Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vetbiologie veld, zoals hoe intercellulaire interacties en vetweefsel fysiologie veranderen op verschillende metabole voorwaarden zoals vasten en obesitas. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het optimaal behoudt de oorspronkelijke vet 3D-structuur en vermijdt lange verwerking stappen die meestal nodig zijn voor conventionele immunohistochemie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structuur van het vetweefsel, kan het ook worden toegepast op andere orgaansystemen, zoals het zenuwstelsel, door de hersenen in het hele vat te bevlekken.

Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen vanwege de moeilijkheden bij het verkrijgen van eigendom weefsel sites, het vinden van de juiste fixatie periode, en de optimale concentratie van antilichamen. Nadat de dissectie is voltooid, breng je de schotel met de weefselmonsters in 1% paraformaldehyde gedurende een uur van het ijs naar kamertemperatuur. Breng vervolgens de weefsels over naar een celkweekplaat van 12 of 24 goed voor een snellere wasbeurt.

Het is belangrijk om te onthouden dat de hele montage kleuring procedure moet onmiddellijk beginnen na dissectie en dat er geen pauze punten tussen elke stap. Was de weefsels met PBS-0.3T op een shaker gekanteld op 22 graden met een snelheid tussen 20 en 25 kantelt per minuut bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Herhaal deze was twee keer extra.

Voeg hierna ongeveer 0,5 tot een milliliter blokkeerbuffer toe met 5%dierlijk serum. Broed de plaat op een shaker met behulp van de vorige voorwaarden voor een uur. Aspirate de blokkerende oplossing, en voeg op milliliter van primaire antilichamen verdund in PBS-0.3T met 1%dier serum aan elke put.

Incubeer de plaat 's nachts op een shaker bij vier graden Celsius met een kanteling van 22 graden en een snelheid van 20 tot 25 kantelt per minuut. De volgende dag gebruikt u PBS-0.3T om de weefsels vijf minuten op kamertemperatuur te wassen. Herhaal deze was twee keer extra.

Voeg vervolgens tussen 0,5 en een milliliter geschikte en verdunde secundaire antilichaamoplossingen toe aan elke put. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en broed het een uur lang op een shaker bij kamertemperatuur. Daarna was je de plaat twee keer met PBS-0.3T op kamertemperatuur gedurende vijf minuten per wasbeurt.

Als visualisatie van vloeibare druppels nodig is tijdens de neutrale lipide vlek, was twee keer met 1x PBS met elke wasbeurt van vijf minuten. Voeg de neutrale lipidevlek verdund in PBS toe en broed 30 minuten op kamertemperatuur. Om te beginnen met beeldvorming, gebruik tangen om het weefsel plat te leggen op een 24 bij 60 millimeter glazen deksel slip.

Als nuclei vlekken met DAPI gewenst is, voeg een tot twee druppels van een montagemedium dat DAPI bevat om het weefsel volledig onder te dompelen en te voorkomen dat het drogen. Plaats vervolgens de dia op een omgekeerd confocale lasermicroscoopsysteem. Om beelden van geheel gemonteerd gekleurd weefsel op meerdere brandpuntsvlakken te verkrijgen, voert u Z-stapels van 100 tot 150 micrometer diepte uit met een stapgrootte van vier tot zes micrometer bij de gewenste vergroting.

In deze studie wordt kleuring in het hele vat gebruikt om de architectuur van vetweefsel te behouden. In tegenstelling tot methoden die meerdere verwerkingsstappen en secties omvatten, wat kan leiden tot verminking van de vetweefselmorfologie, kan de kleurwijze van het hele vat zich de morfologie van adipocyten behouden, wat de nauwkeurigheid garandeert bij het interpreteren van resultaten. Overfixatie van vetweefsel leidt tot fixatief geïnduceerde fluorescentie, die kan worden aangegeven door overlappende identieke gebieden, zoals in de tyrosine hydroxylase en PECAM-1 signalen hier gezien.

Goed vaste, hele-mount vlek monsters, echter, tonen aparte en duidelijke signalen, wat aangeeft dat deze signalen zijn niet autofluorescentie. Imaging whole-mount gekleurd vetweefsel zorgt voor de kwantificering van morfologische veranderingen onder verschillende experimentele omstandigheden. In het bijzonder, vetweefsel is zeer gevasculariseerd, wat belangrijk is bij het bemiddelen van metabole homeostase op snelle veranderingen in het energieniveau.

Bijvoorbeeld, C57 zwarte 6J muizen, die ondergaan 24 uur van het vasten, tonen een aanzienlijk kleinere adipocyte grootte, die lipolyse aangeeft, en een trend in verhoogde bloedvatdichtheid in vergelijking met continu gevoede muizen. Het wissen van vetweefsel met iDISCO+ maakt het mogelijk om vetweefsels optisch transparant te maken. Immunolabeling van vetweefsel dat is gegaan door weefsel clearing toont veel dichter neurale arborisatie in vergelijking met die waargenomen in de hele montage kleuring zonder weefsel clearing op dezelfde vergroting.

Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden niet om uw monsters te overfixen voor meer dan een uur op kamertemperatuur in PFA, anders zal dit verhogen achtergrond autofluorescentie. Deze fixatieperiode kan echter worden verlengd als monsters worden vastgesteld op vier graden Celsius. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals kwantificering met ImageJ worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe cellulaire architectuur, zoals adipocytesites en bloedvatdichtheid, veranderen in reactie op verschillende fysiologische aandoeningen.