Name: Long microRNA profilering in de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer long-microRNA-profilering in de oestrische cyclus bij ozon-blootgestelde muizen. Deze methode helpt onderzoekers inflammatoire genregulatie en hormonale invloeden op longgezondheid bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van NIH K01HL133520 (PS) en K12HD055882 (PS). Dr. Joanna Floros bedanken de auteurs voor de hulp met ozon blootstelling experimenten.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Penn State University.
1. beoordeling van de oestrische cyclus stadium
<ol><li>Goed beperken een vrouwelijke C57BL/6 muis (8-9 weken oud) met behulp van de muis van de hand terughoudendheid techniek beschreven in Machholz et al.,10.</li>
	<li>Vul de steriele plastic pipet met 10 μL van ultra zuiver water.</li>
	<li>De tip van de plastic pipet in de vagina te introduceren.</li>
	<li>Voorzichtig spoelen de vloeistof 4-5 keer te verzamelen van het monster.</li>
	<li>Plaats de laatste flush met vaginaal vocht op een glasplaatje.</li>
	<li>Observeer de onbevlekt vaginale flush onder een lichte Microscoop met een doelstelling van 20 x. Opmerking: Dieren die geen regelmatige cycli als gevolg van pseudopregnancy of andere oorzaken vertonen moeten worden uitgesloten van het experiment. Het is raadzaam voor het uitvoeren van dagelijkse vaginale afscheidingen voor ten minste drie opeenvolgende cycli te bevestigen van cyclicity.</li>
</ol>2. Gasbedwelming met behulp van ozon
<ol><li>Plaats een maximum van 4 muizen in twee 1.2 L glas containers met draad mazen deksels en water ad libitum.</li>
	<li>Zet een glazen container in de zaal van ozon en de andere in de gefilterde luchtkamer in het blootstelling.</li>
	<li>De ozonconcentratie aan 2 ppm en monitor ozonniveaus regelmatig aanpassen. Opmerking: De ozon-apparaat levert een gereglementeerde luchtstroom (> 30 air wijzigingen/h) met gecontroleerde temperatuur (25 ° C) en relatieve vochtigheid (50%). Het systeem genereert ozon door een elektrische ontlading ozonizer, die wordt gevolgd en gecontroleerd door een ultraviolet ozon analyzer en massastroom controllers, zoals eerder beschreven11.</li>
	<li>Glazen containers verwijderen na 3U blootstellingsduur ozon/gefilterde lucht. Dieren cage met beddengoed, voedsel en water ad libitum retourneren</li>
</ol>3. lung collectie
<ol><li>4 uur na de blootstelling, anesthetize dieren met een intraperitoneale injectie van een ketamine/xylazine cocktail (90 mg/kg ketamine, 10 mg/kg xylazine). Opmerking: Om te bevestigen op een goed niveau van anesthesie, Controleer de muis voor een pedaal reflex (stevige teen snuifje) en pas de verdoving zo nodig.</li>
	<li>Bevochtig de huid van de muis met 70% ethanol.</li>
	<li>Een middellijn-incisie van 2 cm, met behulp van een operationele schaar en chirurgische pincetten bloot de vena cava te maken.</li>
	<li>Offeren muizen door transect van de vena cava en de aorta. Indien nodig, een naald 21 G gauge invoegen de vena cava boven de renale aderen voor het verzamelen van bloed voorafgaand aan exsanguination. U kunt ook het verzamelen van bloed via hart punctie na standaardprotocollen.</li>
	<li>Gebruik een chirurgische scissor de buikholte opengesneden en verwijderen van de huid/Opper spier, verplaatsen naar boven richting de ribben.</li>
	<li>Gebruik een chirurgische schaar om perforaties van het middenrif. Opmerking: Longen zal instorten uit de buurt van het middenrif.</li>
	<li>Knippen weg de ribbenkast met behulp van een chirurgische scissor bloot van het hart en de longen.</li>
	<li>Met behulp van Tang, neem een 1,5 mL RNase-vrije microcentrifuge buis en het onderdompelen in vloeibare stikstof te vullen van de buis. Opmerking: Gebruik beschermende handschoenen en bril om vloeibare stikstof.</li>
	<li>De longen verwijderen, plaats ze in de RNase-vrije microcentrifuge 1,5 mL buizen gevuld met vloeibare stikstof aan module-freeze het weefsel en wacht een paar seconden totdat de vloeistof is verdampt.</li>
	<li>Sluit het deksel van de buis en het weefsel bij-80 ° C bewaren tot gebruik.</li>
</ol>4. RNA voorbereiding
<ol><li>Verpulveren hele longen met behulp van een roestvrijstalen weefsel vergruizers. Opmerking: Het weefsel vergruizers moet worden geplaatst in vloeibare stikstof voorafgaand aan gebruik. De verstuiver schoon na elk gebruik met RNAse oplossing.</li>
	<li>Splitsen van de verpulverde longen en leg in twee 1,5 mL buizen (elke halve Long).</li>
	<li>Voeg 500 µL guanidinium kaliumthiocyanaatoplossing per monsterbuisje en meng.  Meng elk monster met behulp van 18 G 21 G en 23 G naalden, respectievelijk. Opmerking: Monsters kunnen worden verrijkt met 5.6 x 108 exemplaren van een kleine RNA spike-controle (van een andere soort) voordat u verdergaat met de extractie.</li>
	<li>500 µL van ethanol toevoegen aan elk monster en de vortex voor 15 s.</li>
	<li>Belasting het mengsel in een spin-kolom in een collectie buis en centrifuge op 12.000 x g voor 1 min. negeren de doorstroming.</li>
	<li>
Voor DNase ik behandeling (in kolomindeling);
	<ol>
<li>Voeg 400 µL van RNA Wash Buffer en centrifuge bij 12.000 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>In een RNase-gratis buis, voeg 5 µL van DNase ik 75 µL 1 x DNA spijsvertering buffer en meng. De mix rechtstreeks toevoegen aan de matrix van de kolom.</li>
		<li>Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 400 µL van RNA prewash oplossing aan de kolom en de centrifuge op 12.000 x g voor 1 min. negeren de doorstroming en herhaalt u deze stap.</li>
	<li>Voeg 700 µL van RNA was buffer naar de kolom en centrifuge op 12.000 x g voor 1 min. negeren de doorstroming.</li>
	<li>Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 2 minuten om te verwijderen van de resterende buffer. Breng de kolom in een buis RNase-vrij.</li>
	<li>Om Elueer RNA, 35 ÂµL van DNase/RNase-gratis water rechtstreeks toevoegen aan de matrix van de kolom en de centrifuge op 12.000 x g voor 1,5 min.</li>
	<li>Meten van de totale concentratie van RNA (260 nm) en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. Volg de instructies voor het uitvoeren van RNA kwantificering in een 1,5 µL monster aliquoot. Leeg het instrument met DNase/RNase-gratis water gebruikt voor elutie. Opmerking: Een ratio van 260/280 van ~2.0 wordt het algemeen aanvaard als "pure" voor RNA. Typische RNA-concentratie varieert meestal tussen de 750 en 2.500 ng/µL.</li>
	<li>Winkel bij-80 ° C.</li>
</ol>5. miRNA Profiling
<ol><li>
Naar retro-transcriberen kleine RNAs, gebruik 200 ng van totale RNA.
	<ol>
<li>De mix van de omgekeerde-transcriptie reactie op ijs (totale volume per reactie is 20 µL) voor te bereiden. Voeg voor elke reactie, 4 µL van 5 x buffer, 2 µL van 10 x nucleotiden Meng 2 µL van reverse-transcriptase en 2 ÂµL van RNase-gratis water. Meng alle onderdelen en aliquot in 600 µL RNAse-gratis plastic buizen (10 µL van mix per reactie). Opmerking: De omgekeerde-transcriptie master mix bevat alle onderdelen die nodig zijn voor de eerste-strand cDNA synthese behalve sjabloon RNA. Opmerking: Berekenen van overtollige volume (10%) bij de voorbereiding van de master mix.</li>
		<li>De sjabloon RNA toevoegen (200 ng in 10 µL) aan elke buis met omgekeerde-transcriptie master mix. Mix, centrifuge voor 15 s 1000 x gen bewaar ze op ijs tot plaatsing in thermocycler of dry block kalibrator.</li>
		<li>Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Incubeer gedurende 5 min bij 95 ° C en plaats de buizen op ijs.</li>
		<li>Verdun de cDNA door 200 µL RNase-gratis water toe te voegen aan elke 20 µL omgekeerde-transcriptie-reactie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Uitvoeren van PCR in real time met behulp van de muis inflammatoire respons en autoimmuniteit miRNA PCR Array.
	<ol>
<li>Een reactie mix (totale volume 1100 µL) bereiden: voor elke reactie, 550 µL van 2 x PCR master mix, 110 µL van 10 x universele primer mix, 340 ÂµL van RNase-gratis water en 340 µL van sjabloon cDNA (verdunde reactie uit stap 5.1.5) toevoegen.</li>
		<li>Voeg 10 µL van reactie mix aan elk putje van de vooraf geladen miRNA PCR Array gebruikmakend van een meerkanaals pipet.</li>
		<li>De miRNA PCR Array plaat met optische kleeffilm zegel.</li>
		<li>Centrifugeer de plaat voor 1 min bij 1.000 x g bij kamertemperatuur te verwijderen van de bubbels.</li>
		<li>Program het real-time cycler, PCR eerste activeringsstap voor 15 min bij 95 ° C, 3-staps fietsen met denaturatie voor 15 bij 94 ° C, gloeien voor 30 s s bij 55 ° C, en de uitbreiding voor 30 s bij 70 ° C gedurende 40 cycli nummer. Opmerking: Volg fabrikant fietsen voorwaarden instructies voor het instellen van de real-time cycler. De dissociatie curve stap ingebouwd in de real-time cycler software uitvoeren.</li>
		<li>Gegevensanalyses uitvoeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. de gegevensanalyse
<ol><li>Ct waarden van de real-time PCR-software voor elk monster extraheren in een analysesoftware. Opmerking: A Ct waarde van 34 wordt beschouwd als de cutoff. Als monsters bevatten spike-controle (b.v., cel-mir-39), normaliseren Ct waarden aan de Prikker in controle voor elk monster. Drempelwaarden wellicht handmatig worden ingesteld. Waarden volgens de basislijn worden automatisch ingesteld.</li>
	<li>Normaliseren van de Ct-waarden naar het gemiddelde Ct van zes miRNA huishouding besturingselementen: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, met behulp van de volgende vergelijking: ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)</li>
	<li>Voor vouwen wijzigen berekeningen, ΔΔCt waarden met behulp van een specifiek voorbeeld als het besturingselement, met behulp van de relatieve expressie vergelijking12berekenen: miRNA relatieve expressie: 2-∆∆Ct, waar - ∆∆Ct =-[∆Ct test - ∆Ct control] Opmerking: Een verandering van de vouw van 200 wordt beschouwd als de cutoff.</li>
	<li>Vouw expressie veranderingswaarden voor het uitvoeren van statistische analyses op R het limma pakket met Bioconductor8te exporteren.</li>
	<li>Voor meerdere vergelijkingen met behulp van de methode Benjamini-Hochberg13corrigeren. Opmerking:  Een kopie van de R-script is beschikbaar op: <a href="http://psilveyra.github.io/silveyralab/">http://psilveyra.github.io/silveyralab/</a>. Datasets en geanalyseerde gegevens zijn ook beschikbaar op de Gene Expression Omnibus onder nummer GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.</li>
</ol>7. de data-analyse: Functionele analysesoftware
<ol><li>De dataset regelen. MiRNAs met hun respectieve expressie log ratio's en de p-waarden bevatten. Zie tabel 1 voor het opmaken van de specifieke dataset.</li>
	<li>Open functionele analysesoftware (versie 01-10).</li>
	<li>Uploaden van de dataset gebruikend het volgende formaat: bestandsindeling: "Flexibele Format", bevat kolomkop: "Ja", selecteer ID type: "miRBase (volwassen)", Array platform gebruikt voor experimenten: Kies het matrix-platform. Opmerking: Aanvaarde bestandsformaten zijn .txt (door tabs gescheiden tekstbestanden), .xls (excel-bestanden), en .diff (cuffdiff-bestanden).</li>
	<li>Selecteer "Afleiden opmerkingen" en controleer of de experimentele groep labeling klopt.</li>
	<li>Ga naar "Dataset samenvatting" te herzien van de totale hoeveelheid toegewezen en niet-toegewezen miRNAs.</li>
	<li>
Klik op de "nieuwe" knop bovenaan links van het programma. Selecteer "Nieuwe MicroRNA Target Filter" en upload een microRNA dataset.
	<ol>
<li>Bron instellen: TarBase, vindingrijkheid deskundigen bevindingen, miRecords.</li>
		<li>Vertrouwen instellen: experimenteel waargenomen of hoog (voorspelde).</li>
		<li>Selecteer 'Kolommen toevoegen' om een verscheidenheid aan biologische informatie over de doelstellingen zoals de soorten, ziektes, weefsels, trajecten en meer.</li>
		<li>Om zich te concentreren op doelen die expressie in de experiment zijn gewijzigd, selecteert u "toevoegen / vervangen van mRNA dataset". Gebruik "Expressie Pairing" om te zoeken van de microRNAs met de niveaus van dezelfde of een andere expressie. Opmerking: De filter-analyse krijgt microRNA namen en symbolen, mRNA doelen, de bron die de relatie van doel, en het betrouwbaarheidsniveau van de voorspelde relatie (Figuur 2 beschrijft).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klik op "Toevoegen aan mijn traject" voor het verzenden van de gefilterde dataset aan een traject canvas en meer biologische relaties te verkennen.</li>
	<li>Pad Designer gebruiken om een model van de publicatie-kwaliteit van microRNA effecten te maken.</li>
	<li>
Een alternatieve optie is het maken van een analyse van de kern.
	<ol>
<li>Voor de soort van de analyse van de kern, selecteert u "Expression Analysis".</li>
		<li>Meting in type selecteert u "Expr Log Ratio".</li>
		<li>De samenvatting van de Filter van de analyse: overwegen alleen moleculen en/of relaties waar: (soorten = muis) en (vertrouwen = experimenteel waargenomen) en (gegevensbronnen = "Vindingrijkheid deskundige bevindingen", "Vindingrijkheid ExpertAssist bevindingen", "miRecords", "TarBase", of " TargetScan mens").</li>
		<li>Selecteer een cutoff van p-waarde = 0,05.</li>
		<li>De analyse worden uitgevoerd. Opmerking: In de lijst opgenomen: canonieke trajecten, stroomopwaartse regelgevende instanties analyse, ziekten en functies, regelgever effecten, netwerken, moleculen en meer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+microRNAs+regulate+gene+expression%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">How do microRNAs regulate gene expression?</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li>
<li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Microrna%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li>
<li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li>
<li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Sex+Differences%22%5BJournal%5D)">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18(2018).</li>
<li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Statistics%22%5BJournal%5D)">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li>
<li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.681.4748">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2346101">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+ONE%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Stomatologica+Croatica%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+purification-+precipitation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/0-387-29362-0_23">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li>
<li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59745-123-1:129">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li>
<li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TarBase%3A+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRecords%3A+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li>
<li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Informatics%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

MicroRNA profilering is een voordelige techniek voor de diagnose van de ziekte zowel mechanistisch onderzoek. In dit manuscript, hebben we een protocol om te evalueren van de expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen in de longen van vrouwelijke muizen blootgesteld aan ozon in verschillende oestrische cyclus fasen gedefinieerd. Methoden voor de bepaling van de oestrische cyclus, zoals de visuele detectiemethode, zijn beschreven16. Echter dit vertrouwen op eenmali...

microRNAs (miRNAs) zijn korte (19 tot en met 25 nucleotiden), natuurlijke, niet-coderende molecules van RNA. Sequenties van miRNAs zijn evolutionaire bewaard over soorten, hetgeen wijst op het belang van miRNAs bij het reguleren van de fysiologische functies1. microRNA expressie profilering heeft bewezen nuttig zijn voor het identificeren van miRNAs die belangrijk zijn bij de regulering van een verscheidenheid van processen, waaronder de immuunrespons, celdifferentiatie ontwikkelings processen en apoptosis2. Meer recentelijk zijn miRNAs bekroond voor hun potentiële gebruik in diagnose van de ziekte en therapeutics. Voor onderzoekers bestuderen van mechanismen van genregulering, kan meten van miRNA expressie verlichten systemen-niveau modellen van regelgevende processen, vooral wanneer de miRNA informatie wordt samengevoegd met het mRNA profilering en andere gegevens van genoom-schaal3. Aan de andere kant, miRNAs hebben ook aangetoond dat het stabieler dan mRNAs in een scala van soorten van het specimen worden en zijn ook meetbaar met grotere gevoeligheid dan eiwitten4. Dit heeft geleid tot aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van miRNAs als biomarkers voor diverse moleculaire diagnostische toepassingen, met inbegrip van longziekten.
In de Long spelen miRNAs een belangrijke rol in de ontwikkelings processen en het onderhoud van homeostase. Bovendien is hun abnormale expressie geassocieerd met de ontwikkeling en de progressie van verschillende longziekten5geweest. Inflammatoire longziekte geïnduceerd door luchtverontreiniging blijkt grotere ernst en slechtere prognose bij vrouwtjes, die aangeeft dat de hormonen en de oestrische cyclus Long aangeboren immuniteit en miRNA expressie in reactie op de uitdagingen op milieugebied kunnen regelen 6. in dit protocol, gebruiken we ozon blootstelling, dat een belangrijk onderdeel van de luchtverontreiniging is, voor het opwekken van een vorm van Long ontsteking in vrouwelijke muizen dat zich bij het ontbreken van adaptieve immuniteit voordoet. Met behulp van ozon, zijn wij de ontwikkeling van hyperresponsiveness van de luchtwegen die wordt geassocieerd met luchtweg epitheliale celbeschadiging en een toename van de neutrofielen en inflammatoire mediatoren in proximale airways7inducerende. Er zijn op dit moment niet goed beschreven protocollen te karakteriseren en miRNAs over de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen analyseren.
Hieronder beschrijven we een eenvoudige methode om oestrische cyclus stadia en miRNA expressie in longweefsel van vrouwelijke muizen blootgesteld aan ozon te identificeren. Wij richten ook effectief bioinformatics benaderingen van miRNA ontdekking en target identificatie, met de nadruk op computationele biologie. We analyseren de microarray gegevens met behulp van limma, een R/Bioconductor-software die voorziet in een geïntegreerde oplossing voor het analyseren van de gegevens van gen expressie experimenten8. Analyse van PCR array gegevens uit limma heeft een voordeel in termen van macht over t-test gebaseerd procedures bij het gebruik van kleine aantal arrays/samples te vergelijken van expressie. Te begrijpen de biologische context van miRNA expressie resultaten, we dan de functionele analysesoftware gebruikt. Om de mechanismen tot regeling van transcriptionele veranderingen te begrijpen en te voorspellen waarschijnlijk resultaten, wordt de software combineert miRNA-expressie datasets en kennis van de literatuur9. Dit is een voordeel in vergelijking met software die kijk voor statistische verrijking in overlappende sets van miRNAs.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>8 weken oud</td></tr><tr><td>UltraPure Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10813012</td><td></td></tr><tr><td>Steriele plastic pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-25</td><td>Capaciteit: 1,7 mL</td></tr><tr><td>Geverfde microscoopglaasjes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2951TS</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Microscope World</td><td>MW3-H5</td><td>10x en 20x objectief</td></tr><tr><td>Ketathesia- Ketamine HCl Injectie USP</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>55853</td><td>90 mg/kg. Gecontroleerd medicijn.</td></tr><tr><td>Xylazin Sterile Oplossing</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>10 mg/kg. Gecontroleerd medicijn.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Verdun tot 70% ethanol met water.</td></tr><tr><td>21 G gauge naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>329654</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Operatie Schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501221, 504613</td><td>14 cm, Scherp/Bots, Gebogen en 9 cm, Recht, Fijne Scherpe Tip</td></tr><tr><td>Pincet Kit</td><td>World Precision Instruments</td><td>504616</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp;Bessem Tissue Pulverizers</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-418-1</td><td>Capaciteit: 10 tot 50 mg</td></tr><tr><td>RNase-vrije Microfuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>TRIzol Reagens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>Muis Inflammatoire Reactie &amp; Autoimmuniteit miRNA PCR Array</td><td>Qiagen</td><td>MIMM-105Z</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandig, DNase-frei, RNase-frei PCR tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12225</td><td>voor 20 µL reacties</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>https://office.microsoft.com/excel/</td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td></tr><tr><td>R Software</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>Thermische cycler of koel-/verwarmingsblok</td><td>Algemene Lab Leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Algemene Lab Leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR cycler</td><td>Algemene Lab Leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multikanaals pipettor</td><td>Algemene Lab Leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA wash buffer</td><td>Zymo Research</td><td>R1003-3-48</td><td>48 mL</td></tr><tr><td>DNA verteringsbuffer</td><td>Zymo Research</td><td>E1010-1-4</td><td>4 mL</td></tr><tr><td>RNA pre-wash buffer</td><td>Zymo Research</td><td>R1020-2-25</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Ultraviolet ozon analyazer</td><td>Teledyne API</td><td>Model T400</td><td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td></tr><tr><td>Mass flow controllers</td><td>Sierra Instruments Inc</td><td>Flobox 951/954</td><td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td></tr></tbody></table>

long microrna profilering in de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profilering is geworden van belang aan onderzoekers werken in verschillende onderzoeksgebieden van biologie en geneeskunde. Huidige studies tonen een veelbelovende toekomst van het gebruik van miRNAs in de diagnose en behandeling van longziekten. Hier definiëren we een protocol voor miRNA profilering voor het meten van de relatieve overvloed van een groep miRNAs voorspeld te reguleren van inflammatoire genen in het longweefsel uit van een ozon-geïnduceerde luchtweg ontsteking muismodel. Omdat het heeft aangetoond dat circulerende sex-hormoonniveaus kan invloed hebben op de regulering van de aangeboren immuniteit longkanker bij vrouwen, is het doel van deze methode voor het beschrijven van een inflammatoire miRNA profilering protocol in vrouwelijke muizen, rekening houdend met de oestrische cyclus fase van elk dier op het moment van blootstelling van de ozon. We pakken ook toepassing bioinformatics benaderingen van miRNA ontdekking en target identificatie methodes gebruikend het limma, een R/Bioconductor-software, en functionele analysesoftware te begrijpen van de context van de biologische en de trajecten die zijn gekoppeld aan differentiële miRNA expressie.

De verschillende soorten cellen waargenomen in de uitstrijkjes zijn gebruikt ter identificatie van de muis oestrische cyclus stadium (Figuur 1). Deze worden geïdentificeerd door de morfologie van de cel. Tijdens proestrus zijn cellen bijna uitsluitend clusters van rond-gevormde, goedgevormde genucleëerde epitheliale cellen (figuur 1A). Wanneer de muis in de estrus fase is, zijn cellen cornified squamous epitheliaale cellen, aanwe...

Hier beschrijven we een methode voor de beoordeling van de Long-expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen met behulp van muizen blootgesteld aan ozon of gefilterde lucht in verschillende stadia van de oestrische cyclus.

Long microRNA profilering in de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van longimmuniteit over hoe de expressie van microRNAs die worden voorspeld om ontstekingsgenen in de longen te reguleren, te beoordelen. Deze techniek biedt de eenvoudige manier voor het identificeren van de bijdragen van circulerende hormonen aan longmicroRNA expressie. Om de estrous cyclus fase te beoordelen, handmatig beperken een acht tot negen weken oude vrouwelijke muis en de invoering van het puntje van een plastic 10-microliter pipet gevuld met ultra zuiver water in de vagina.Spoel voorzichtig vier tot vijf keer om een monster te verzamelen en de laatste spoeling van vaginale vloeistof op een glazen glijbaan te deponeren. Observeer vervolgens de onbevlekte vaginale flush onder een lichtmicroscoop bij vergroting van 20x. Voor ozon en gefilterde luchtblootstelling, plaats een maximum van vier muizen in een van de twee individuele 1,2 liter glazen containers met gaasdeksels.Zet een glazen container in een ozonkamer en een in een gefilterde lucht blootstelling kamer. Pas vervolgens de ozonconcentratie aan op twee delen per miljoen en verwijder de container na drie uur. Vier uur na blootstelling d

lung-microrna-profiling-across-the-estrous-cycle-in-ozone-exposed-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we hoe u de fase van het murine reproductieve (pro-oestrus, oestrus, metestrus of diestrus) door een eenvoudige, niet-invasieve verzamelen en cytologische beoordeling van de vaginale uitstrijkjes te identificeren. Verder hebben we beschrijven hoe vaginale cytologie weerspiegelt circulerende hormoonspiegels ten grondslag liggen aan de transitie door de murine voortplantingscyclus.

Het uitvoeren van vaginale lavage, Crystal Violet kleuring, en vaginale cytologische Evaluatie Mouse loopsheid Staging identificatie

Twee oefening paradigma's werden getest op een nieuw ontwikkelde chemisch geïnduceerde menopauze muismodel om de impact van de menopauze op de inspanningscapaciteit en cardiale aanpassing uit te oefenen onderzoeken.

Een methode om de impact van chemisch-geïnduceerde ovarieel falen op de inspanningscapaciteit en Cardiac Aanpassing studie bij muizen

Deze studie beschrijft de succesvolle generatie voor een nieuwe diermodel van chronische obstructieve longziekte (COPD) door muizen aan hoge concentraties van ozon herhaaldelijk bloot te leggen.

Generatie van het Model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling

Dit manuscript beschrijft een protocol om te bepalen of blootstelling aan ozon, een criterium luchtverontreinigende stof, in vivo alveolaire macrofaag-efferocytose belemmert. Dit protocol maakt gebruik van veelgebruikte reagentia en technieken en kan worden aangepast aan meerdere modellen van long letsel om de effecten op alveolaire macrofaag efferocytose te bepalen.

In vivo beoordeling van alveolaire macrofaag Efferocytose na blootstelling aan ozon

Gecombineerde ozon- en bacteriële endotoxine blootgestelde muizen vertonen wijdverspreide celdood, waaronder die van neutrofielen. We zagen cellulaire aanpassingen zoals verstoring van cytoskelet lamellipodie, verhoogde cellulaire expressie van complexe V ATP synthase subeenheid β en angiostatine in broncho-alveolaire lavage, onderdrukking van de immuunrespons van de longen en vertraagde neutrofiele rekrutering.

Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel

Een methode voor microdissectie van de eileider van de muis die het mogelijk maakt om de afzonderlijke segmenten te verzamelen met behoud van RNA-integriteit wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een niet-enzymatische ovductale celdissociatieprocedure beschreven. De methoden zijn geschikt voor latere gen- en eiwitanalyse van de functioneel verschillende eileidersegmenten en gedissocieerde eileidercellen.

Microdissectie en dissociatie van de murine-eileider: individuele segmentidentificatie en eencellige isolatie

In dit protocol werden de translating ribosome affinity purification (TRAP) methode en de isolatie van nuclei tagged in specific cell types (INTACT) methode geoptimaliseerd voor de gepaarde ondervraging van het celspecifieke ovariumtranscriptoom en epigenoom met behulp van het NuTRAP muismodel gekruist naar een Cyp17a1-Cre muislijn.

Celspecifieke gepaarde ondervraging van het ovarium-epigenoom en transcriptoom van de muis

Follikelstimulerend hormoon (FSH) in verschillende extragonadale weefsels en organen wordt in verband gebracht met de pathogenese van meerdere ziekten. Het ovariëctomische en met FSH behandelde muismodel (OVF) kan worden gebruikt om de extragonadale werking van FSH te onderzoeken.

Onderzoek naar onafhankelijke effecten van follikelstimulerend hormoon in vivo in een muismodel

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van de test voor begraven voedsel en het experiment met sociale geurdiscriminatie om de effecten van blootstelling aan ingeademde milieuverontreinigende stoffen op de reukfunctie bij muizen te beoordelen.

Onderzoek naar de effecten van ingeademde milieuverontreinigende stoffen op de reukfunctie bij muizen

Hier presenteren we een protocol om hypoxie op te wekken bij neonatale muizen door ze af te leveren in gecontroleerde omgevingen met variërende zuurstofconcentraties. Muismodellen die bij de geboorte aan zuurstofvariaties zijn blootgesteld, hebben de expressie van miRNA's die betrokken zijn bij de inductie van gedragsfenotypische veranderingen zoals autisme duurzaam gevarieerd.

Hypoxie verandert de miRNA-niveaus die betrokken zijn bij niet-Mendeliaanse overerving van autismespectrumstoornis bij muizen

Leer long-microRNA-profilering in de oestrische cyclus bij ozon-blootgestelde muizen. Deze methode helpt onderzoekers inflammatoire genregulatie en hormonale invloeden op longgezondheid bestuderen.

Long microRNA profilering in de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen

Meer video's verkennen