Scheiden van bacteriën per Capsule bedrag met behulp van een discontinue dichtheid verloop

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het Klebsiella-veld, zoals welke genen worden gebruikt om capsule en bijbehorende virulents te reguleren. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een middel biedt om gecapsuleerde en niet-gekapseizeerde stammen fysiek te scheiden, en het kan ook worden gebruikt voor snelle vergelijkingen tussen stammen van capsuleproductie. Hoewel deze methode is ontwikkeld om capsuleregulatie in Klebsiella te bestuderen, kan deze ook worden toegepast op verschillende bacteriële soorten.

Over het algemeen individuen die nieuw zijn op deze methode zal worstelen, omdat het gieten van de gradiënten en het toevoegen van de cellen aan de gradiënten kan heel moeilijk zijn. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat we de technieken laten zien die moeilijk te beheersen zijn, het verstrekken van suggesties en tips om de gebruiker te helpen. Om te beginnen, selecteer een enkele kolonie uit een stockplaat met een steriele lus, en inenting 10 milliliter van een geschikte bouillon.

Broed de cultuur 's nachts. Breng de cultuur vervolgens over op een buis van 15 milliliter en centrifuge. Gooi vervolgens de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in twee milliliter PBS.

Herhaal de centrifugatie en gooi de resulterende supernatant weg. Dan opnieuw opschorten de pellet in twee milliliter PBS. Als u de verdunningen van de dichtheidsgradiënt wilt maken, combineert u het dichtheidsgradiëntmedium met PBS.

Dan aliquot 600 microliters van elke gradiënt verdunning in individuele twee milliliter buizen. Neem 100 microliter cellen in met een pipet van 200 microliter en plaats de pipetpunt aan de zijkant van de buis net onder de meniscus van een van de vele gradiënten. Aspirate de bacteriële cellen op de gradiënt zeer langzaam, oppassen niet aan de interface te mengen.

Centrifugeren de geprepareerde buizen gedurende 10 minuten bij 8.000 g's. Breng hierna de buizen over naar een rek om de minimale gradiëntverdunning te visualiseren die nodig is om de cellen net boven de gradiëntlaag te behouden. Breng eerst een milliliter van de meest verdunde verdunning van de dichtheidsverdunning over in een vijf milliliter ronde bodembuis.

Met behulp van een spuit met een 1,5 inch naald, neem een milliliter van de volgende meest geconcentreerde dichtheid gradiënt. Plaats de naald aan de onderkant van de buis en injecteer de inhoud van de spuit heel langzaam. Er moet een duidelijke interface zijn bij elke stap van het dichtheidsgradiënt.

Als de lagen mengen, zult u niet bereiken schone scheiding van uw bacteriën. Verwijder de naald voorzichtig uit het verloop om de interface tussen de verwateringen niet te verstoren. Plaats vervolgens de buis in een rek.

Voeg voorzichtig 600 microliter van de voorbereide cellen toe aan de bovenkant van het verloop in de buis. Plaats vervolgens de buis in een buisadapter en weeg de buis met de adapter om balans te garanderen. Plaats hierna de buisadapter in een rotor met een vaste hoek in een bench-top centrifuge en zet de buis 30 minuten op 3.000 g.

Ten slotte, na centrifugatie, verwijder de buis zorgvuldig, plaats het in een rek, en fotografeer de resultaten. In dit protocol werd dichtheidsgradiëntcentrifugatie gebruikt om bacteriële stammen te scheiden op basis van hoeveel capsule ze produceren. Hoewel de exacte resultaten afhankelijk zijn van de bacteriële soort, zullen de meeste stammen migreren naar een enkele locatie binnen de gradiënt.

Toepassing van deze methode op een bacteriële mutant bibliotheek moet produceren een belangrijke band boven de gradiënt, een minder dichte band door de bovenste laag van de gradiënt, en een kleine acapsulaire fractie aan de onderkant. Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de gradiëntinterfaces niet mogen worden gemengd en dat de gradiënt geen luchtbellen mag bevatten. Na de procedure moeten validatiemethoden zoals de uronic zuurtest of microscopie worden uitgevoerd om de hoeveelheid capsules te onderzoeken.

Dit is vooral belangrijk bij het gebruik van deze techniek voor nieuwe stammen. Vergeet niet dat het werken met Hazard Group 2 ziekteverwekkers gevaarlijk kan zijn. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals corrigerende beschermingsmiddelen, het correct naleven van risicobeoordelingen en het correct verwijderen van culturen.