Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit is het eerste papier dat technische problemen aanpakt bij het sequencing van kleine RNAs afgeleid van extracellulaire vikjes uit cellen. NGS-monsters vereisen een strenge voorbereiding en kwaliteitscontrole. Door de aard van EV's wijkt het QC-proces van EV-monsters af van de norm.

Het voordeel van dit protocol is de QC stappen daarin voor nieuwe gebruikers. Het aantonen van de procedure zal Junyi Su zijn, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium. Om te beginnen, plaat menselijke mesenchymale stamcellen op 2.000 cellen per vierkante centimeter in verse MSC media in vijf T175 kolven.

Dan groeien de cellen op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide milieu en vervang de media om de twee tot drie dagen, tot vijf kolven van 90% confluent cellen worden verkregen. Was vervolgens de cellen drie keer met 20 milliliter PBS per kolf. Voeg 20 milliliter EV-collectiemedia toe in elke kolf.

En broed ze uit bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide milieu gedurende 48 uur. Verzamel de media en centrifuge het gedurende 10 minuten op 300 g en vier graden Celsius. Verzamel dan de supernatant, en centrifuge de media gedurende 20 minuten op 2,000 g en vier graden Celsius.

Verzamel de supernatant weer, en centrifuge de media gedurende 30 minuten op 15, 500 g en vier graden Celsius. Verzamel de supernatant voor de laatste keer. Breng vervolgens de media over naar ultracentrifugebuizen.

Hier wordt een 60Ti vaste hoekrotor gebruikt en de pellet wordt aan de zijkant van de buis verankerd. Markeer de zijkant van het deksel waar de pellet wordt verwacht, en teken een cirkel aan de zijkant van de buis waar de pellet wordt verwacht. En pellet de exRNAs gedurende 90 minuten op 100, 000 g en vier graden Celsius.

Verwijder na de laatste centrifugatie de supernatant. Gebruik kleine stukjes absorberend papier om de binnenkant van de buis te drogen zonder de onderkant van de buis aan te raken. En dan de buis omkeren op een absorberend papier.

Om de pellet opnieuw te plaatsen, voeg 200 microliter PBS in elke buis, en vortex de buis voor 30 seconden. Pipet 20 keer op en neer. Beoordeel vervolgens de extracellulaire vesicles en andere biomoleculen met nanodeeltjes tracking analyse.

En bewaar de pellet op min-80 graden Celsius tot verdere experimenten. Gebruik na het ontdooien van de monsters een RNA-isolatiekit om RNA volgens het protocol van de fabrikant te extraheren. Elute het RNA uit de kolom in de RNA isolatie kit in 100 microliters van RNAse-vrij water.

Om het RNA te concentreren door middel van ethanol neerslag, voeg een microliter van glycogeen, 10 microliter van twee-molaire pH-5.5 natriumacetaat, en 250 microliter van voorgekoelde 99%-ethanol in 100 microliter van het gezuiverde RNA. Vervolgens incubeer de monsters bij min-20 graden Celsius 's nachts om het RNA neer te halen. Om het RNA te pelleteren, centrifuge gedurende 20 minuten op 16, 000 g en vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens de supernatant en was de RNA-pellet met één milliliter ethanol van 75%. Centrifuge opnieuw gedurende vijf minuten op 16, 000 g en vier graden Celsius om het RNA te pelleteren. Verwijder de ethanol en laat het deksel van de RNA-buis vijf tot tien minuten open om de RNA-pellet aan de lucht te drogen.

Resuspend de RNA pellet in zeven microliters van RNAse-vrij water, en gebruik een chip-gebaseerde capillaire elektroforese machine om de RNA kwaliteit en concentratie te detecteren. Om te beginnen met de bibliotheek bouw, pipet vijf microliters van het RNA in een voorgekoelde 0,2-milliliter PCR buis. Verdun vervolgens 3'adapters in RNAse-vrij water met een volumeverhouding van één tot 10.

Voeg 0,5 microliter van de verdunde adapter toe aan de RNA-buis en pipet het mengsel acht keer op en neer. Centrifuge kort om alle vloeistof aan de onderkant van de buis te verzamelen. Incubeer het RNA-adaptermengsel twee minuten lang in een voorverwarmde thermische cycler bij 70 graden Celsius.

En plaats het monster dan terug op het gekoelde blok. Voeg vervolgens een microliter van de ligatiebuffer, 0,5 microliter RNAse-remmer en 0,5 microliter van de T4 RNA-ligase toe aan het RNA-adaptermengsel. Pipet op en neer acht keer, en centrifuge kort.

Dan incubeer de buis op 28 graden Celsius gedurende een uur in de voorverwarmde thermische cycler. Voeg vervolgens 0,5 microliter van de stopoplossing toe aan de monsterbuis, waarbij de buis in de thermische cycler blijft. Pipet op en neer acht keer, en blijven uitbroeden op 28 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Verdun 5'adapters in RNAse-vrij water met een volumeverhouding van één tot 10. Voeg 0,5 microliter van de verdunde adapter toe in een aparte PCR-buis van 0,2 milliliter. Verwarm de 5'adapter op 70 graden Celsius gedurende twee minuten.

En plaats het monster dan op het gekoelde blok. Voeg 0,5 microliter ATP en 0,5 microliter van de T4 RNA-ligase toe aan de 5-adapterbuis. Pipet acht keer op en neer.

En centrifuge kort om alle vloeistoffen te verzamelen in de bodem. Voeg vervolgens 1,5 microliter van het mengsel van 5'adapter toe aan het RNA-monster. Pipette acht keer heel voorzichtig, en incubeer het monster op 28 graden Celsius gedurende een uur.

Om cDNA te verkrijgen, verdun de omgekeerde transcriptase primer in RNAse-vrij water met een één-op-10 volumeverhouding. Voeg 0,5 microliter van de verdunde primer toe aan het RNA-monster, pipet acht keer heel voorzichtig en centrifuge kort. Vervolgens incubeer het RNA en het primermengsel op 70 graden Celsius gedurende twee minuten in de voorverwarmde thermische cycler.

En plaats het monster dan op een gekoeld blok. Voeg vervolgens een microliter 5x First Strand Buffer, 0,5 microliter van 12,5-millimolar DNTP-mengsel, 0,5 microliter van 100-millimolar DTT, 0,5 microliter RNAse-remmer en 0,5 microliter omgekeerde transcriptase in de monsterbuis toe. Pipet acht keer heel voorzichtig.

En even centrifugeren. Incubeer het monster op 50 graden Celsius gedurende een uur in de voorverwarmde thermische cycler. Voeg vervolgens 4,25 microliter ultrazuiver water, 12,5 microliter van de PCR-mix, een microliter van de indexprimer en een microliter van de universele primer toe aan het cDNA-monster.

Pipet op en neer acht keer, en centrifuge kort. Ten slotte, plaats het monster in een thermische cycler, en het opzetten van de cycler volgens het manuscript. Om de RNA-bibliotheek te zuiveren, gebruikt u een geautomatiseerde DNA-groottefraseator om de banden tussen 140 en 160 basisparen te ontlasten.

Voer de uitgepakte bibliotheek uit op een pcr-zuiveringskit op basis van kolommen en maak de bibliotheek in 10 microliter RNAse-vrij water. Om de grootte van de bibliotheek te controleren, laadt u een microliter van de gezuiverde bibliotheek op een DNA-chip en volgt u het protocol van de fabrikant. Om de bibliotheekconcentratie te kwantificeren, verdun je eerst één microliter van de gezuiverde bibliotheek in 10-millimolar pH-8.0 Tris-Hcl met 0,05%polysorbate 20 bij een volumeverhouding van één tot 1, 000.

Voer vervolgens QPCR uit met behulp van de DNA-normen van de commerciële bibliotheekkwantificeringskit. Tot slot, bundel gelijke hoeveelheden van de bibliotheken volgens de vereisten van de sequencing machine, en volgorde op een high-throughput sequencing systeem. Het elektropherogram van extracellulaire RNAs omvatte een breed scala aan RNA.

Cellulair RNA vertoonde daarentegen zeer duidelijke pieken, wat overeenkomt met 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA en 28SrRNA. De resulterende kwaliteit van beide bibliotheken was hoog en vergelijkbaar. De lengteverdeling van beide bibliotheken vertoonde een enkele piek bij 22 nucleotiden, met correleert met microRNAs.

De bibliotheken van extracellulaire RNAs waren daarentegen heterogeener en bevatten nog twee pieken die correleren met tRNA's, helften en fragmenten, of piRNAs. 65% van de reads van cellulair RNA werden in kaart gebracht aan menselijke microRNAs, en elk van de andere kleine RNAs goed voor een klein deel van de in kaart gebrachte leest. In tegenstelling tot contrasterend, slechts 8% van extracellulaire RNAs afgestemd op menselijke microRNAs.

De meest voorkomende kleine RNA waarop de leest in kaart gebracht waren tRNAs, en de ongeëvenaarde leest later afgestemd op bacteriële sequenties. Uit een vergelijking met het rundergenoom bleek dat FBS geen bron van besmetting was. Vandaar, extracellulaire RNAs vertonen een atypisch profiel in vergelijking met normale cellulaire RNA.

Bibliotheekvoorbereiding is een cruciaal onderdeel van dit protocol. Mengen moet heel voorzichtig worden gedaan om te voorkomen dat bellen vormen. Deze methode kan ook worden gebruikt om het profiel van exRNAs uit andere soorten cellen te onderzoeken, wat helpt om de functie van exRNAs te bestuderen.