Name: Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie van bruin vetweefsel bij muizen voor genomische analyse van histonmodificaties en eiwit-DNA-interacties in metabolisme-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De stappen van de dierlijke behandeling van het protocol zijn door de Boston University's institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) goedgekeurd.
1. dag 1: Dissectie en voorbereiding van BBT chromatine Immunoprecipitation (ChIP)
<ol><li>Euthanaseren van muizen met behulp van een kooldioxide (CO2) kamer, en het uitvoeren van de dissectie onmiddellijk daarna. Spray muis bont met 70% ethanol voordat de incisie. Plaatst u de muisaanwijzer met de rug naar boven, daarna opengesneden de huid langs de hals. Zoek de VLEERMUIS direct onder de huid tussen de schouders (interscapular; het wordt weergegeven als twee kwabben, vlinder-vormig, met een dun laagje witte vet dat moet zorgvuldig verwijderd7). Opmerking: Voor een 3 maanden oude C57BL/6J muis die een regelmatige chow dieet (muis gewicht op deze leeftijd varieert tussen 27 en 30 g) wordt gevoed, is elke BAT kwab ongeveer 1 cm lang. Het totale gewicht van het depot BAT is ongeveer 0,15 g in zowel vrouwelijke als mannelijke muizen.</li>
	<li>Gebruik 1 BAT pad voor 3 ChIPs. Meerdere BAT pads kunnen gelijktijdig worden verwerkt tot ultrasoonapparaat.</li>
	<li>Dwarslijn elke BAT zeem in 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% formaldehyde gedurende 15 minuten draaien op 150 toeren per minuut bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Doven crosslinking door toevoeging van 2,5 M glycine aan een eindconcentratie van 125 mM voor 5 min, ronddraaiende 150 rpm op RT.</li>
	<li>Overbrengen van de VLEERMUIS pad naar 500 µL van hypotone lysis buffer (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0,2 mM PMSF) en voeg 2 RVS kralen (grootte: 3.2 mm diameter, Zie Tabel of Materials) voor elke BAT-pad. Een weefsel kraal gebaseerde homogenizer gebruiken (Zie Tabel van materialen) aan het verscheuren van het weefsel.</li>
	<li>Begin met 5 min op max kracht. Indien nodig, uit te breiden van de tijd tot het weefsel wordt gehomogeniseerd en afzonderlijke cellen gescheiden. Breng de monsters in een nieuwe buis en centrifugeer bij 4 ° C bij 16.000 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Na het centrifugeren, breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe buis en houd de cel pellet op ijs. Centrifugeer het supernatant bij 4 ° C bij 16.000 x g gedurende 10 minuten ter voorkoming van verlies van de zwevende cellen. Verwijder de laatste supernatant en resuspendeer de pellets van beide cel samen in 300 µL van SDS lysis buffer (SDS 1%; EDTA 10 mM; Tris-HCl pH 8, 50 mM) met 1 x proteaseinhibitor (Zie Tabel van materialen). Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de lysates voor het genereren van DNA fragmenten 200 – 500 basenparen lang. Na ultrasoonapparaat, verwijderen van puin door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 16.000 x g bij 4 ° C en controleren van het succes van ultrasoonapparaat via de Elektroforese van het DNA op een 1% agarose gel. Voor een middelgroot gel, uitgevoerd op 120 V; een goede scheiding wordt bereikt na 45 min. Opmerking: Ultrasoonapparaat optimalisatie mogelijk moet bereiken van de juiste grootte van fragmenten. Met de gekozen ultrasoonapparaat (Zie Tabel of Materials), hiervoor 2 keer op 320 W uitgangsvermogen en 20 KHz frequentie voor 10 min, met behulp van cycli van 30 s op/30 s af.</li>
	<li>Verdun het supernatant breuk 10-fold (eindvolume is 3 mL voor elke BAT pad) in de ChIP verdunning buffer (SDS 0,01%; Triton 1,1%; EDTA 1.2 mM; Tris-HCl pH 8, 16.7 mM; NaCl 167 mM) met 1 x proteaseinhibitor. Houd opzij 1% van deze chromatine-oplossing (gelijk aan 30 µL voor 3 mL) als de input van de ChIP. Houd de ingangen 's nachts bij 4 ° C (tot stap 2.4). Opmerking: De bovenbedoelde component zal voorzien in de input verwijzing relatieve kwantificering van materiaal van de immunoprecipitated in vergelijking met de hoeveelheid DNA aanwezig zijn in elk monster vóór immunoprecipitation.</li>
	<li>Toevoegen van het antilichaam van de ChIP (Zie Tabel van materialen voor de antilichamen die gebruikt hier als voorbeeld) tot 1 mL van de oplossing van de chromatine en na een nacht bebroeden bij 4 ° C met rotatie. Uitvoeren van parallelle immunoprecipitation met bijbehorende pre immuun IgG, indien beschikbaar, of normale IgG van dezelfde soort (bijv., regelmatige konijn IgG als het antilichaam wordt geproduceerd in een konijn). U kunt ook opslaan 1 mL van chromatine oplossing voor een neen-antilichaam-besturingselement. Opmerking: De optimale hoeveelheid antilichaam moet experimenteel worden bepaald voor elke nieuwe antilichamen tegen, als de concentratie van antilichaam is niet bekend. Anders, 2-5 µg antilichaam is een redelijke beginbedrag te gebruiken. Gebruik ChIP-grade antilichamen waar mogelijk, of antilichamen die zijn gevalideerd voor immunoprecipitation.</li>
</ol>2. dag 2: Verzameling van de immuuncomplexen
<ol><li>50 µL van eiwit A Agarose 50% drijfmest toevoegen aan de immuuncomplexen en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met rotatie van 150 toeren per minuut.</li>
	<li>
Pellet de kralen door centrifugeren voor 1 min bij 100 x g bij 4 ° C. Uitvoeren van sequentiële wasbeurten van de parels met buffers striktheid te verhogen.
	<ol>
<li>Eerst wassen met lage-zout was buffer (150 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM; Triton-X 1%; SDS 0.1%), dan met hoge-zout was buffer (500 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM, Triton-X1%; SDS 0.1%), dan met LiCl wash (0,25 M LiCl; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 mM; Igepal 1%; deoxicholate 1%), en ten slotte met 1 x TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).</li>
		<li>Alle wast op 0,45 µm PVDF-centrifugaal filteren kolommen (Tabel van materialen) door de eerste overdracht van de kralen in de kolommen met behulp van 500 µL van lage-zout was buffer uitvoeren De parels in de kolommen voor de 3 min bij 2.500 x gpellet. Negeren de doorstroming en 1 keer voor alle de wash buffers vermeld in stap 2.2.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat de wast zijn voltooid, elueer de immuuncomplexen door toevoeging van 300 µL van elutie buffer 1% SDS, 0,1 M-NaHCO-3) aan de Ingehuld kralen in de kolommen. Incubeer bij RT gedurende 30 minuten in een roteerapparaat bij 400 t/min. Het verzamelen van het eluaat door spinnen kolommen voor 3 min bij 2.500 x g in een verse buis.</li>
	<li>Omgekeerde de crosslinks door het eluaat en ingangen aan het broeden verzameld in stap 1.9 bij 65 ° C's nachts.</li>
</ol>3. dag 3: Herstel van DNA met fenol/Chloroform extractie
<ol><li>Voeg 300 µL van fenol: chloroform: IAA, 1:1 met de eluaat en ingangen. Vortex voor 10 s.</li>
	<li>Spin bij 4 ° C gedurende 15 minuten staan bij 21.000 x g. Het supernatant overbrengen in een verse buis. Voeg 3 µL van glycogeen, 30 µL van 3 M natriumacetaat en 750 µL van koude 100% ethanol. Vortex voor 10 s. winkel bij-80 ° C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Spin down bij 21.000 x g bij 4 ° C gedurende 20 minuten, houdt de pellet en verwijder het supernatant. Wash pellet met 1 mL koude 70% EtOH, dan draai naar beneden bij 21.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en drogen van de pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 70 ÂµL van DNAse-gratis water.</li>
	<li>Gaat u verder met stap 4 voor het testen van chromatine bezetting op specifieke regio genomic's door kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) of met stap 5 voor te bereiden op monsters sequencing.</li>
</ol>4. analyse van de ChIP met behulp van qPCR (Single/Multiple genen uitlezing)
<ol><li>Verdun de ingang DNA voor stap 3.4 voor het genereren van een standaard referentie-curve. Seriële verdunningen van 1/10, 1/100, 1/1000 zijn meestal voldoende om vast te leggen van het lineaire bereik, maar verder verdunningen mogelijk vereist voor geconcentreerder monsters.</li>
	<li>Voor elk paar primer (hier, wij hebben gebruikte inleidingen gericht op NDUFV1 en TOMM20 initiatiefnemers), bereiden van twee sets van qPCR Reacties: met behulp van de verdunde input monsters van stap 4.1, en een tweede met de DNA-monsters geïsoleerd door immunoprecipitation uit stap 3.4. Elke reactie in drievoud uitvoeren. Opmerking: Reacties kunnen worden ingesteld in parallel laten werken voor meerdere genen met behulp van 96 - of 384-Wells-platen.</li>
	<li>Instelt op een volume van de reactie van 10 μL per putje met 5 μl van 2 x PCR mix (Tabel of Materials), 1 μL van primer mix (1 μM voorwaartse primer en omgekeerde primer 1 μM), en 4 μL van DNA van ChIP (of de invoercontrole).</li>
	<li>Kort draaien naar beneden van de plaat.</li>
	<li>Voer de qPCR reacties op een real-time PCR-systeem met behulp van het protocol door de fabrikant voor reagens detectie (Tabel of Materials) aanbevolen. Hier hebben we gebruik gemaakt van de volgende voorwaarden: 1) 1s bij 95 ° C gedurende 1 cyclus; 2) 1 s bij 95 ° C, gevolgd door 20 bij 60 ° C voor 45 cycles; s 3) 15 s bij 95 ° C, gevolgd door 60 bij 60 ° C s gevolgd door 15 s bij 95 ° C gedurende 1 cyclus. Opmerking: Controleer de dissociatie curve: de aanwezigheid van een piek in de thermische dissociatie plot suggereert een één amplicon van de PCR reactie wordt gegenereerd. Als meer dan één piek is gevisualiseerd, is dit een potentieel indicatie van meerdere, niet-specifieke waarbij; in dat geval raden we het ontwerp van alternatieve primerparen.</li>
	<li>Bepalen de lineaire fase van exponentiële versterking van de PCR reactie voor elke primer ingesteld door het berekenen van de standaard curve met behulp van de reeks van verdunde genomic DNA in stap 4.1. volgens de waarde van de Ct (cyclus drempel).</li>
	<li>Als de waarde van de Ct van DNA van ChIP en invoercontrole zich binnen de lineaire bereik van Ct-waarde, berekenen de verrijking van DNA van ChIP ten opzichte van de input, volgens de verdunningsfactor van DNA van ChIP en invoercontrole in stap 4.1.</li>
</ol>5. versterking van DNA van ChIP voor High-throughput Sequencing (genoom-brede uitlezing)
Opmerking: Deze stap kan worden uitbesteed aan een academische kern faciliteit of commerciële sequencing bedrijf wanneer sequencing mogelijkheden niet beschikbaar in eigen huis zijn.
<ol><li>Bereiden van een DNA-bibliotheek van de geëxtraheerde DNA met een passende ChIP bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Volgnummer van de bibliotheek op een high-throughput rangschikkend systeem, met behulp van 50 bp single-end als uitlezing (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Volgens de richtlijnen van de ChIP-seq ENCODE6voorstelde, wordt een minimum van 10 miljoen leest aanbevolen voor zoogdieren genomen.</li>
</ol>6. rauwe Data-analyse
<ol><li>Kwaliteitscontrole op ruwe sequencing leest met behulp van FastQC8uitvoeren. Opmerking: Gemeenschappelijke sequencing kwaliteit statistieken omvatten per basis volgorde kwaliteit, per basis reeks inhoud, per reeks GC inhoud, volgorde lengte en volgorde dubbel niveaus. In het algemeen een lees kwaliteitsscore van Q > 30 over elke basis positie is indicatief van kwalitatief hoogwaardige rangschikkend resultaten. Distributie van GC content over alle leest moet ongeveer lijken op een normale verdeling, met een piek rond de soort werkelijke genomic GC inhoud percentage.</li>
	<li>Verwijder eventuele sequencing adapter besmetting en lage kwaliteit leest via het trimmen van nut Trimmomatic9lezen. Opmerking: De uitgevoerde standaardparameters opgeven de opheffing van platform afhankelijke adapters, verwijderen van toonaangevende en naloopspaties bases van lage kwaliteit, en het gebruik van een 4-base breed schuifraam aan trim leest wanneer de gemiddelde kwaliteit per base druppels dan een opgegeven drempelwaarde.</li>
	<li>Verwerkte leest tot en met de muis MM10 referentie genoom10 uitlijnen met de Bowtie2 aligner11 met behulp van de standaardparameters.</li>
	<li>Uitgelijnde leest filteren verwijderen die met een Bowtie2 toewijzing kwaliteit score (MAPQ) van minder dan 10 met behulp van Samtools12.</li>
	<li>Bepalen verschillende na uitlijning kwaliteit statistieken zoals percentage leest toegewezen, strand cross-correlatie, cumulatieve lezen dekking, en monster repliceren reproduceerbaarheid. Opmerking: Diverse pakketten met inbegrip van SPP13, ChIPqc14, en Deeptools15 zijn beschikbaar voor het berekenen van de statistieken van deze kwaliteit.</li>
	<li>Piek aanroepende analyses uitvoeren met een besturingselement voor tekstinvoer of passende steekproef van de KO de MACS algoritme (MACS2)16 met standaardparameters.</li>
	<li>Verwijder eventuele genaamd bergtoppen die overlappen met bekende op de zwarte lijst regio's17 van de mm10 aantekening met Bedtools18. Opmerking: Op de zwarte lijst gebieden zijn gebieden in het genoom van waaruit is gebleken dat hoog signaal of lees graven onafhankelijk van cellijn of sequencing techniek. Deze regio's weergeven kunstmatig hoog artefact signalen in bepaalde gebieden van het genoom die uit functionele genoom sequencing experimenten kunnen worden gefilterd. Alle replicatieonderzoeken onafhankelijk moeten worden verwerkt door de pipeline en kunnen vervolgens worden gebruikt voor irreproducibility ontdekking tarief (IDR). IDR wordt gebruikt voor het meten van de reproduceerbaarheid van de resultaten tussen de duplo's door middel van de methode, zoals beschreven door Li, Brown, Huang en Bickel19,20. De IDR-methode kwantitatief beoordeelt de samenhang tussen de duplo's en wordt aanbevolen door de CODEER- en modENCODE als onderdeel van hun ChIP-seq-richtlijnen.</li>
	<li>Statistisch significant pieken gebruiken voor verschillende downstream analyses zoals gene ontologie21,22, verrijking of motief analyse23.</li>
</ol>

<ol><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li>
<li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li>
<li>Emmett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+3+prepares+brown+adipose+tissue+for+acute+thermogenic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+binds+MED1+and+controls+chromatin+architecture+to+determine+a+brown+fat+transcriptional+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program.</a> Genes & Development. , (2015).</li>
<li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes & Development. , (2017).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Differentiation+of+Stromal+Vascular+Cells+to+Beige%2FBrite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50191(2013).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).</li>
<li>Genome Browser Gateway. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 ">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 </a> (2018).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. , 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+alignment%2Fmap+%28SAM%29+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li>
<li>Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+artifact+removal+on+ChIP+quality+metrics+in+ChIP-seq+and+ChIP-exo+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data.</a> Frontiers in Genetics. 5, 75(2014).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+A+next+Generation+Web+Server+for+Deep-Sequencing+Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis.</a> Nucleic Acids Research. , (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, R137(2008).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reproducibility+of+high-throughput+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Statistics%22%5BJournal%5D)">Measuring reproducibility of high-throughput experiments.</a> Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).</li>
<li>Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://github.com/nboley/idr ">https://github.com/nboley/idr </a> (2018).</li>
<li>The Gene Ontology Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+Gene+Ontology+Knowledgebase+and+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources.</a> Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).</li>
<li>Boeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genomic+Sequence+Motifs+for+Deciphering+Transcription+Factor+Binding+and+Transcriptional+Regulation+in+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells.</a> Frontiers in Genetics. 7, 24(2016).</li>
</ol>

Het protocol beschreven hier vertegenwoordigt een waardevol instrument voor het uitvoeren van ChIP lymfkliertest weefsel, specifiek geoptimaliseerd voor bruin vetweefsel. Een van de grotere uitdagingen bij het uitvoeren van ChIP van weefsel is een voldoende aantal cellen herstellen tijdens de bereiding. Scheren van de VLEERMUIS met behulp van een weefsel homogenizer mixer in combinatie met RVS kralen in plaats van een canonieke glas stamper aanzienlijk vermindert het aantal cellen verloren wegens ongebroken weefsel. Bove...

Terwijl het witte vetweefsel (WAT) is gespecialiseerd voor energieopslag, verdrijft bruin vetweefsel (BAT) energie in de vorm van warmte vanwege zijn vermogen om te zetten van koolhydraten en lipiden in thermische energie via mitochondriaal ontkoppelingseiwit1. Vanwege deze gespecialiseerde functie is het depot BAT vereist voor onderhoud van lichaamstemperatuur in fysiologische omstandigheden en in reactie op koude blootstelling. Terwijl gen expressie veranderingen tijdens BAT differentiatie en op thermogene stress zijn uitvoerig bestudeerd in vivo en in vitro, zijn de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze veranderingen meestal ontleed in vereeuwigd cellijnen en primaire pre-adipocytes, met uitzondering van verschillende in vivo onderzoek2,3,4,5.
Regulering van de specifiek gen expressie programma's via transcriptionele verordening wordt bereikt door gecoördineerde veranderingen in chromatine structuur via verschillende transcriptie factoren en factoren samen acties. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een waardevolle moleculaire biologie-aanpak voor onderzoek naar de aanwerving van deze factoren tot DNA en profilering van de bijbehorende wijzigingen in de chromatine landschap. Sleutelfactoren voor het welslagen van ChIP experimenten omvatten optimalisaties van crosslinking voorwaarden en schuintrekken consistentie van de chromatine gedurende verschillende monsters, beschikbaarheid van voldoende grondstof, en, vooral, de kwaliteit van de antilichamen. Bij het uitvoeren van ChIP uit hele weefsels, het is ook belangrijk om te overwegen de heterogeniteit van de monsters en optimaliseren van het protocol ter verbetering van de efficiëntie van isolatie van de kernen, met de laatste wordt een bijzonder gevoelige stap bij het werken met vetweefsel moet het verhoogde vetgehalte. In feite, moleculaire isolatie technieken uit hele obesitas depots worden bemoeilijkt door de aanwezigheid van hoge niveaus van triglyceriden, en protocollen moeten worden geoptimaliseerd om de verhoging van het bedrag van de chromatine isolatie. Ten slotte, als high-throughput sequencing wordt uitgevoerd na ChIP-DNA isolatie, de sequencing diepte is van cruciaal belang voor het bepalen van het aantal pieken die vol vertrouwen worden gedetecteerd.
Hier verwijzen we naar de arbeidsvoorwaarden en de algemene richtsnoeren voor de ChIP-seq experimenten aanbevolen door de ENCODE en modENCODE consortia6 voor beste praktijken, en richten we ons op een stapsgewijze beschrijving van een protocol dat is geoptimaliseerd voor ChIP-seq van BAT. Het beschreven protocol zorgt voor efficiënte isolatie van de chromatine van vetweefsel sequentiebepaling van het genoom-brede uitvoeren voor DNA-bindende factoren met welomschreven pieken evenals Histon merken met meer diffuus signalen.

<table><tbody><tr><td>Bullet Blender Tissue Homogenizer&nbsp;</td><td>Next Advence&nbsp;</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen kralen 3,2 mm diameter</td><td>Next Advence&nbsp;</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Sonicator</td><td>Diagenode</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Micro Tube TPX Plastic&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-5</td><td></td></tr><tr><td>Complete-Protease remmer</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Protein A Agarose Slurry&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>101041</td><td></td></tr><tr><td>GPS2 antilichaam</td><td>In house</td><td></td><td>Konijn polyklonaal, Ct antilichaam (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td></tr><tr><td>Pol2 antilichaam&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15100055</td><td></td></tr><tr><td>h3K9me3 antilichaam</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>05-1242</td><td></td></tr><tr><td>Fast Syber Green Master Mix</td><td>Aplied Biosytem</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7</td><td>Aplied Biosytem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq ChIP Library Preparatie Kit</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>IP-202-1012</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000&nbsp;</td><td>Illumina&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chromatine immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Meest cellulaire processen worden gereguleerd door transcriptionele modulatie van de specifiek gen programma's. Dergelijke modulatie wordt bereikt door de gecombineerde acties van een breed scala van transcriptiefactoren (TFs) en cofactoren bemiddelen transcriptionele activering of repressie via veranderingen in de structuur van de chromatine. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een nuttige moleculaire biologie benadering van toewijzing histone modificaties en profiling transcriptie factoren/cofactoren binden aan DNA, waardoor een momentopname van de dynamische nucleaire veranderingen tijdens verschillende biologische processen.
Studeren transcriptionele verordening in adipeus weefsel, monsters die zijn afgeleid uit in vitro celculturen van vereeuwigd of primaire cellijnen zijn vaak favoriet in ChIP tests vanwege de overvloed van de grondstof en verminderde biologische variabiliteit. Deze modellen zijn echter een beperkte opname van de staat van de werkelijke chromatine in levende organismen. Dus, is er behoefte aan een kritische geoptimaliseerde protocollen op te voeren ChIP adipeus weefselmonsters afgeleid van diermodellen.
Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte ChIP-seq van zowel histone modificaties en niet-Histon eiwitten in bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Het protocol is geoptimaliseerd voor het onderzoeken van genoom-brede lokalisatie van proteïnen van belang en epigenetische markers in de BAT, oftewel een morfologisch en fysiologisch verschillend weefsel onder vet depots.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> Figuur 1: ChIP validatie door qPCR. ChIP-qPCR analyse van vertegenwoordiger GPS2 target genen NDUFV1 (links) en TOMM20 (rechts) in de KNUPPEL van WT en GPS2-AKO muizen, relatieve veranderingen in het niveau van H3K9 methylation en GPS2 en Pol2 binding tonen. De staafdiagrammen vertegenwoordigen het steekproefgemiddelde van 3 replicatieonderzoeken met * p < 0,05 en ** p < ...

Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door high-throughput DNA sequentiebepaling (ChIP-seq) van bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Dit protocol is geschikt voor zowel mapping histone modificaties en genoom-brede lokalisatie van niet-Histon proteïnen van belang in vivoonderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

De gemeten het wordt gebruikt voor het uitvoeren van efficiënte ChIP sequencing van zowel ester en niet-ester eiwitten in bruin lipide weefsel geïsoleerd van de muis. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat het protocol is geoptimaliseerd voor een efficiënte immunoprecipitatie van chromatine-geassocieerd complex uit het lipideweefsel. Voor incisie, spray de geëuthanaseerde muis met 70%ethanol.Plaats de muis met de rug naar boven gericht, maak dan een incisie langs de nek. Vervolgens, gelegen BAT direct onder de huid tussen de schouders en verwijder voorzichtig de dunne laag wit vet. Cross-link elke BAT pad in 10 milliliter PBS met 1% formaldehyde gedurende 15 minuten bij 150 RPM bij kamertemperatuur.Na 15 minuten, blus kruisverband door 2,5 molaire glycine toe te voegen aan de BAT, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 125 millimolar. Plaats het op een shaker gedurende vijf minuten, draaien op 150 RPM bij kamertemperatuur. Breng vervolgens de BAT-pad over op 500 microliters hypotonische lysebuffer en voeg twee roestvrijstalen kralen toe voor elke BAT-pad.Gebruik vervolgens een op kraal gebaseerde weefselhomogenisator om het weefsel te versnipperen. Begin me

chromatin-immunoprecipitation-of-murine-brown-adipose-tissue

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De hier gepresenteerde methode gebruikt 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emissie tomografie / computertomografie (PET-CT) en vet-water gescheiden magnetische resonantie beeldvorming (MRI), elk afgetast na 2 uur blootstelling aan thermisch (24 ° C ) en koude omstandigheden (17 ° C) om bruin vetweefsel (BAT) bij volwassen proefpersonen kaart.

Human Brown VetWeefsel Depots automatisch gesegmenteerd op basis van Positron Emissie Tomografie / Computed Tomography en geregistreerde Magnetic Resonance Images

Wij presenteren een protocol op basis van filtratie om hoogwaardige kernen te isoleren van de cross-linked museskeletspier waarbij we de behoefte aan ultracentrifugatie hebben verwijderd, waardoor het gemakkelijk toepasbaar is. We laten zien dat chromatine bereid uit de kernen geschikt is voor chromatine immunoprecipitatie en waarschijnlijk chromatin immunoprecipitatie sequencing studies.

Een filtratie-gebaseerde methode om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier voor chromatine immunoprecipitatie te bereiden

Een nieuw protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren aangepast aan de studie van genregulatie in spiervezels door chromatine immunoprecipitation wordt gepresenteerd.

Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren

Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Deze studie beschrijft een nieuwe methode voor het isoleren van muizenbruine adipocyten voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Hier bieden we een praktische procedure voor het ontleden en uitvoeren van histologische en genexpressie-analyses van supraclaviculair bruin vetweefsel bij muizen.

Dissectie, histologische verwerking en genexpressieanalyse van supraclaviculaire bruine vetweefsel bij muizen

Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.

Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen

Leer chromatine immunoprecipitatie van bruin vetweefsel bij muizen voor genomische analyse van histonmodificaties en eiwit-DNA-interacties in metabolisme-onderzoek.

Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel

Meer video's verkennen