Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8⁺ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van T-cel immunologie en de ontwikkeling van virale vectorvaccins. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat er slechts kleine hoeveelheden bloed nodig zijn, waardoor herhaalde metingen van dezelfde muis mogelijk zijn. Bovendien kunnen virus- en transgene-specifieke CTLs uit hetzelfde monster worden gedetecteerd.

Het aantonen van de procedure zal Jasmine Rinnofner, een technicus, en Annika Rossler, een grad student. Het meten en analyseren van de monsters zal Zoltan Banki zijn, een post-doc. Om te beginnen, veilig beperken van een muis volgens het tekstprotocol.

Verzamel 20 microliter bloed in een met EDTA bedekte buis uit de staartader van een muis. Bij het werken met splenocyten, isoleren van de milt en gebruik de zuiger van een spuit om het weefsel te drukken door middel van een celzeef. Na het uitvoeren van lyse op de erytrocyten, tel de cellen en pas de concentratie van het monster aan.

Bereid en label een Facs buis voor elk monster, en breng 100 microliter van orgaan suspensie, of 20 microliter bloed naar de buis. Bij het werken met splenocyten, centrifuge de orgelsuspensie gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Dan, vortex de buis om de cel pellet resuspend.

Voor elk kanaal te gebruiken, ook een Facs buis voor te bereiden voor een compensatie monster. Bereid een extra monster voor als een onbevlekt besturingselement. Bereid een buis met Facs buffers met tetramers op hun optimale verdunningen, en vortex te mengen.

Voeg vervolgens 50 microliter van de tetramerverdunning toe aan elk monster en vortex om te mengen. Voeg Facs-buffer zonder tetramers toe aan de compensatiebesturingselementen en het niet-vastgehouden monster. Vervolgens, incubeer de monsters in donkere omstandigheden op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Terwijl de monsters uitbroeden, voeg Facs buffer aan een buis. Voeg vervolgens de antilichamen toe aan de buffer volgens de verdunningen die zijn gespecificeerd in tabel 2 van het tekstprotocol en draaikolk de oplossing. In afwachting van de wetenschappelijke vraag zijn de marker combinaties, afgezien van de hier beschreven, zou kunnen worden gebruikt.

Zorg ervoor dat u altijd antilichamen tegen CD3 en CD8 in het paneel opneemt. Voor elk kanaal, bereid een buis met 200 microliters van Facs buffer, en voeg een microliter van een antilichaam verdunning tegen CD8 in hun respectieve kleur, en vortex te mengen. Bewaar vervolgens de verdunningen van antilichamen zoals gespecificeerd in het tekstprotocol.

Om de monsters te wassen, voeg een mililiter van Facs buffer aan de monsters en centrifuge. Gooi vervolgens de supernatant weg en giet de resterende vloeistof af met papieren handdoeken. Bij het werken met bloed, wees voorzichtig bij het aftappen van de resterende vloeistof.

Voorafgaand aan lysis van erythrocyten, zal het bloed niet vasthouden aan de bodem van de buis. U ook de supernatant aanzuigen. Voeg vervolgens 50 microliter van de antilichaamoplossing toe aan elke celpellet en vortex zachtjes.

Voeg 50 microliter van elke compensatiemix toe aan de bijbehorende compensatiecontrole en 50 microliter facs-buffer aan de celpellet van de onbevlekte besturing en vortex voorzichtig. Bij het werken met splenocyten, was de monsters na antilichaam vlekken direct met een tot twee milliliter Facs buffer, en centrifuge gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg en giet de resterende vloeistof op papieren handdoeken af.

Voeg 500 microliters van ACK buffer toe aan elk bloedmonster, en vortex zachtjes. Vervolgens, incubeer de monsters in het donker gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg een milliliter facs buffer aan de monsters, en centrifuge.

Gooi vervolgens de supernatant weg en giet de resterende vloeistof af met papieren handdoeken. Een goede lyse van erytrocyten is een cruciale stap om facs-meting te vergemakkelijken, daarom, wanneer de pellet nogal nat is, herhaallyse van erytrocyten. Was de monsters opnieuw zoals eerder beschreven.

Gooi vervolgens de supernatant weg en giet de resterende vloeistof op een papieren handdoek af. Voorafgaand aan fixatie, zorg ervoor dat de cellen goed zijn opnieuw opgetrokken om vorming van klonten te voorkomen. Voeg 150 tot 300 microliter facs bevestiging buffer aan elke buis, en vortex te mengen.

Ga vervolgens zo snel mogelijk verder met de cytometrische meting van de stroom. Meet eerst de compensatiecontroles en corrigeer de eventuele spectrale overlappingen. Daarna, het opzetten van sequentiële poorten te selecteren voor CD3-positieve en CD8-positieve cellen.

Poort op de lymfocyten met behulp van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing gebied. Dan, binnen de lymfocyten populatie, poort op enkele cellen met behulp van voorwaartse spreiding breedte versus gebied. Gebruik CD3- en CD8-kanalen om eencellige lymfocyten in kaart te brengen.

Identificeer CD8-positieve T-cellen, door gating op CD3-positieve en CD8-positieve cellen. Zorg ervoor dat cd8-lage cellen zijn opgenomen in de gating. Voortplanting op CD3/CD8-positieve cellen is een cruciale stap in dit protocol.

Aangezien activering van cellen vaak leidt tot down regulatie van CD3 en/of CD8, moeten cd3/CD8-lage cellen ook worden opgenomen. Plot hierna de CD8-positieve cellen ten opzichte van de tetramercellen, waarbij de CD8-positieve/tetramer-positieve cellen worden afgesloten. Neem indien mogelijk 20.000 cellen op in de CD3-positieve en CD8-positieve poort voor elk monster.

Sla ten slotte de metingen op als een FCS-bestand. In dit protocol werden antigeenspecifieke CD8+T-cellen kwantitatief gedetecteerd in bloed- en weefselmonsters. Na het gating van de CD3-positieve en CD8-positieve cellen werden tetramer-positieve cellen geïdentificeerd.

Twee verschillende tetramers werden gecombineerd in dezelfde buis voor vlekken, waardoor gelijktijdige kwantificering van twee verschillende CTL-specificiteiten mogelijk was. Met behulp van dit protocol kunnen T-celreacties van dezelfde muis in de loop van de tijd worden gevolgd, omdat voor elke meting slechts kleine hoeveelheden bloed nodig zijn. Daarnaast kunnen fenotypes van antigeenspecifieke CTLs worden geanalyseerd.

Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om langdurige incubatietijden te vermijden, omdat dit kan leiden tot internalisatie van T-celreceptoren. Sinds de ontdekking van tetramer-technologie is tetramer-kleuring een essentieel hulpmiddel geworden voor T-celanalyse en een breed scala aan toepassingen, waaronder tetramers die zich ontwikkelen. Een mooie toekomst voor heldere tetramers.