Een systeem van de BW verslaggever voor het bestuderen van de Receptor-Ligand interacties

Shalom.The BW Reporter System maakt het mogelijk om receptor-ligand interacties te bestuderen. Het is uiterst nuttig in gevallen waarin de ligand van een specifieke receptor onbekend is of in gevallen waarin de experimenten met de endogene ligand technisch moeilijk zijn. Deze methode is gevoelig en specifiek voor een individuele receptor, gemakkelijk te bedienen en reproduceerbaar.

Het demonstreren van de procedure zal Shira Kahlon zijn, een postdoc voor mijn laboratorium. De dag voor de transfectie, plaat 10 platen met 10 milliliter van 100, 000 BW5147 cellen, en vul een RPMI. Plaats vervolgens 100 microgram van de pcDNA3 plasmid in een buis.

Voeg natriumacetaat bij pH 5.3 toe aan de buis. Voeg hierna 2,5 volumes van 100% ethanol toe aan het plasmidemengsel. Vervolgens incubeer het plasmid mengsel 's nachts bij min 20 graden Celsius.

24 uur na het plating van de BW cellen, het verzamelen van de cellen in twee 50 milliliter buizen. Dan centrifugeren de cellen op 515 g's gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Resuspend het peloton RPMI zonder toevoegingen en herhaal de centrifugatie.

Resuspend de resulterende pellet in 1 milliliter RPMI zonder toevoegingen. Breng de geresuspended pellet naar een 4 centimeter cuvet op ijs. Centrifuge de plasmid dat ethanol neerslag onderging.

Was vervolgens de plasmid met een milliliter van 70%ethanol. En herhaal centrifugatie voor nog eens 20 minuten. Verwijder alle ethanol en laat de pellet gedeeltelijk drogen.

Dan resuspend de pellet in 100 microliters van voorverwarmde RPMI, zonder toevoegingen. Voeg hierna de geresuspended plasmid toe aan de cellen in cuvet. Broed de cellen vijf minuten op ijs.

Vervolgens elektroporate de cellen. Breng vervolgens de geëlektreerde cellen over naar een buis van 50 milliliter. Voeg 50 milliliter volledig medium toe aan de buis en centrifuge gedurende vijf minuten, bij 515 g's.

Gooi de supernatant, en resuspend de cellen in 50 milliliter van het volledige medium. Dan plaat de cellen in 24-well cultuur gerechten, en incubeer de cellen voor 48 uur. Voeg hierna een milliliter compleet medium toe, aangevuld met 10 milligram per milliliter G418 aan elke put.

48 uur later, gooi een milliliter van het bovenste volume van elke put. Voeg vervolgens een milliliter van volledige medium aangevuld met vijf milligram per milliliter G418 aan elke put. Gebruik 50.000 transfected BW cellen met hun gewenste doelen, in een enkele put van een 96-well plaat.

Broed de plaat 48 uur in. Bevries vervolgens de plaat bij min 20 graden Celsius. Coat een ELISA plaat met anti-muis IL-2 antilichaam.

Plaats 05 microgram anti-muis IL-2, in een volume van 50 microliter PBS in elke put. Incubeer de gecoate plaat 's nachts op vier graden Celsius. Gebruik een korte incubatietijd bij 37 graden Celsius, om de bevroren BW-cellen te ontdooien, die eerder met hun doelen werden geïncubeerd.

Centrifugeer vervolgens de plaat en breng 100 microliter van de supernatant van elke put over naar de voorgecoate ELISA-plaat. En broeden op 37 graden Celsius voor twee uur. Voeg hierna biotine anti-muis IL-2 toe aan de ELISA plaat.

Voeg na incubatie en wassen HRP geconjugeerd streptavidin toe aan de plaat. Voeg na incubatie en wassen 100 microliters van de TMB substraatoplossing toe aan elke put van de ELISA-plaat. Lees tenslotte de ELISA plaat op 650 nanometer.

In dit voorbeeld werden CLL-cellen voorgecubeerd met verschillende anti-CD20-antilichamen. En dan co-geïncubeerd met transfected BW cellen die de Fc receptoren CD16 uitdrukken, alvorens te worden geanalyseerd met ELISA. Na analyse met ELISA werden de resultaten gekwantificeerd.

De optische dichtheidsniveaus, werden omgezet in muis IL-2 concentraties, gebaseerd op de standaardcurve. In een extra experiment werden verschillende doses anti-CD20-antilichamen voorgecububeerd met CLL-cellen. En vervolgens geïncubeerd met de doorgeïnfecteerde BW cellen.

Het deeltje bevat vier hoofddelen. Klonen, transfectie van BW cellen, activering en ELISA. Elk van de onderdelen moet onafhankelijk worden gecontroleerd.

Na deze procedure kunnen aanvullende experimenten worden uitgevoerd met cellen die de endogene receptoren uitdrukken, zoals het doden van zuren met NK-cellen om interacties met NK-celreceptoren te bestuderen. We hebben dit systeem gebruikt om nieuwe liganden van NK celreceptoren te ontdekken. Hemagglutinine is bijvoorbeeld een ligand van NKp46 en PVL is een ligand van TG.