RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Vanwege de hoge efficiëntie kan deze methode de geïnduceerde pluripotente stamcellen, of IPC's, verder bevorderen als hulpmiddel voor het bestuderen van menselijke ziekten en het ontwikkelen van nieuwe stamceltherapieën. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om hoogwaardige integratievrije IPC's te genereren van primaire menselijke fibroblasten, waaronder moeilijk te herprogrammeren, ziekte geassocieerd, verouderd en senescent fibroblasten. Het succes van deze methode hangt af van een optimale RNA transfectie efficiëntie van fibroblasten.

En het aanpassen van de pH van een transfectiebuffer is een belangrijke procedure om dit te bereiken. Om te beginnen, bereid transfectie buffer met behulp van 500 milliliter en 100 milliliter kamertemperatuur voorverwarmde flessen van verse verlaagde serummedium. Meet de basis pH van het medium in 500 milliliter fles door het inbrengen van de pH-meter glaselektrode in de buffer, en wacht tot een minuut voor het lezen van de pH.

Om de pH aan te passen, voeg drie tot vier milliliter van een molaire natriumhydroxide in 500 milliliter fles. Sluit de fles en meng goed. Na vijf minuten wachten open je de fles en steek je de pH-meter elektrode in de buffer.

Wacht tot de meting op de pH-meter stabiliseert. Blijf kleine volumes van één molaire natriumhydroxide toevoegen totdat de pH 8,15 tot 8,17 bereikt, zodat u de pH-meter tijdens het proces meerdere keren kalibreert. Gebruik een vacuümfiltratiesysteem van 0,22 micrometer om de transfectiebuffer te steriliseren.

Aliquot de gesteriliseerde buffer in vijf milliliter buizen met minimale luchtruim. Controleer of de fibroblasten die moeten worden geherprogrammeerd, 40% tot 60% samenvloeiing hebben. Breng vier milliliter DPBS over in een conische buis van 15 milliliter en voeg 100 microliter recombinant menselijke laminine 521 toe.

Meng grondig door pipetting op en neer. Voeg een milliliter per put van verdunde recombinant menselijke laminine 521 in drie putten van een zes put plaat. Broed deze gecoate plaat twee uur lang op 37 graden celsius.

Tijdens deze incubatie, warme zes milliliter fibroblast expansie medium en vier milliliter van beplating medium tot 37 graden celsius. Vul het beplatingsmedium aan met basisFGF met een uiteindelijke concentratie van 100 nanogram per milliliter en B18R bij een uiteindelijke concentratie van 200 nanogram per milliliter. Zorgvuldig aanzuigen van de verbruikte medium van fibroblasten die op 40% tot 60%confluency.

Spoel de cellen af met vijf milliliter DPBS. Voeg drie milliliter trypsine EDTA toe en wieg de plaat voorzichtig om de cellen te bedekken met trypsine EDTA. Aanzuigen overtollig vocht, waardoor ongeveer 500 microliter trypsine, en incubeer de fibroblasten gedurende drie minuten op 37 graden Celsius.

Na het verwijderen van de plaat uit de couveuse, stevig maar voorzichtig tik op de zijkant van de plaat om de cellen los te maken. Bekijk de cellen onder de microscoop om te controleren of ze zijn losgemaakt. Voeg vijf milliliter fibroblast expansiemedium toe aan de losgemaakte cellen om de trypsine EDTA te neutraliseren.

Verzamel de cellen in een 15 milliliter conische buis en meng ze goed. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer, dan pipette 12.000 cellen in vier milliliter van eerder voorbereide voorverwarmde beplating medium. Na het verwijderen van de gecoate plaat uit de couveuse, aspirate verdunde laminine 521 uit de putten, ervoor te zorgen dat het oppervlak van de putten niet droog.

Voorzichtig resuspend de cellen die in de beplating medium en voeg een milliliter van de cel suspensie in elke gecoat goed. Plaats de vergulde cellen in een tri-gas weefsel cultuur incubator met lage zuurstof of zuurstof ingesteld op 5%En dan voorzichtig maar grondig verspreiden van de cellen door afwisselend een omhoog naar beneden, dan links rechts beweging, en herhaal de bewegingen nog twee keer, ervoor te zorgen niet aan de plaat wervelen. De cellen 's nachts uitbroeden.

Voeg ondertussen vier milliliter herprogrammeringsmedium toe aan een kegelbuis van 15 milliliter en plaats deze in de lage O-twee-incubator met een losgemaakte dop om 's nachts in evenwicht te komen. Verwijder ten minste één uur voor de transfectie het geëquilibreerde herprogrammeringsmedium uit een lage O-twee-incubator. Voeg bFGF toe aan een uiteindelijke concentratie van 100 nanogram per milliliter en B18R tot een uiteindelijke concentratie van 200 nanogram per milliliter en meng goed.

Werken een goed op een moment, gebruik maken van een een milliliter pipet om de gebruikte medium te verwijderen. En vervang het door een milliliter herprogrammering medium, aangevuld met bFGF en B18R. Verplaats de plaat met cellen terug in de lage zuurstof incubator.

Om fibroblasttransfectie te starten, moet u eerst een aliquot van de transfectiebuffer ongeveer een uur bij kamertemperatuur in evenwicht brengen. Verwijder een enkele 33 microliter aliquot van gemodificeerde MRNAs en 14 microliter aliquot mirna bootst van negatieve 80 graden Celsius, en verwarm ze tot kamertemperatuur voor ongeveer drie tot vijf minuten tot ontdooid. Draai ze kort naar beneden in een microfuge.

Verwarm het transfectiereagens gedurende ongeveer drie tot vijf minuten op kamertemperatuur. Keer de buis twee tot drie keer om het reagens te mengen en draai het kort in een microfuge. Breng 279 microliter van de buffer voor de doorfectiebuffer op kamertemperatuur over in een RNAs-vrije microcentrifugebuis en voeg 31 microliter van het transfectiereagens toe.

Meng grondig door pipetting en incubeer op kamertemperatuur gedurende een minuut. Voeg 132 microliter van de kamertemperatuur transfectie buffer toe aan de 33 microliter aliquot van gemodificeerde MRNA, en voorzichtig pipet te mengen. Voeg 102,6 microliter van de kamertemperatuurtransfectiebuffer toe aan de 14 microliter aliquot mirna bootst en voorzichtig pipet om te mengen.

Voeg 165 microliter van de 310 microliter transfectiebuffer, transfectiereageagentagemix toe aan 165 microliter van de transfectiebuffer, gemodificeerde MRNA-mix om de transfectiemix voor te bereiden. Pipette om te mengen. Om de transfectiemix van MIRNA-imitaties voor te bereiden, voeg 116,6 microliter van de 310 microliter transfectiebuffer, transfectiereageagentenmix toe aan de 116,6 microliter transfectiebuffer, MIRNA bootsen mix na.

Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de transfectiebuffer te laten complexeren met de gemodificeerde MRNAs en MIRNA bootst na. Verwijder de plaat met cellen uit de couveuse met weinig zuurstof. Drop verstandig over elke put, voeg 100 microliter per put van de transfectie mix met de complexe, gemodificeerde MRNAs.

Voorzichtig maar grondig roeren de plaat met een omhoog naar beneden, dan links rechts beweging om de transfectie complexen te verspreiden. Voeg 66,7 microliter per put van de transfectiemix met de complexe MIRNA-bootst drop wise over elke put toe. Voorzichtig maar grondig roeren de plaat met een omhoog naar beneden, dan links rechts beweging om de transfectie complexen te verspreiden.

Plaats de plaat met de transfected cellen in de tri-gas incubator met weinig zuurstof. Verspreid de transfectiecomplexen door de plaat voorzichtig maar grondig te roeren met een naar beneden, en vervolgens links rechts beweging. Incubeer de doorgeïnfecteerde cellen in de couveuse gedurende 16 tot 20 uur voordat u de volgende dag van medium verandert.

Voeg vier milliliter herprogrammering medium aan een 15 milliliter conische buis, en plaats het in de lage O twee incubator met een losgemaakte dop te equilibrate 's nachts. De volgende ochtend vervangt u het transfectiemiddel met het verse voorgeeevende medium aangevuld met bFGF en B18R en ga verder met het transfectieregime zoals beschreven in het protocol. Na succesvolle beplating in een put van een zes goed formaat schotel voor herprogrammering, fibroblasten leek zeer schaars.

24 uur na de eerste succesvolle transfectie verloren fibroblasten hun spindelvorm en namen een meer afgeronde morfologie aan. Gedurende de eerste drie transfecties nam de celdichtheid geleidelijk en consequent toe met een schijnbare uitbarsting van proliferatie die zich tussen dag zeven en acht voordeed. Op dag 10 leken de cellen grotendeels samenvloeiend.

De eerste IPSC kolonies verschenen al in dag 11. In de dagen 15 tot en met 17 werden IPSC-kolonies groot en duidelijk en duidelijk onderscheiden van omringende en volledig geherprogrammeerde fibroblasten. Immunostaining voor de pluripotentiemarker TRA-1-60 bevestigde een hoge herprogrammeringsefficiëntie.

Suboptimale beplatingsdichtheid is de meest voorkomende reden voor een verminderde efficiëntie van herprogrammering in dit protocol. Als de beplatingsdichtheid te laag was, verschenen grote acellulaire baronflelekken en de kolonies IPSC vormden zich niet. Na verdunningspassage van geherprogrammeerde cellen groeiden IPC's als enkele kolonies en waren gemakkelijk te onderscheiden van fibroblasten.

Ze waren losjes verpakt en individuele cellen hadden een relatief groot cytoplasmatisch gebied. In de loop van vier tot zeven dagen, de IPC's vermenigvuldigd en vormde een karakteristieke strak verpakt kolonie met gedefinieerde randen. Individuele cellen binnen de kolonie toonden een grote nucleaire fractie met prominente nucleoli.

Na het herprogrammeren van patiëntfibroblasten kunnen de resulterende IPC's worden gedifferentieerd in een verscheidenheid aan somatische cellen om ziekteverwekkende mechanismen op te helderen of nieuwe regeneratieve celgebaseerde therapieën te ontwikkelen.