Name: Zenuw differentiatie van de stamcel door een One-step koude atmosferische Plasma behandeling In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Leer hoe koud atmosferisch plasma de differentiatie van neurale stamcellen in vitro versterkt voor toepassing bij neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson. Deze methode biedt een veilige, efficiënte eenstapsbenadering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Huazhong geleerde programma, het onafhankelijke innovatiefonds van de Huazhong Universiteit voor wetenschap en technologie (nr. 2018KFYYXJJ071) en de nationale Natural Science Foundation van China (nrs. 31501099 en 51707012).

1. cel culturen en Predifferentiation
<ol><li>
Neurale stamcellen cultuur en predifferentiation
	<ol>
<li>Poly-D-lysine-gecoate coverslips voor te bereiden. Een steriele dekglaasje aan (20 mm diameter) in een 12-well plaat gebracht. Coat de cover glas met poly-D-lysine, 0,1% w/v, in water (Tabel of Materials) voor betere hechting van de cel op de coverslips door de volgende stappen te volgen. Opmerking: Optimale omstandigheden moeten worden bepaald voor elke cellijn en toepassing.<ol>
<li>Aseptisch coat het oppervlak van het dekglaasje aan met poly-D-lysine, 0,1% w/v, in water. Rock zachtjes om een gelijke deklaag van het dekglaasje aan oppervlak.</li>
			<li>Na het kweken van overnachting (~ 12 h) bij 37 ° C, de poly-D-lysine-oplossing verwijderen en spoel het oppervlak 3 x met 1 mL steriel water.</li>
			<li>Droog de cellen ten minste 30 min voordat ze zaaien.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lymfkliertest neurale stamcellen C17.2 (C17.2-NSC) cultuur en predifferentiation
	<ol>
<li>C17.2-NSCs in een maatkolf van 25 cm2 in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 5% paard serum (HS) en 1% penicilline/streptomycine bij 37 ° C en 5% CO2 voor ~ 2-3 d uit te broeden.</li>
		<li>Wanneer de cellen bij 85% samenvloeiing, verwijderen van het medium, wassen van de cellen met 1 mL PBS en voeg 1 mL verse trypsine (0,25%) in de destillatiekolf. Laat het voor 1 min; dan, voeg 1 mL gestolde voedingsbodem aan de kolf en Pipetteer op en neer meerdere malen om de schorsing van een enkele cel.</li>
		<li>Tellen de dichtheid van de cellen in de opschorting die met behulp van een hemocytometer. Bereken de benodigde hoeveelheid celsuspensie tot een concentratie van de laatste cel van 2 x 104 cellen/mL.</li>
		<li>Beënt de C17.2-NSCs op het gecoate coverslips in de 12-well plaat met de dichtheid van ~ 2 x 104 cellen per putje. Controleer de celdichtheid onder een microscoop. Opmerking: Voor een beter resultaat, de optimale celdichtheid moet worden bepaald voordat het experiment immunofluorescentie.</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C in een cel incubator voor 12u te voorzien in bijlage.</li>
		<li>Na bijlage, wassen de cellen 2 x met 1 mL PBS en het cultiveren van de cellen met differentiatie medium bestaande uit DMEM/F12 met 1% N2 supplement voor 48 uur vóór de plasma behandeling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primaire rat neurale stamcellen cultuur en predifferentiation
	<ol>
<li>De schorsing van de primaire rat NSC in rat NSC groeimedium in ongecoate T25 kolven bij een dichtheid van 5 x 10-5 -cellen cultuur. Opmerking: De primaire rat NSCs werden geïsoleerd volgens het protocol van Xie et al. 9.</li>
		<li>Controleer de vorming van neurospheres onder een omgekeerde Microscoop. Zorg ervoor dat de morfologie van de neurospheres vertoont bolvormig en transparante meercellige complexen.</li>
		<li>Wanneer de neurospheres een diameter van 3 mm of groter bereikt, breng de neurosphere een tube van 15 mL steriele centrifuge en laat die de neurospheres door de zwaartekracht regelen.</li>
		<li>Verwijder het supernatant zorgvuldig te laten van de neurospheres in een minimale hoeveelheid medium.</li>
		<li>Spoel de neurospheres 1 x met 5 mL PBS en laat de neurospheres door de zwaartekracht regelen. Verwijder de bovendrijvende substantie te laten van een minimale volume van PBS.</li>
		<li>Een geschikt volume van differentiatie medium aan te passen van de celdichtheid tot ~ 12-15 neurospheres per milliliter toevoegen. Het differentiatie-medium voor primaire rat NSCs bestaat uit DMEM/F12, 2% B27, en 1% FBS.</li>
		<li>Neurosphere ophanging op elk zaad 1 mL gecoat dekglaasje aan in de 12-well-plaat. Opmerking: Schud de plaat voorzichtig om ervoor te zorgen dat de neurospheres gelijkmatig verdeeld zijn. Deze stap is essentieel voor een beter resultaat van de immunofluorescentie.</li>
		<li>Plaats de plaat in de incubator en laat ze predifferentiate gedurende 24 uur voordat de plasma behandeling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van de Plasma-Jets
<ol><li>Kies een halfopen kwarts buis met een inwendige diameter van 2 mm en een uitwendige diameter van 4 mm. Steek een hoogspannings-draad met een diameter van 2 mm in de buis.</li>
	<li>Voeg de quartz-buis met de hoogspannings-draad in een 5 mL-spuit en gebruik een houder te mounten in het centrum van de spuit. Stel de afstand tussen de verzegelde uiteinde van de buis kwarts en de spuit tip op 1 cm.</li>
	<li>Een 1 m siliconen rubber pijp (met een inwendige diameter van 12 mm) verbinden met het open uiteinde van de spuit en sluit het vervolgens naar de debietmeter en gas klep in volgorde.</li>
</ol>3. de verwerving van de Jets
<ol><li>Sluit het circuit zoals afgebeeld in Figuur 1. Verbind de draad van de uitvoer van de voeding naar de plasma jet-apparaat, en sluit vervolgens het uiteinde van de sonde hoogspannings-met de draad van de uitvoer om te ontdekken de spanning. Sluit het andere uiteinde van de sonde van de hoog-voltage aan de oscilloscoop opnemen van de informatie van de uitgangsspanning. Controleer het hele circuit en dat de voeding, de oscilloscoop en de hoog-voltage-sonde zijn geaard.</li>
	<li>Controleer de gasleiding. Zorg ervoor dat de gas-buis is aangesloten op het plasma jet-apparaat; dan, open de klep van het gas van de helium (volume Fractie, 99,999%) en zuurstof (volume Fractie, 99,999%) en stel de gasstroom op 1 L:0.01 L/min (He: O2). Opmerking: Laat de gasstroom voor enkele minuten voordat ik overga op de voeding voor de eerste keer.</li>
	<li>De amplitude van de pols, frequentie en pulsbreedte instellen als 8 kV, 8 kHz en 1600 ns, respectievelijk. Controleer het circuit opnieuw en schakel vervolgens, op de knop van de uitgang maken een plasma-jet. Let op: Raak niet de hoogspannings-draad op elk gewenst moment.</li>
</ol>4. plasma behandeling van neurale stamcellen
<ol><li>Stel de afstand tussen het mondstuk van de spuit en de cel goed gat tot 15 mm. Opmerking: De afstand wordt gemeten vanaf de onderkant van het platform waar de 12-well plaat wordt geplaatst.</li>
	<li>Neem de 12-well plaat uit de incubator en het medium van de predifferentiated cellen omzetten in 800 µL van verse differentiatie medium.</li>
	<li>De cellen verdelen in drie groepen: een onbehandelde controlegroep, een groep 60 s hij-en-O2 (1%) gas flow behandeling en een 60 s plasma behandeling groep. Opmerking: Er is geen voor de hand liggende vloeibare verlies onder de voorwaarde van de behandeling.</li>
	<li>Plaats de 12-well plaat onder de plasma-jets, zorg ervoor dat de verstuiver spuit wordt vastgesteld in het midden van iedere hole, en de ter zake dienende behandeling geven aan de verschillende groepen vermeld in stap 4.3. Opmerking: De onbehandelde controles werden gehouden in differentiatie medium bij kamertemperatuur tijdens de experimentele procedure om eenvormige behandeling voorwaarden te garanderen. De hij-en-O2 (1%) gas flow behandelde groep werd behandeld met alleen een hij en de O-2 (1%)-gas-flow, zonder plasma generatie. Alle behandelingen moeten in drievoud worden uitgevoerd.</li>
</ol>5. neurale stamcellen differentiatie
<ol><li>Na de behandeling, het verwijderen van de oorspronkelijke cultuur en voeg 1 mL van nieuwe differentiatie medium aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer de cellen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 6 d. wijzigen het medium om de andere dag.</li>
	<li>Controleer de status van de differentiatie van de verschillende groepen dagelijks onder een omgekeerde fase contrast licht microscope. Willekeurig ten minste 12 velden selecteren en nemen van foto's te nemen van de morfologische veranderingen.</li>
</ol>6. immunofluorescentie kleuring
<ol><li>
Spoelen
	<ol>
<li>Neem de monsters uit de cel incubator en verwijderen van het medium door aspiratie. Spoel de cellen 1 x met 1 mL PBS. Opmerking: Na de differentiatie, worden de cellen zijn gemakkelijk uitneembaar. Het is noodzakelijk om toe te voegen de PBS van de kant van de cultuur-putten om te voorkomen dat het wassen van de cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixatie
	<ol>
<li>Het herstellen van de cellen met de 500 µL van 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na de fixatie, spoel zachtjes de cellen 3 x met 1 mL PBS, 5 minuten elk, verwijderen van de resterende 4% paraformaldehyde. Opmerking: Het optimale tijdstip voor fixatie van de cel moet worden bepaald volgens de celtypes. Na de fixatie, voeg 1 mL PBS van de kant van de cultuur-putten en laat het monster op de tabel voor 5 min. Gebruik geen een lab shaker, om ervoor te zorgen een minimaal verlies van cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Permeabilization
	<ol>
<li>Permeabilize van de monsters met 0,2% TritonX-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na permeabilization, spoel de cellen zachtjes met 1 mL PBS voor drie keer 5 minuten elk. Opmerking: Het optimale tijdstip voor cel permeabilization moet worden bepaald volgens celtypes. Na permeabilization, voeg 1 mL PBS de kant van de cultuur-putten, laat het monster op de tafel voor 5 min. Gebruik geen een lab-shaker om de minimaal verlies van cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blokkeren
	<ol>
<li>1 mL 10% geit serum in PBS toevoegen aan elk monster en laat het monster op de tabel voor 1 h voor het blokkeren van alle niet-specifieke interacties. Opmerking: Gebruik geen een lab shaker, om te voorkomen dat de cellen loskoppelen van de dia. Een spoelen is niet nodig in deze stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubatie met primair antilichaam
	<ol>
<li>Verdun het primaire antilichaam met primair antilichaam verdunning buffer. Opmerking: Voor een optimaal resultaat de ratio van de uiteindelijke verdunning van het primaire antilichaam moet worden bepaald door dit. De verdunningsverhoudingen van anti-Nestin (voor ongedifferentieerde stamcellen), anti-β-tubuline III (voor neuron), anti-O4 (voor Oligodendrocyt), anti-NF200 (voor volwassen neuronen), anti-ChAT (voor cholinerge neuronen), anti-LHX3 (voor motorische neuronen), anti-GABA (voor GABAergic neuronen), anti-serotonine (voor serotonerge neuronen) en anti-TH (voor Dopaminerge neuronen) zijn 1:80, 1:200, 1:100, 1:100, 1:100, 1:200, 1:100, 1:200 en 1:100, respectievelijk.</li>
		<li>300 µL van verdunde primaire antilichamen toepassen door verschillende monsters.</li>
		<li>Incubeer de celsteekproeven 's nachts bij 4 ° C. Opmerking: Het is aanbevolen om primaire antilichamen bij 4 ° C om de achtergrond en de niet-specifieke kleuring uit te broeden.</li>
		<li>Verwijder de primaire antilichamen en zachtjes spoel de cellen 3 x met 1 mL PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubatie met secundair antilichaam
	<ol>
<li>Verdun de Cy3-geconjugeerde of Alexa Fluor 488-geconjugeerde secundaire antilichamen met behulp van 3% geit serum in PBS. Opmerking: Voor een optimaal resultaat de ratio van de uiteindelijke verdunning van het secundaire antilichaam moet worden bepaald door dit.</li>
		<li>Breng 300 µL van relevante secundaire antilichamen te detecteren elke primair antilichaam. Opmerking: Alle van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in het donker om te voorkomen dat fluorescentie blussen.</li>
		<li>Incubeer het monster van de cel in het donker gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder de secundaire antilichamen en spoel de cellen zachtjes met 1 mL PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nucleaire kleuring
	<ol>
<li>Toepassing 500 µL van Hoechst 33258 werkende oplossing om onder te dompelen van het monster van de cel.</li>
		<li>Incubeer het monster van de cel in het donker gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur op het etiket van de kernen.</li>
		<li>Spoel zachtjes de cellen 3 x met 1 mL PBS, 10 minuten elk, beschermd tegen licht. Opmerking: Voor een minimaal verlies van cellen, de optimale wassen voorwaarde moet worden bepaald empirisch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage
	<ol>
<li>Breng een druppel van montage medium in het midden van de microslide.</li>
		<li>Neem uit de coverslips (met voorbeelden) pincet gebruiken en plaats het monster op de top van het montage-medium. Vermijd luchtbellen.</li>
		<li>Verwijder alle overtollige montage medium met absorberend papier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fluorescentie microscopie observatie
	<ol>
<li>Observeer de monsters onder de fluorescentie microscopie uitgerust met filters voor Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 en Cy3. Voor elk monster, willekeurig selecteren ten minste 8-12 velden en record beelden met een camera.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li>
<li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases%3A+dreams+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li>
<li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).</li>
<li>Weltmann, K. D., von Woedtke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+medicine-current+state+of+research+and+medical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Physics+and+Controlled+Fusion%22%5BJournal%5D)">Plasma medicine-current state of research and medical application.</a> Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).</li>
<li>Lloyd, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+Plasma%3A+Medical+Uses+and+Developments+in+Wound+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care.</a> Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).</li>
<li>Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+plasmas+at+atmospheric+pressure%3A+toward+new+pharmaceutical+treatments+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).</li>
<li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Treatment+of+Onychomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li>
<li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li>
<li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huazhong+University+of+Science+and+Technology.+%5BMed+Sci%5D%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li>
<li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fixatives+for+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

C17.2-NSCs is een soort van vereeuwigd neurale stamcellen lijn van neonatale muis cerebellaire granulaire laag cellen, ontwikkeld door Snyder en anderen10,11. C17.2-NSCs in de neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en kunnen onderscheiden en worden veel gebruikt in de neurowetenschappen12. In onze eerdere studie, kon CAPs de differentiatie van C17.2-NSCs in de neuronen verbeteren. Een bewijs-van-principe studie ook uitgevoerd met behulp va...

De gestuurde differentiatie van NSCs in een bepaalde bloedlijn voor weefsel vervoer wordt beschouwd als een van de meest beloftevolle therapieën voor neurodegeneratieve en neurotraumatic ziekten1. Catecholaminerge Dopaminerge neuronen zijn bijvoorbeeld vooral gewenst bij de behandeling van Parkinson (PD). Traditionele methoden voor te bereiden op de gewenste cellen vervoer hebben echter veel nadelen, zoals chemische toxiciteit, littekenvorming of anderen, die grotendeels belemmert de toepassingen van NSCs in de regeneratieve geneeskunde2. Het is daarom zeer noodzakelijk om het vinden van een roman en veilige manier voor NSC differentiatie.
Plasma is de vierde stand van zaken, volgende vaste stof, vloeistof en gas, en meer dan 95% van de zaken in het hele universum vormt. Plasma is elektrisch neutraal met niet-afhankelijke positieve/negatieve en neutrale deeltjes en wordt meestal gegenereerd door een hoog-voltage kwijting in het lab. In de laatste twee decennia, heeft de toepassing van plasma in biogeneeskunde enorme aandacht wereldwijd als de ontwikkeling van koude luchtdruk plasmatechnologie aangetrokken. Dankzij deze techniek, stabiele lage-temperatuur plasma kan worden gegenereerd in de omringende lucht in de atmosfeer zonder boog vorming en bestaat uit verschillende reactieve soorten, zoals reactieve stikstof soorten (RNS), reactieve zuurstof soorten (ROS), ultraviolet (UV) straling elektronen, ionen en elektrische veld3. CAPs hebben unieke voordelen voor inactivatie van micro-organisme, kankertherapie, wond genezing, behandeling van ziekten van de huid, celproliferatie en cel differentiatie4,5,6,7. In vorige werk, we laten zien dat koude atmosferische plasma jet kan het verbeteren van de differentiatie van NSCs in zowel de lymfkliertest neurale stamcellen C17.2 (C17.2-NSCs) en de primaire rat neurale stamcellen, vertonen een grote potentie om een krachtig instrument voor het gericht differentiatie van NSCs8. Hoewel het mechanisme van CAP versterking van NSC differentiatie niet volledig echter begrepen is geen gegenereerd door CAPs heeft bewezen een belangrijke factor in het proces. In dit werk, wij streven naar een gedetailleerde experimenteel protocol een atmosferische druk helium/zuurstof plasma straal te gebruiken voor de behandeling van NSCs in vitro, cel bereiding en voorbehandeling, morfologie observatie door omgekeerde Microscoop, en fluorescentie microscopie observatie van immunofluorescentie kleuring.

<table><tbody><tr><td>Coverslip</td><td>NEST</td><td>801008</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01B</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>bewaard bij -20 &deg;C en beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>bewaard bij -20 &deg;C en beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>Donor Horse serum</td><td>HyClone</td><td>SH30074.03</td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>HyClone</td><td>25300054</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum Blocking Solution</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>anti-Nestin</td><td>Beyotime</td><td>AF2215</td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>anti-&beta;-Tubulin III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>anti-O4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1326</td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>anti-NF200</td><td>Sigma</td><td></td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>anti-ChAT</td><td>Sigma</td><td></td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>anti- LHX3</td><td>Sigma</td><td></td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma</td><td></td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>anti-Serotonin</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>anti-TH</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>bewaard bij -20 &deg;C, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>bewaard bij -20 &deg;C en beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- Labeled Goat</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>bewaard bij -20 &deg;C en beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 flask</td><td>corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Beyotime</td><td>C1018</td><td>bewaard bij -20 &deg;C en beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td>bewaard bij -20 &deg;C en beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nanjing Jiangnan Novel Optics Company</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>High &ndash; voltage Power Amplifier</td><td>Directed Energy</td><td>PVX-4110</td><td></td></tr><tr><td>DC power supply</td><td>Spellman</td><td>SL1200</td><td></td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>Aligent&nbsp;</td><td>33521A</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>DPO3034</td><td></td></tr><tr><td>High voltage probe</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td></td></tr></tbody></table>

zenuw differentiatie van de stamcel door een one-step koude atmosferische plasma behandeling in vitro

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Als de ontwikkeling van fysieke plasmatechnologie, koude atmosferische plasma's (CAPs) zijn grote schaal onderzocht in decontaminatie behandeling van kanker, wondgenezing, wortelkanaalbehandeling, enz., vorming van een nieuwe onderzoeksterrein plasma geneeskunde genoemd. Een mengsel van elektrische, chemische en biologische reactieve soorten, CAPs hebben vertoond hun capaciteiten om de zenuw stamcellen differentiatie beide in vitro en in vivo en zijn steeds een veelbelovende manier voor neurologische ziekte-behandeling in de toekomst. De veel spannender nieuws is dat met behulp van CAPs one-step kan realiseren, en veilig geregisseerd, differentiatie van neurale stamcellen (NSCs) voor het vervoer van het weefsel. Wij tonen hier de gedetailleerde experimenteel protocol van het gebruik van een zelf-gemaakte CAP jet-apparaat te verbeteren van NSC differentiatie in C17.2-NSCs en primaire rat neurale stamcellen, evenals observeren het lot van de cel door omgekeerde en fluorescentie microscopie. Met de hulp van immunofluorescentie kleuring van technologie, vonden we beide de NSCs toonde een versneld differentieel tarief dan de onbehandelde groep en ~ 75% van de NSCs selectief onderscheiden in neuronen, die voornamelijk volwassen, cholinerge en motor zijn neuronen.

Cel morfologie werd waargenomen onder de omgekeerde Microscoop elke dag na de behandeling van de CAP. Figuur 2 toont de gewone omgekeerde fase contrast lichte Microscoop beelden van de celdifferentiatie in beide cellijnen. De plasma-testgroep vertoont een versnelde differentiatie tarief en een hoge differentiatie-verhouding ten opzichte van de controle en gas flow-groep.
De immunef...

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde experimentele stappen van een koude atmosferische plasma behandeling op neurale stamcellen en immunofluorescentie detectie voor verhoging van de differentiatie.

Zenuw differentiatie van de stamcel door een One-step koude atmosferische Plasma behandeling In Vitro

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

Deze methode heeft het potentieel om de differentiatie van neurale stamcellen in vitro te verbeteren en bij te dragen aan de behandeling van neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson. De belangrijkste voordelen van deze techniek is dat de koude atmosferische plasma's in één stap kunnen worden toegepast voor de veilige gerichte differentiatie van neurale stamcellen voor weefseltransplantatie. Koud atmosferisch plasma kan de differentiatie van neurale stamcellen binnen een korte behandelingsperiode verbeteren.En met behoefte aan meer schade aan de cellen, het verstrekken van de gewenste cellen voor transplantatie. Begin met het zaaien van ongeveer vijf keer tien tot de vijfde murine neurale stamcellen in een 25 centimeter vierkante fles. Met vijf milliliter van volledige DMEM voor twee tot drie dagen bij 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide.Wanneer de cellen bereiken 85 procent samenvloeiing, was de cultuur met een milliliter PBS. Vóór de behandeling, met een milliliter van 25 procent trypsine voor een minuut. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de reactie met een milliliter van cultuurmedium.En pipet meerdere malen om een enkele cel schorsing te genereren. Verdun de cellen na het tellen tot twee keer tien tot de vierde cel per milliliterconcentratie. Zaad een milliliter stamcellen op een poly-D-lysine gecoate cover slip per put in negen putten van een 12 cel kweekplaat.Controleer de celdichtheid onder een microscoop. En breng de cellen 12 uur terug naar de couveuse. Wanneer de cellen zijn bevestigd, was de cover glijdt twee keer met een milliliter PBS per was, en behandel de cellen met differentiatie medium voor 48 uur.Voor jet-acquisitie sluit u eerst de uitgangsdraad van de voeding aan op het plasmastraalapparaat. En de punt van de hoogspanningssonde met de uitgangsdraad om de spanning te detecteren. Sluit vervolgens het andere uiteinde van de hoogspanningssonde aan op de oscilloscoop om de informatie van de uitgangsspanning op te nemen.Controleer het hele circuit om ervoor te zorgen dat de voeding, oscilloscoop en hoogspanningssonde allemaal aan de grond zijn. En controleer de gasleiding om er zeker van te zijn dat de gasbuis is aangesloten op het plasmastraalapparaat. Open vervolgens de helium- en zuurstofgaskleppen en stel de gasstroom in op een verhouding van één liter tot 01 liter per minuut van helium tot zuurstof.Controleer het circuit opnieuw en druk op de uitgangsknop om een plasmastraal te maken. Om de neurale stamcellen plasma te behandelen, stel de afstand tussen de spuitmond en de eerste put van cellen in op 15 millimeter. Vervang de supernatants in de neurale stamcelculturen door 800 microliters van vers differentiatiemedium.En plaats de plaat onder de plasmajets. Ervoor te zorgen dat de spuit mondstuk is vastgesteld over het midden van elke put. Maak drie putten met plasma voor 60 seconden per behandeling, en drie putten met een procent helium en zuurstofgas voor 60 seconden per behandeling.Het verlaten van drie putten onbehandeld, als controles. Vervang vervolgens de supernatants door een milliliter vers differentiatiemedium. En breng de cellen zes dagen terug naar de couveuse.Controleer de differentiatiestatus van de verschillende groepen dagelijks, onder een omgekeerde fase contrastlichtmicroscoop. Laat de cellen na de behandeling ongeveer een uur volledig in evenwicht zijn in het conditiemedium voordat het supernatant wordt vervangen door een vers differentiatiemedium. Voor immunofluorescentie analyse, fix de culturen met 500 microliters van vier procent paraformaldehyde per goed gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Gevolgd door drie zachte vijf minuten spoelingen, met een milliliter PBS per wasbeurt. Vervolgens permeabiliseren van de vaste monsters met 2 procent Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gevolgd door zachte spoelen zoals aangetoond.Blokkeer na de laatste wasbeurt elke niet-specifieke binding met één milliliter van 10 procent geitenserum in PBS per monster gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, etiketteren de cellen in elke put met 300 microliters van de primaire antilichaam van belang 's nachts op vier graden Celsius. Gevolgd door drie wasbeurten in PBS zoals aangetoond.Label de cellen na de laatste wasbeurt met 300 microliter van de juiste secundaire antilichamen. Twee uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Spoel vervolgens de cellen voorzichtig met een milliliter PBS per put gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.Beeld de cellen op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de juiste filters. Plasma behandeld neurale stamcellen vertonen een versnelde differentiatie snelheid, en een hogere differentiatie verhouding in vergelijking met onbehandelde controle, en gasstroom behandeld stamcellen. Na plasmabehandeling neemt Nestin af.Beta-Tubulin III neemt aanzienlijk toe. En O4 neemt licht toe, in vergelijking met de controle behandeld en gasstroom behandeld stamcellen. Verder, na 60 seconden van plasmabehandeling, wordt een robuuste uitdrukking van volwassen neuron, cholinerge neuron en motorneuronmarkers waargenomen.Met zeer weinig GABAergic en serotonergic neuronen, en geen dopaminerge neuronen gedetecteerd. Tijdens een poging tot deze procedures, is het belangrijk om te onthouden, behandel de cellen met de juiste plasma dosering, omdat een lange en intense plasma behandeling periode zal leiden tot cel apoptose of necrose. Vergeet niet om ook vooraf de levensvatbaarheid van de cel te testen voordat de downstream-toepassing.

nerve-stem-cell-differentiation-one-step-cold-atmospheric-plasma

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-β, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

This video presents a method for triggering differentiation in neural stem cells by utilizing cold atmospheric plasma. This generates UV radiation and reactive molecules to stimulate nerve cells to produce projections, indicating neuronal cell differentiation.

Stimulating Nerve Stem Cell Differentiation Using Cold Atmospheric Plasma Treatment

This video demonstrates the process of generating oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from human embryonic stem cells, followed by the maturation of OPCs to oligodendrocytes. This process of generating oligodendrocytes opens numerous avenues to improve research and treatment of neurodegenerative diseases, including Alzheimer's.

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Oligodendrocytes

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Met het doel om veranderingen in miRNA's in gedifferentieerde menselijke neurale stamcellen (hNSC's) te karakteriseren, beschrijven we hNSC-differentiatie op een driedimensionaal systeem, de evaluatie van veranderingen in microRNA-expressie door miRNA PCR-array en computationele analyse voor miRNA-doelwitvoorspelling en de validatie ervan door middel van een dual luciferase-assay.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Het genereren van gedifferentieerde celtypen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) houdt een grote therapeutische belofte in, maar blijft uitdagend. PSCs vertonen vaak een inherent onvermogen om te differentiëren, zelfs wanneer ze worden gestimuleerd met een juiste reeks signalen. Hier beschreven is een eenvoudig hulpmiddel om de multi Lineage-differentiatie over verschillende PSC-lijnen te verbeteren.

Voorbijgaande behandeling van menselijke pluripotente stamcellen met DMSO om differentiatie te bevorderen

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Leer hoe koud atmosferisch plasma de differentiatie van neurale stamcellen in vitro versterkt voor toepassing bij neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson. Deze methode biedt een veilige, efficiënte eenstapsbenadering.

Zenuw differentiatie van de stamcel door een One-step koude atmosferische Plasma behandeling In Vitro

Meer video's verkennen