Name: Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Ontdek whole-mount immunostaining voor 3D-beeldvorming van witte adipose weefselarchitectuur en celcomponenten. Deze methode behoudt de oorspronkelijke 3D-structuur en voorkomt vervorming bij metabole aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Raad (NSERC) van Canada, Pilot en haalbaarheid studie Grant Banting & beste Diabetes centrum (BBDC), het startfonds SickKids aan H-K. S., medische Research Center Program (2015R1A5A2009124) door de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomst van plan om J-R.K.

Alle experimentele dierlijke protocollen werden goedgekeurd door het dier Care Comité van het centrum voor Phenogenomics (TCP) gelijkvormig aan de normen van de Canadese Raad op Animal Care. Muizen werden gehandhaafd op 12 uur licht/donker cycli en voorzien van gratis toegang tot water en voedsel. 7 maand oude C57BL/6J mannelijke muizen werden gebruikt in het geheel-mount kleuring experiment.
Opmerking: Secties 1 tot en met 2 zijn in chronologische volgorde, met punt 3 wordt een optionele stap direct na sectie 1. Afdeling 4 kan worden uitgevoerd voor het analyseren van adipocyte grootte en bloedvat dichtheid na de voltooiing van sectie 2.
1. materialen voorbereiding en weefsel isolatie
<ol><li>Het bereiden van vers 1% paraformaldehyde (PFA) verdund in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor fixatie van het weefsel. Bereiden van 0,3% nonionic oppervlakteactieve stof verdund in 1 x PBS (hierna te noemen de PBS-0.3T) voor latere weefsel wassen stappen. Opmerking: Voor elk weefsel, bereiden ongeveer 1,5 mL 1% PFA om ervoor te zorgen volledige onderdompeling. Fixatie volume kan worden verhoogd of verlaagd afhankelijk van de grootte van het weefsel. Let op: Deze stap is gevaarlijk, aangezien PFA bijtende en giftige. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, schoeisel, veiligheidsbril) en handvat in een zuurkast.</li>
	<li>Euthanaseren dieren volgens een goedgekeurde procedure (bijvoorbeeld, cervicale dislocatie en/of kooldioxide verstikking). Onverwijld, ontleden de gewenste adipeus weefsel depots (b.v., inguïnale witte vetweefsel of perigonadal witte vetweefsel)18.</li>
	<li>Met een dissectie schaar, snijd het weefsel op een 100 x 15 mm2 petrischaal in stukken ongeveer 0,5 – 1 cm groot, en hen te onderdompelen in microcentrifuge buizen gevuld met 1% PFA. Houd op ijs.</li>
</ol>2. geheel-mount kleuring van witte vetweefsel
<ol><li>Nadat dissectie voltooid is, verplaatst u de weefselmonsters in 1% PFA uit het ijs tot kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur, en vervolgens de weefsels overbrengen in een 12 - of 24-well cel cultuur plaat voor sneller wassen.</li>
	<li>Wassen van de weefsels met PBS-0.3T, 3 keer gedurende 5 minuten elk op RT op een shaker gekanteld op 22 °, met 20 tot 25 kantelt per min als de snelheid. Opmerking: Gebruik deze tilt en snelheid voor alle volgende stappen met behulp van een shaker. Opmerking: Als de opdrachtregel multicolor verslaggever muis zoals mT/mG en extra antilichaam kleuring is niet nodig, het weefsel is klaar voor microscopie na stap 2.2.</li>
	<li>Voeg toe 0,5 – 1 mL blokkeerbuffer (dierlijke serum 5% verdund in PBS-0.3T). Zet de plaat op het schudapparaat en incubeer gedurende 1 h in RT.</li>
	<li>De blokkerende oplossing gecombineerd en toevoegen van primaire antilichamen verdund in PBS-0.3T met 1% dierlijke serum.</li>
	<li>Plaats de plaat op een shaker bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>De volgende dag wassen de weefsels met PBS-0.3T 3 keer voor 5 minuten elk in RT.</li>
	<li>Gebruiken van passende secundaire antilichamen verdund in PBS-0.3T. Voeg toe 0,5 – 1 mL secundair antilichaam oplossingen aan elk putje. De plaat wikkel in aluminiumfolie en Incubeer het op een shaker gedurende 1 uur bij RT. Opmerking: Verdun het secundaire antilichaam in het donker om te voorkomen dat photobleaching.</li>
	<li>Na incubatie van secundair antilichaam, wassen met PBS-0.3T tweemaal voor 5 min, elk in RT. Image de monsters als een neutrale lipide vlek is niet gewenst. Als visualisatie van lipide druppels nodig met behulp van de neutrale lipide vlek, wassen met 1 x PBS (zonder niet-ionogene oppervlakteactieve stof) tweemaal, voor elke 5 min.</li>
	<li>Na de stappen wassen, incubeer met de vlek van de neutrale lipide verdund met 1:1500 verdunningsfactor in 1 x PBS gedurende 30 min. in RT. De weefsels zijn nu klaar voor microscopie. Voor toekomstige beeldvorming, kunnen de weefsels worden opgeslagen in deze oplossing in 4 ° C. Opmerking: Imaging kwaliteit vermindert na verloop van tijd; Daarom is de beste tijd voor imaging binnen 1 of 2 dagen.</li>
	<li>Met behulp van Tang, leg het weefsel plat op een 24 x 60 mm² glas dekglaasje aan en plaats deze op een omgekeerde confocal microscoop lasersysteem.</li>
	<li>Als de kleuring van de kernen met DAPI is gewenst, voeg 1-2 druppels montage medium dat DAPI om volledig onderdompelen het weefsel en te voorkomen dat het drogen.</li>
	<li>Uitvoeren om te halen beelden van geheel-mount bevlekt weefsels op meerdere focal vlakken, Z-stacks van 100 – 150 μm in de diepte met 4 – 6 μm stap-grootte op de gewenste vergroting.</li>
</ol>3. de weefsels Clearing- en Immunolabeling gebruikt iDISCO +
Opmerking: Dit protocol is gebaseerd op eerder gepubliceerde procedures9,10,19.
<ol><li>Fixatie en methanol voorbehandeling<ol>
<li>Incubeer de weefsels in 4% PFA verdund in 1 x PBS bij 4° C's nachts in 2 mL microcentrifuge buizen. Opmerking: Laat de weefsels in de buizen 2 mL voor alle van de volgende behandelingen tot imaging.</li>
		<li>De volgende dag, spoel de weefsels in 1 x PBS driemaal, gedurende 1 uur op een shaker op RT. Opmerking: Deze stap kan worden een onderbreken punt om te vertrekken het monster 's nachts bij RT of 4 ° C.</li>
		<li>Uitdrogen van de weefsels op RT in 20%, 40%, 60% en 80% methanol, vervolgens voor elk 1U. Dehydrateren in 100% methanol op RT voor 1 uur, vervolgens de weefsels overbrengen in vers 100% methanol en Incubeer bij 4 C gedurende 1 uur. Opmerking: Verdunde methanol in gedestilleerd water. Tijdens methanol incubatie is er geen behoefte om monsters op een shaker, zolang de weefselmonsters worden ondergedompeld. Let op: Deze stap is gevaarlijk, zoals methanol giftig is. Het is ontvlambaar bij open vlammen. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril) en verwerken in een zuurkast. Bewaar de methanol uit de buurt van ontsteking en in een brandbare veiligheidskast.</li>
		<li>De weefsels met 5% waterstof peroxide (H2O2; 1 volume van 30% H2O2 verdund in 5 volumes van 100% methanol) 's nachts bleekmiddel bij 4 ° C. Let op: 30% waterstofperoxide is zeer gevaarlijk bij huid- en oogcontact. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril) en verwerken in een zuurkast.</li>
		<li>Hydrateren de weefsels op RT in 80%, 60%, 40% en 20% methanol en 1 x PBS, vervolgens voor elk 1 uur.</li>
		<li>Wassen met 0,2% nonionic oppervlakteactieve stof verdund in 1 x PBS twee keer, voor 1 h op een shaker op RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunolabeling Opmerking: Vul de 2 mL buisjes met het weefsel naar de top van de buis met de oplossing die in elke stap wordt gebruikt om te voorkomen dat weefsel oxidatie zodra immunolabeling begint, totdat clearing is voltooid.<ol>
<li>Permeabilize de weefsels door ze aan het broeden in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% nonionic oppervlakteactieve stof, 20% dimethylsulfoxide (DMSO) en 0,3 M glycine bij 37 ° C op een roteerschudapparaat uit bebroede-tafelblad voor 2 dagen. Opmerking: De maximale incubatietijd voor 37 ° C permeabilization stap is 2 dagen.</li>
		<li>Het blokkeren van de weefsels in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% nonionic oppervlakteactieve stof, 10% DMSO, 5% ezel serum en 1% Fc blok bij 37 ° C op een roteerschudapparaat uit bebroede-tafelblad voor 2 dagen. Opmerking: De maximale incubatietijd voor de blokkerende stap is 2 dagen.</li>
		<li>Incubeer de weefsels in primaire antilichamen van belang in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% Polysorbaat 20, 10 µg/mL heparine, 5% DMSO en 5% ezel serum bij 37 ° C op een bebroede tafelblad roteerschudapparaat voor 4 dagen.</li>
		<li>Wassen met 1 x PBS, 0,2% Polysorbaat 20 en 10 µg Fe/mL heparine in een roteerapparaat bij RT vijfmaal, elk gedurende 1 uur. Opmerking: Deze stap kan zijn een punt van de pauze om te laten van monsters overnachten in RT.</li>
		<li>Incubeer weefsels met secundair antilichaam in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% Polysorbaat 20, 10 µg/mL heparine, en 5% ezel serum bij 37 ° C op een tafelblad roteerschudapparaat voor 4 dagen. Opmerking: Vanaf stap 3.2.5, alle monsters moeten worden omwikkeld met aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching van secundair antilichaam.</li>
		<li>Wassen van weefsels in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% Polysorbaat 20 en 10 µg Fe/mL heparine op een shaker in RT vijfmaal, voor elke 2 h. Opmerking: Deze stap kan worden een onderbreken punt om te vertrekken van de monsters 's nachts op RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Weefsel ruimen van witte vetweefsel en volume imaging<ol>
<li>Uitdrogen van de weefsels opgenomen in 2 mL buizen door broeden in 20%, 40%, 60% en 80% methanol, vervolgens, elk gedurende 1 uur op RT. Vervolgens het uitdrogen van de monsters in 100% methanol tweemaal op RT. Opmerking: Deze stap kan worden een onderbreken punt om te vertrekken uw monsters in 100% methanol's nachts op RT.</li>
		<li>Incubeer de weefsels met een mengsel van 2 delen van DCM 1 volume van methanol gedurende 3 uur bij RT op een shaker. Opmerking: DCM is vluchtig. Zorg ervoor dat de buizen zijn strak verzegeld om te voorkomen dat de verdamping. Let op: Deze stap is gevaarlijk. DCM is giftig bij inademing. Langdurige blootstelling kan potentieel veroorzaken chemische brandwonden. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, schoeisel, veiligheidsbril). Gebruik een zuurkast.</li>
		<li>De weefsels in 100% DCM tweemaal, Incubeer gedurende 15 minuten op een shaker op RT.</li>
		<li>Incubeer in 100% DBE in RT tot beeldvorming en van de opslagcapaciteit van de steekproef. Omkeren voor imaging, meerdere malen op de buizen te mengen de oplossingen. Opmerking: Vul volledig buizen met DBE ter voorkoming van oxidatie, die kan resulteren in een mislukte weefsel wissen. De buizen niet schudden tijdens DBE incubatie. Let op: Deze stap is gevaarlijk. DBE is giftig. Het kan irritatie aan de ogen en de huid. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril) en verwerken in een zuurkast.</li>
		<li>Afbeelding het hele weefsel monster met een lichte Microscoop die overeenkomt met de brekingsindex van organische oplosmiddelen DBE. Presteren Z-stapelen op een gewenste vergrotingsfactor en de stap-grootte voor het hele weefsel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. voorbeelden van Data-analyse uit geheel-mount gekleurd weefsel beelden met behulp van ImageJ
Opmerking: Zie https://imageJ.nih.gov/ij/download.html voor download en installatie-instructies.
<ol><li>Kwantificering van bloedvat dichtheid (aanvullende Figuur 2)<ol>
<li>De opgeslagen beelden van alleen het kanaal met bloedvat immunokleuring op ImageJ importeren. Opmerking: De afbeeldingen voor de kwantificering moet consistent in termen van kleuring procedure en afbeelding overname voorwaarde. Identieke reagentia moeten worden gebruikt. De belichtingstijd, moet intensiteit en vergroting ook gelijkgesteld in de beeldvorming proces20.</li>
		<li>De kleur van de afbeelding converteren naar zwart-wit voor bloedvat dichtheid kwantificering. Om dit te doen, onder tabblad "Afbeelding" , de "Aanpassen" -opdracht, dan de "kleurdrempel" -optie te selecteren. In de "drempel kleur" weergeven, kies "Donkere achtergrond"20 en selecteer "B & W" onder "drempel kleur".</li>
		<li>Voor het meten van het percentage van ruimte van bloedvat signaal tegen achtergrond, selecteer het tabblad "Analyseren" , vervolgens de opdracht "analyseren Particles" . Selecteer onder de display van de "geanalyseerd Particles", de "duidelijke resultaten" en "Samenvatten" opties. Klik op "OK".</li>
		<li>Kopieer en plak de waarde van het percentage gebied onder het tabblad Samenvatting in een spreadsheet voor analyse. Het percentage van ruimte geeft de dichtheid van het bloedvat. Herhaal de stappen 4.3.1–4.3.4 voor elke afzonderlijke afbeelding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificering van adipocyte grootte21 (aanvullende Figuur 3)<ol>
<li>De opgeslagen beelden van de adipocytes op ImageJ importeren.</li>
		<li>Meet de lengte van de schaal in pixels door het traceren van de lijn naar de schaal met een bekende afstand op de afbeelding met het lineaire gereedschap stelt de schaal van de afbeelding. Onder het tabblad "Analyseren" door de "schaal instellen" opdracht te selecteren. De afstand van de lijn die is opgespoord voordat worden automatisch berekend in pixels.</li>
		<li>Er verschijnt in het display "schaal instellen" . Voer de bekende afstand en lengte-eenheid. Selecteer "Global" toe te passen van de schaal instellen voor alle geïmporteerde afbeeldingen en klik op "OK".</li>
		<li>Gebied als de methode van meting, onder het tabblad "Analyseren" Selecteer de opdracht "Set metingen" . Er verschijnt een lijst met verschillende opties voor metingen. Selecteer de optie "Ruimte" en klik "OK".</li>
		<li>Met het gereedschap freehand selecteren, traceren de omtrek van elke adipocyte van belang. Selecteer de opdracht "Maatregel (Ctrl + M)" onder het tabblad "Analyseren" en het gebied van de adipocyte zal verschijnen. Herhaal deze procedure voor andere adipocytes in de afbeelding. Opmerking: Gebruik meerdere afbeeldingen om nauwkeurige metingen voor kwantificering.</li>
		<li>Kopieer en plak de metingen van het gebied in een spreadsheet voor verdere gegevensanalyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).</li>
<li>Greenberg, A. S., Obin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+the+role+of+adipose+tissue+in+inflammation+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).</li>
<li>Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+White+Adipose+Tissue+With+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy.</a> Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).</li>
<li>Laforest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%2C+MD%29%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).</li>
<li>Berry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li>
<li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+fasting+promotes+adipose+thermogenesis+and+metabolic+homeostasis+via+VEGF-mediated+alternative+activation+of+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage.</a> Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).</li>
<li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).</li>
<li>Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+and+Lineage+Tracing+Study+for+Identification+of+Adipocyte+Precursor+Cell+%28APC%29+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).</li>
<li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation%5BTitle%5D)+AND+%22in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.+Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation.</a> in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li>
<li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li>
<li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li>
<li>Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-tissue+3D+imaging+reveals+intra-adipose+sympathetic+plasticity+regulated+by+NGF-TrkA+signal+in+cold-induced+beiging%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging.</a> Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867412000037">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li>
<li>Vorhagen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+mediated+by+cre-recombinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf">https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf</a> (2016).</li>
<li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li>
<li>Papadopulos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+tasks+in+microscopic+and+ultrastructural+image+analysis+using+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastructural+Pathology%22%5BJournal%5D)">Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ.</a> Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).</li>
<li>Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf">http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf</a> (2018).</li>
<li>Stanly, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+importance+of+appropriate+fixation+conditions+for+faithful+imaging+of+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters.</a> Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).</li>
<li>UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf">http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf</a> (2018).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22U%CC%88ber+das+Durchsichtigmachen+von+menschlichen+und+tierischen+Pra%CC%88paraten+und+seine+theoretischen+Bedingungen%2C+nebst+Anhang%3A+U%CC%88ber+Knochenfa%CC%88rbung%22">Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung</a>. , (1914).</li>
<li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2040-8986/aab58a/meta">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+Whole-Organ+Clearing+and+Imaging+Techniques+with+Single-Cell+Resolution%3A+Toward+Organism-Level+Systems+Biology+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel conventionele technieken zoals histologie en cryosection voordelen bieden voor de observatie van intracellulaire structuur, biedt geheel-mount kleuring een ander perspectief in adipeus weefsel onderzoek, waarmee 3D-visualisatie van cellulaire architectuur van minimaal verwerkte weefsel.
Om het geheel-mount kleuring uitvoeren, moeten de volgende suggesties in aanmerking worden genomen. Verschillende adipeus weefsel depots kunnen verschillende immunokleuring resultaten opleveren; Dus, het...

Vetweefsel is een essentieel orgaan voor energieopslag en wordt gekenmerkt door de dynamische reorganisatie en bijna onbeperkte uitbreiding1. Naast energie homeostase speelt adipeus weefsel ook een essentiële rol in hormoon afscheiding van meer dan 50 adipokines te moduleren van gehele lichaam metabole functie2. Vetweefsel heeft een divers het platform bestaande uit verschillende celtypen, met inbegrip van volwassen adipocytes, fibroblasten, endotheliale cellen, immune cellen en adipocyte voorlopercellen cellen3. Recente studies hebben aangetoond dat overgewicht en andere metabole disfunctie aanzienlijk veranderen kunnen adipeus weefsel functie en de communicatie, die omvat, maar is niet beperkt tot uitbreiding van de adipocytes, infiltratie van ontstekingscellen (b.v., macrofagen), en vasculaire dysfunctie3.
Conventionele morfologische technieken zoals histologie en cryosectioning tonen verschillende beperkingen bij het bestuderen van obesitas biologie zoals lange chemische verwerking stappen, die tot weefsel krimp en structuur vervorming3leiden kan, 4. Bovendien, deze 2D technieken zijn onvoldoende om het observeren van intercellulaire interacties uitgeoefend door verschillende soorten cellen, zoals de secties verkregen beperkt tot kleinere regio's van de gehele weefsel3 zijn. In vergelijking met conventionele methoden voor fluorescerende imaging, geheel-mount kleuring vereist geen extra invasieve stappen, zoals insluiten, afdelen en uitdroging; Dus, dit voorkomt het probleem van de afnemende antilichamenspecificiteit. Als zodanig is het een eenvoudige en efficiënte methode voor imaging adipeus weefsel, met beter behoud van de adipocyte morfologie en algehele adipeus weefsel structuur5. Daarom geheel-mount kleuring zoals een snelle en goedkope immunolabeling techniek werd opgericht voor het behoud van vetweefsel 3D het platform1,6,7,8.
Echter, ondanks het behoud van vetweefsel morfologie met gebruik van het geheel-mount kleuring, deze techniek is nog steeds niet in staat om te visualiseren van innerlijke structuren onder de oppervlakte van de lipide van het weefsel. Verschillende recente studies9,10 geconstateerd weefsel clearing technieken gecombineerd met geheel-mount immunolabeling1,6 te voorzien van uitgebreide 3D-visualisatie in adipeus weefsel. In het bijzonder zijn dichte neurale en therapieën netwerken gevisualiseerd in recente studies9,10,11,12 met 3D-volume imaging. Inderdaad, het bestuderen van de neurale en vasculaire plasticiteit van vetweefsel onder verschillende fysiologische omstandigheden is essentieel voor de studie van de biologie. Immunolabeling ingeschakelde driedimensionale beeldvorming van oplosmiddel-gewist organen (iDISCO +) weefsel clearing is een proces bestaat uit methanol voorbehandeling, immunolabeling, en ruimen van weefsel ondoorzichtigheid met organische chemische reagentia dichloormethaan (DCM ) en dibenzyl ether (DBE)13,14. Door het vetweefsel volkomen transparant te maken, kan een meer accurate weergave van anatomie binnen het weefsel zoals bloedvaten en neurale vezels worden verkregen9,10. IDISCO + heeft voordelen het is compatibel met verschillende antilichamen en fluorescerende verslaggevers11,14, en het heeft aangetoond dat succes in meerdere organen en zelfs embryoes14. De belangrijkste beperking is echter een lange incubatietijd, waarin 18 tot 20 dagen nodig om te voltooien van het hele experiment.
Een andere belangrijke toepassing van geheel-mount kleuring is de visualisatie van het lot van de cel in combinatie met een systeem voor de tracering van afkomst. Lineage tracering is de etikettering van een specifiek gen/markering in een cel die kan worden doorgegeven aan alle cellen van de dochter en over tijd15wordt behouden. Als zodanig is het een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het bepalen van het lot van15nakomelingen van een cel. Sinds de jaren 1990, de Cre-LoxP recombinante systeem is uitgegroeid tot een krachtige aanpak voor lineage tracering in levende organismen15. Wanneer een muis-lijn die Cre, een DNA recombinase enzym uitdrukt, is gekruist met een andere muis lijn uiting van een verslaggever die grenst aan een reeks loxP-STOP-loxP, is het eiwit verslaggever uitgedrukt15.
Voor geheel-mount kleuring, is het gebruik van fluorescerend multicolor verslaggevers geschikt voor imaging van vetweefsel, omdat het zorgt voor minimale interferentie met intracellulaire activiteiten van de adipocyte16. Echter, traditionele verslaggevers meestal vlek het cytoplasma, waardoor het moeilijk is om te traceren van de bloedlijn van witte adipocytes, die weinig hebben cytoplasmatische inhoud17. Om dit probleem te verhelpen, is het gebruik van membraan-gebonden fluorescerende tdTomato/membraan eGFP (mT/mG) verslaggever marker een ideaal hulpmiddel. Membraan-gerichte tdTomato wordt uitgedrukt in Cre-negatieve cellen18. Op Cre excisie optreedt een schakelaar op de expressie van eGFP membraan-gerichte, waardoor deze verslaggever geschikt voor het traceren van de bloedlijn van adipocyte voorlopercellen17,18 (Aanvullende figuur 1).
Het doel van deze paper is te voorzien in een gedetailleerd protocol geheel-mount kleuring en tonen hoe het kan worden gecombineerd met andere technieken te bestuderen voor de ontwikkeling en de Fysiologie van vetweefsel. Twee voorbeelden van toepassingen die zijn beschreven in dit protocol zijn het gebruik ervan met 1) Multikleur verslaggever muis lijnen te identificeren van verschillende oorsprong van adipocytes en 2) weefsel wissen om de neurale arborization in witte vetweefsel (WAT) verder te visualiseren.

<table><tbody><tr><td>LipidTox</td><td>Life Technologies</td><td>H34477</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1 primaire antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z(CH)</td><td></td></tr><tr><td>TH (tyrosine hydroxylase) primaire antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB152, AB1542</td><td></td></tr><tr><td>DAPI-kleurstof</td><td>BD Pharmingen</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Confocale microscoop</td></tr><tr><td>Ultramicroscope I</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td>Lichtbladbeeld fluorescente microscoop</td></tr><tr><td>Alexa Fluor secundaire antilichamen</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>Gebruikte golflengtes 488, 594 en 647</td></tr><tr><td>Gezuiverd Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td><td>BioSciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>30% Waterstofperoxide</td><td>BIO BASIC CANADA INC</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J7126</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Lectin kit I, fluorescerine gelabeld</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>FLK-2100</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497GA</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard Set Montage Medium met DAPI</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffer Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dierlijk serum (geit, ezel)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van 3d witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Vetweefsel is een belangrijk metabolisch orgaan met hoge plasticiteit en inspelen op milieu stimuli en de status van de nutriënten. Als zodanig, zijn verschillende technieken ontwikkeld om te bestuderen van de morfologie en de biologie van vetweefsel. Conventionele visualisatie methoden zijn echter beperkt tot het bestuderen van het weefsel in 2D secties, niet te vangen de 3D architectuur van het gehele orgaan. Hier presenteren we geheel-mount kleuring, een immunohistochemistry methode die bewaart intact adipeus weefsel morfologie met minimale processing stappen. Vandaar, de structuren van adipocytes en andere cellulaire componenten worden gehandhaafd zonder vervorming, bereiken de meest representatieve 3D visualisatie van het weefsel. Geheel-mount kleuring kan bovendien worden gecombineerd met lineage tracering methoden ter bepaling van de cel lot besluiten. Deze techniek heeft echter enkele beperkingen aan het verstrekken van nauwkeurige informatie met betrekking tot de diepere delen van vetweefsel. Om deze beperking ondervangen kan geheel-mount kleuring worden verder gecombineerd met weefsel van het ontruimen van technieken om de ondoorzichtigheid van weefsel te verwijderen en te zorgen voor volledige visualisatie van hele adipeus weefsel anatomie met behulp van licht vel fluorescent microscopie. Dus kunnen een hogere resolutie en meer accurate weergave van vetweefsel structuren worden vastgelegd met de combinatie van deze technieken.

Als gevolg van de kwetsbaarheid van vetweefsel, kunnen methoden waarbij meerdere verwerking stappen en segmenteren leiden tot verminking van vetweefsel morfologie3 (figuur 1A). Echter kunt geheel-mount kleuring behouden de morfologie van adipocytes, zorgen voor nauwkeurige interpretatie van de resultaten (figuur 1B).
Overmatige fixatie van vetweefsel leidt tot fixeer-geïnduceerde autofluorescence. Zoals blijkt ...

De focus van de huidige studie is om aan te tonen van de gehele-mount immunokleuring en visualisatie techniek als een ideale methode voor 3D beeldvorming van vetweefsel architectuur en cellulaire component.

Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vetbiologie veld, zoals hoe intercellulaire interacties en vetweefsel fysiologie veranderen op verschillende metabole voorwaarden zoals vasten en obesitas. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het optimaal behoudt de oorspronkelijke vet 3D-structuur en vermijdt lange verwerking stappen die meestal nodig zijn voor conventionele immunohistochemie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structuur van het vetweefsel, kan het ook worden toegepast op andere orgaansystemen, zoals het zenuwstelsel, door de hersenen in het hele vat te bevlekken.Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen vanwege de moeilijkheden bij het verkrijgen van eigendom weefsel sites, het vinden van de juiste fixatie periode, en de optimale concentratie van antilichamen. Nadat de dissectie is voltooid, breng je de schotel met de weefselmonsters in 1% paraformaldehyde gedurende een uur van het ijs naar kamertemperatuur. Breng vervolgens de weefsels over naar een celkweekplaat van 12 of 24 goed voor een snellere wasbeurt.Het is belangrijk om te onthouden dat de hele montage kleuring procedure moet onmiddellijk beginnen na dissectie en dat er geen pauze punten tussen elke stap. Was de weefsels met PBS-0.3T op een shaker gekanteld op 22 graden met een snelheid tussen 20 en 25 kantelt per minuut bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Herhaal deze was twee keer extra.Voeg hierna ongeveer 0,5 tot een milliliter blokkeerbuffer toe met 5%dierlijk serum. Broed de plaat op een shaker met behulp van de vorige voorwaarden voor een uur. Aspirate de blokkerende oplossing, en voeg op milliliter van primaire antilichamen verdund in PBS-0.3T met 1%dier serum aan elke put.Incubeer de plaat 's nachts op een shaker bij vier graden Celsius met een kanteling van 22 graden en een snelheid van 20 tot 25 kantelt per minuut. De volgende dag gebruikt u PBS-0.3T om de weefsels vijf minuten op kamertemperatuur te wassen. Herhaal deze was twee keer extra.Voeg vervolgens tussen 0,5 en een milliliter geschikte en verdunde secundaire antilichaamoplossingen toe aan elke put. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en broed het een uur lang op een shaker bij kamertemperatuur. Daarna was je de plaat twee keer met PBS-0.3T op kamertemperatuur gedurende vijf minuten per wasbeurt.Als visualisatie van vloeibare druppels nodig is tijdens de neutrale lipide vlek, was twee keer met 1x PBS met elke wasbeurt van vijf minuten. Voeg de neutrale lipidevlek verdund in PBS toe en broed 30 minuten op kamertemperatuur. Om te beginnen met beeldvorming, gebruik tangen om het weefsel plat te leggen op een 24 bij 60 millimeter glazen deksel slip.Als nuclei vlekken met DAPI gewenst is, voeg een tot twee druppels van een montagemedium dat DAPI bevat om het weefsel volledig onder te dompelen en te voorkomen dat het drogen. Plaats vervolgens de dia op een omgekeerd confocale lasermicroscoopsysteem. Om beelden van geheel gemonteerd gekleurd weefsel op meerdere brandpuntsvlakken te verkrijgen, voert u Z-stapels van 100 tot 150 micrometer diepte uit met een stapgrootte van vier tot zes micrometer bij de gewenste vergroting.In deze studie wordt kleuring in het hele vat gebruikt om de architectuur van vetweefsel te behouden. In tegenstelling tot methoden die meerdere verwerkingsstappen en secties omvatten, wat kan leiden tot verminking van de vetweefselmorfologie, kan de kleurwijze van het hele vat zich de morfologie van adipocyten behouden, wat de nauwkeurigheid garandeert bij het interpreteren van resultaten. Overfixatie van vetweefsel leidt tot fixatief geïnduceerde fluorescentie, die kan worden aangegeven door overlappende identieke gebieden, zoals in de tyrosine hydroxylase en PECAM-1 signalen hier gezien.Goed vaste, hele-mount vlek monsters, echter, tonen aparte en duidelijke signalen, wat aangeeft dat deze signalen zijn niet autofluorescentie. Imaging whole-mount gekleurd vetweefsel zorgt voor de kwantificering van morfologische veranderingen onder verschillende experimentele omstandigheden. In het bijzonder, vetweefsel is zeer gevasculariseerd, wat belangrijk is bij het bemiddelen van metabole homeostase op snelle veranderingen in het energieniveau.Bijvoorbeeld, C57 zwarte 6J muizen, die ondergaan 24 uur van het vasten, tonen een aanzienlijk kleinere adipocyte grootte, die lipolyse aangeeft, en een trend in verhoogde bloedvatdichtheid in vergelijking met continu gevoede muizen. Het wissen van vetweefsel met iDISCO+ maakt het mogelijk om vetweefsels optisch transparant te maken. Immunolabeling van vetweefsel dat is gegaan door weefsel clearing toont veel dichter neurale arborisatie in vergelijking met die waargenomen in de hele montage kleuring zonder weefsel clearing op dezelfde vergroting.Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden niet om uw monsters te overfixen voor meer dan een uur op kamertemperatuur in PFA, anders zal dit verhogen achtergrond autofluorescentie. Deze fixatieperiode kan echter worden verlengd als monsters worden vastgesteld op vier graden Celsius. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals kwantificering met ImageJ worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe cellulaire architectuur, zoals adipocytesites en bloedvatdichtheid, veranderen in reactie op verschillende fysiologische aandoeningen.

visualization-3d-white-adipose-tissue-structure-using-whole-mount

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Om beelden met hoge resolutie te verkrijgen van fluorescerend gelabelde cellen binnen grote weefsels, zouden de biologische monsters ideaal geïmagingd moeten worden zonder te snijden. 3DISCO is een eenvoudige weefselklaringsprocedure gebaseerd op sequentiële incubatie met organische oplosmiddelen. Na klaring worden de organen transparant, waardoor een volledige laserscan van het specimen mogelijk is.

Imaging Ontruimde Intact Biological Systems op cellulair niveau door 3DISCO

Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor de vergelijking van 3D gehele hart hartspierweefsel met MRI. Dit is bedoeld voor nauwkeurige vaststelling van intramyocardiale injecties in het infarct grensgebied van een chronische varkensmodel van myocardiaal infarct.

3D Whole-hart myocard Tissue Analyse

Dit werk presenteert een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel doorsnede analyse die de volledige exploitatie van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Dit protocol behoudt de antigeniciteit en vertegenwoordigt een robuust systeem om huidhistologie en mogelijk andere weefstypen te analyseren.

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Als gevolg van het hoge vetgehalte, heeft adipeus weefsel is uitdagend om te visualiseren met behulp van traditionele histologische methoden. Adipo-Clear is een weefsel clearing techniek waarmee robuuste labeling en hoge resolutie volumetrische fluorescerende beeldvorming van vetweefsel. Hier beschrijven we de methoden voor de bereiding van de monsters, voorbehandeling, kleuring, clearing en montage voor imaging.

Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel

Nieuw bloed vaartuig vorming en sympathieke innervatie arm spelen cruciale rol in het adipeus weefsel remodeling. Er blijven echter technische problemen in het visualiseren en kwantitatief meten van vetweefsel. Hier presenteren we een protocol om met succes een label en de dichtheden van bloedvaten en zenuwvezels in verschillende vetweefsel kwantitatief te vergelijken.

Co kleuring bloedvaten en zenuwvezels in adipeus weefsel

Hier beschrijven we een eenvoudige, goedkope en snelle clearing methode om de 3D-structuur van zowel muis- als menselijk wit vetweefsel op te lossen met behulp van een combinatie van markers om vasculatuur, kernen, immuuncellen, neuronen en lipidedruppelcoateiwitten te visualiseren door fluorescerende beeldvorming.

Het verkennen van vetweefselstructuur door methylsalicylaatcle clearing en 3D-beeldvorming

Functionele beeldvorming en kwantificering van thermogene vetdepots bij muizen met behulp van een micro-PET / MR-beeldvormingsgebaseerde benadering.

Visualisatie en kwantificering van bruine en beige vetweefsels bij muizen met behulp van [18F] FDG Micro-PET / MR Imaging

De vervanging van gezond spierweefsel door intramusculair vet is een prominent kenmerk van menselijke ziekten en aandoeningen. Dit protocol schetst hoe intramusculair vet kan worden gevisualiseerd, afgebeeld en gekwantificeerd, waardoor de mechanismen die ten grondslag liggen aan intramusculaire vetvorming kunnen worden bestudeerd.

Een gids voor het onderzoeken van intramusculaire vetvorming en de cellulaire oorsprong ervan in skeletspieren

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren, kweken en fenotyperen van microvasculaire endotheelcellen uit menselijk onderhuids vetweefsel (hSATMVEC's). Daarnaast beschrijven we een experimenteel model van hSATMVEC-adipocyte overspraak.

Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

Ontdek whole-mount immunostaining voor 3D-beeldvorming van witte adipose weefselarchitectuur en celcomponenten. Deze methode behoudt de oorspronkelijke 3D-structuur en voorkomt vervorming bij metabole aandoeningen.

Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Meer video's verkennen