Zenuw differentiatie van de stamcel door een One-step koude atmosferische Plasma behandeling In Vitro

Deze methode heeft het potentieel om de differentiatie van neurale stamcellen in vitro te verbeteren en bij te dragen aan de behandeling van neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson. De belangrijkste voordelen van deze techniek is dat de koude atmosferische plasma's in één stap kunnen worden toegepast voor de veilige gerichte differentiatie van neurale stamcellen voor weefseltransplantatie. Koud atmosferisch plasma kan de differentiatie van neurale stamcellen binnen een korte behandelingsperiode verbeteren.

En met behoefte aan meer schade aan de cellen, het verstrekken van de gewenste cellen voor transplantatie. Begin met het zaaien van ongeveer vijf keer tien tot de vijfde murine neurale stamcellen in een 25 centimeter vierkante fles. Met vijf milliliter van volledige DMEM voor twee tot drie dagen bij 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide.

Wanneer de cellen bereiken 85 procent samenvloeiing, was de cultuur met een milliliter PBS. Vóór de behandeling, met een milliliter van 25 procent trypsine voor een minuut. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de reactie met een milliliter van cultuurmedium.

En pipet meerdere malen om een enkele cel schorsing te genereren. Verdun de cellen na het tellen tot twee keer tien tot de vierde cel per milliliterconcentratie. Zaad een milliliter stamcellen op een poly-D-lysine gecoate cover slip per put in negen putten van een 12 cel kweekplaat.

Controleer de celdichtheid onder een microscoop. En breng de cellen 12 uur terug naar de couveuse. Wanneer de cellen zijn bevestigd, was de cover glijdt twee keer met een milliliter PBS per was, en behandel de cellen met differentiatie medium voor 48 uur.

Voor jet-acquisitie sluit u eerst de uitgangsdraad van de voeding aan op het plasmastraalapparaat. En de punt van de hoogspanningssonde met de uitgangsdraad om de spanning te detecteren. Sluit vervolgens het andere uiteinde van de hoogspanningssonde aan op de oscilloscoop om de informatie van de uitgangsspanning op te nemen.

Controleer het hele circuit om ervoor te zorgen dat de voeding, oscilloscoop en hoogspanningssonde allemaal aan de grond zijn. En controleer de gasleiding om er zeker van te zijn dat de gasbuis is aangesloten op het plasmastraalapparaat. Open vervolgens de helium- en zuurstofgaskleppen en stel de gasstroom in op een verhouding van één liter tot 01 liter per minuut van helium tot zuurstof.

Controleer het circuit opnieuw en druk op de uitgangsknop om een plasmastraal te maken. Om de neurale stamcellen plasma te behandelen, stel de afstand tussen de spuitmond en de eerste put van cellen in op 15 millimeter. Vervang de supernatants in de neurale stamcelculturen door 800 microliters van vers differentiatiemedium.

En plaats de plaat onder de plasmajets. Ervoor te zorgen dat de spuit mondstuk is vastgesteld over het midden van elke put. Maak drie putten met plasma voor 60 seconden per behandeling, en drie putten met een procent helium en zuurstofgas voor 60 seconden per behandeling.

Het verlaten van drie putten onbehandeld, als controles. Vervang vervolgens de supernatants door een milliliter vers differentiatiemedium. En breng de cellen zes dagen terug naar de couveuse.

Controleer de differentiatiestatus van de verschillende groepen dagelijks, onder een omgekeerde fase contrastlichtmicroscoop. Laat de cellen na de behandeling ongeveer een uur volledig in evenwicht zijn in het conditiemedium voordat het supernatant wordt vervangen door een vers differentiatiemedium. Voor immunofluorescentie analyse, fix de culturen met 500 microliters van vier procent paraformaldehyde per goed gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Gevolgd door drie zachte vijf minuten spoelingen, met een milliliter PBS per wasbeurt. Vervolgens permeabiliseren van de vaste monsters met 2 procent Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gevolgd door zachte spoelen zoals aangetoond.

Blokkeer na de laatste wasbeurt elke niet-specifieke binding met één milliliter van 10 procent geitenserum in PBS per monster gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, etiketteren de cellen in elke put met 300 microliters van de primaire antilichaam van belang 's nachts op vier graden Celsius. Gevolgd door drie wasbeurten in PBS zoals aangetoond.

Label de cellen na de laatste wasbeurt met 300 microliter van de juiste secundaire antilichamen. Twee uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Spoel vervolgens de cellen voorzichtig met een milliliter PBS per put gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.

Beeld de cellen op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de juiste filters. Plasma behandeld neurale stamcellen vertonen een versnelde differentiatie snelheid, en een hogere differentiatie verhouding in vergelijking met onbehandelde controle, en gasstroom behandeld stamcellen. Na plasmabehandeling neemt Nestin af.

Beta-Tubulin III neemt aanzienlijk toe. En O4 neemt licht toe, in vergelijking met de controle behandeld en gasstroom behandeld stamcellen. Verder, na 60 seconden van plasmabehandeling, wordt een robuuste uitdrukking van volwassen neuron, cholinerge neuron en motorneuronmarkers waargenomen.

Met zeer weinig GABAergic en serotonergic neuronen, en geen dopaminerge neuronen gedetecteerd. Tijdens een poging tot deze procedures, is het belangrijk om te onthouden, behandel de cellen met de juiste plasma dosering, omdat een lange en intense plasma behandeling periode zal leiden tot cel apoptose of necrose. Vergeet niet om ook vooraf de levensvatbaarheid van de cel te testen voordat de downstream-toepassing.