieprood worden. Na incubatie voeg 50 microliters van stop oplossing aan elke put.Centrifugeren gedurende 1 minuut bij 4000 keer G en gebruik vervolgens een uitgeholde naald om luchtbellen te verwijderen. Meet optische absorptie op 490 nanometer en bereken zoals beschreven in het manuscript. Na inenting met ongewijzigde en BTE codering oncolytische mazelen virussen groeicurven van de vergeleken vectoren op vero cellen lijken vergelijkbaar.Cel levensvatbaarheid bochten op mc38 murine colorectale carcinoom cellen stabiel uitdrukken van menselijke carcinoembryonic antigeen en de MV receptoren CD46 na inenting blijkt dat lytische activiteit van de transgene codering virus achterblijft in de murine tumor cellijn. Flow cytometrie van doelantigeen uitdrukken cellen geïncubeerd met BTE's op vijf verschillende verdunningen toonde BTE binding door cellen in een concentratie afhankelijke manier. In immunoblot na magnetische pull down van BTE-geassocieerde cellen bleek dat wanneer niet-gericht BTE's werden gebruikt, er geen detecteerbare hoeveelheden cellen waren;overwegende dat bij het richten van BTE-monsters gebonden cellen in de elutiefractie aanwezig waren.BTE bemiddelde doelantigeen specifieke en concentratieafhankelijke cytotoxiciteit van murine T cellen wordt aangegeven door representatieve LDH release test en toont aan dat in het huidige voorbeeld 15 procent specifieke celdoden werd bereikt bij een relatief hoge BTE-concentratie van 1 microgram per milliliter in vergelijking met referentiecellen. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om regelmatig cellen te controleren om de progressie van infectie te controleren. Vergeet niet dat recombinant mazelen vaccin stammen hoewel verzwakt kan gevaarlijk zijn vooral voor immuunonderdrukte individuen.Vermijd blootstelling door het volgen van de juiste bioveiligheidsprocedures. Personen die met virussen omgaan, moeten worden gevaccineerd voordat ze deze methoden uitvoeren. Na deze procedure virale expressie van verdere transgens kan worden bereikt om virus hosts interacties en therapeutische effecten te analyseren.De ontwikkeling van deze technieken heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van biotherapie om de effecten van lokaal uitgedrukte immunomodulatoren in tal van tumorachtige entiteiten te onderzoeken;In Vitro, In Vivo, en ook in klinische studies.

paramyxoviruses-for-tumor-targeted-immunomodulation-design-evaluation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Ex vivo Uitbreiding van Tumor-reactieve T-cellen door middel van Bryostatin 1/Ionomycin en de Gemeenschappelijke Gamma Chain Cytokines Formulering

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

This video demonstrates a cell-based tumor vaccination assay. A mouse, intradermally injected with B16-F10 melanoma cells for tumor formation, is vaccinated with B16-F10 cells secreting Flt3L cytokine near the developed tumor. The secreted Flt3L from the vaccine promotes the maturation and proliferation of dendritic cells that then present tumor antigens to T cells in lymph nodes, triggering a targeted anti-tumor immune response.

Tumor Implantation and Injection of a Tumor Vaccine in a Mouse Model

Viral afkomstige peptiden gekoppeld aan antilichaam-geconjugeerde (ACs) is een aanpak die wint dynamiek als gevolg van het potentieel van het leveren van moleculaire payloads met verhoogde tumor cel accumulatie. Gebruik makend van gemeenschappelijke methoden voor evaluatie van peptide conjugatie, AC en lading intracellulaire accumulatie en tumor gericht op, helpt dit protocol onderzoekers tijdens de cruciale eerste ontwikkelingsfasen.

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV's afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV's, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.

In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Leer oncolytische mazelenvirusvectoren genereren voor tumorgerichte immunomodulatie met bispecifieke T-cel-engagers. Dit protocol versnelt de ontwikkeling van veelzijdige immunovirotherapieën voor kankerbehandeling.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Meer video's verkennen