Evaluatie van de wisselwerking tussen het complement eiwit C1q en hyaluronzuur bij het bevorderen van de hechting van cellen
15 juni 2019
De aanvulling component C1q is een pro-inflammatoire molecuul sterk uitgedrukt in het weefsel microomgeving die kunnen interageren met de extracellulaire matrix. Hier beschrijven we een methode om te testen hoe C1q gebonden aan hyaluronzuur effecten cel adhesie.
Een uitgebreide procedure om het samenspel tussen het complementeiwit C1q en hyaluronzuur te evalueren bij het bevorderen van celhechting. We hebben onlangs gedefinieerd dat de complementcomponent C1q een molecuul van het aangeboren immuunsysteem sterk tot uiting komt in de tumor en placentamicro-omgeving en in staat is om te interageren met de component van de extracellulaire matrix. In dit geval hyaluronzuur.
Wij stellen een methode voor voor het bestuderen van de biologische functies van eiwitten in de hele ecronomische omgeving. Om het vermogen van deze moleculen te onderzoeken om de celdelingseigenschappen van extracellulaire matrixfactoren vorm te geven. Om te bestuderen hoe deze interactie kan worden waargenomen door de cellen die aanwezig zijn in het weefsel van de omgeving, hebben we deze eenvoudige methode opgezet waarbij binaire cellen afkomstig van menselijke weefsels c1q mochten naleven die gebonden zijn aan extracellulaire matrix, in dit geval hyaluronzuur.
Voor coating procedure de eerste stap is de binding van een hoog moleculair gewicht hyaluronzuur tot 96 goed weefsel gecoate microplaat. Voor coating wordt hyaluronzuur verdund in 0,1 mol koolstofbuffer PH 9.6 bij een concentratie van 15 microgram per milliliter. En voorzichtig pipeting wordt gerequited om een homogene oplossing te bereiken.
Een 100 microliter van de oplossing worden gebruikt om de putten te coaten. De plaat wordt vervolgens 's nachts bij vier graden Celsius overgebracht. De volgende dag vacuüm aspirate de behandelde putten.
Was één keer met dPBS. Voeg C1q of BSA toe in de bijbehorende putten. C1q is tegenwoordig commercieel verkrijgbaar bij een concentratie van één milligram per milliliter en wordt verdund met een concentratie van 25 microgram per milliliter.
En dPBS met 0,5% BSA en 0,7 millimol calcium en magnesium en divalent cations. BSA LPS gratis wordt gebruikt bij de concentratie van 0,5% en datum PBF. Plaat wordt vervolgens 's nachts bij vier graden Celsius overgebracht.
C1q dosis afhankelijke interacties met geïmmobiliseerd hyaluronzuur wordt bepaald door enzym gekoppelde immuno SA. Cellen labelen met snelle DiI. De lipofiele tracer snel DiI wordt gebruikt om de cellen van belang label. Cellen die opnieuw worden opgetrokken in dPBS worden gebruikt bij de concentratie van een miljoen cellen per milliliter.
Snelle DiI wordt verdund een tot 100 direct in de cel suspensie. De celsuspensie wordt handmatig gemengd en gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius overgebracht. Na vijf minuten incubatie, meng de cel suspensie en herhaal deze operatie twee keer meer.
Om het overschot aan snelle DiI te verwijderen, voeg 10 milliliter dPBS toe. Draai zachtjes op en neer en centrifugeer zeven minuten lang op 250 g. Resuspend de celpellet in een milliliter menselijk endofiele serumvrij medium in aanwezigheid van 0,1%BSA.
Cellen hechting op hyaluronzuur C1q matrices. Vacuüm zuigt de dPBS uit de gecoate putten. Verdeel 100 microliter van gelabelde celsuspensie naar de gecoate putten.
200 microliters van gelabelde cellen worden uit elkaar gehaald in een ependure buis te gebruiken voor standaard curve generatie. Broed de plaat 35 minuten bij 37 graden Celsius. Haal de plaat uit de couveuse.
De onevenwichtige cellen voorzichtig aanzuigen. Was één keer met dPBS met 0,5% BSA en 0,7 millimol calcium en magnesium. Lys de aanhangende cellen door het toevoegen van 200 microliters van lyse buffer.
Bereid tegelijkertijd de standaardcurve voor op één tot twee seriële verdunning van de gelabelde cellen in lysebuffer. Voer de lezing van de florescence signaal op oneindige F 200 T-can instrument met behulp van 544 nanometer als excitatie golflengte en 590 nanometer als emissie golflengte. Representatieve resultaten.
Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, is het duidelijk dat celhechting op hyaluronzuur gevonden C1q als sterk verbeterd in vergelijking met HA alleen of HA gebonden BSA. Het percentage aanhangende cellen op elke matrix wordt berekend op basis van de standaardcurve. Conclusies. In onze experimenten hebben we allereerst het vermogen van de complementcomponent C12 geëvalueerd om de extracellulaire matrix in dit geval hyaluronzuur te binden met behulp van een arisaal metaal.
Ten tweede analyseerden we het vermogen van menselijke primaire cellen bevlekt met fluorescerende kleurstof om gebonden hyaluronzuur na te streven. Het model dat we in deze studie hebben voorgesteld, is een eenvoudigere snellere en goedkopere methode in alternatief voor het 3D-model van extracellulaire matrixsteigers voor de evaluatie van deze cellulaire reactie op een combinatie van stimuli.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de interactie tussen het complement component C1q en hyaluronzuur, met nadruk op hoe deze interactie de celadhesie beïnvloedt. C1q, een pro-inflammatoir molecuul, wordt significant tot expressie gebracht in de tumor- en placenta-micro-omgevingen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- C1q maakt deel uit van het aangeboren immuunsysteem.
- Het wordt sterk tot expressie gebracht in specifieke weefselmicro-omgevingen.
- C1q interacteert met componenten van de extracellulaire matrix.
- Hyaluronzuur is een belangrijke component van de extracellulaire matrix.
Doel van de studie
- Om de rol van C1q in celadhesie te evalueren.
- Om te onderzoeken hoe C1q gebonden aan hyaluronzuur het celgedrag beïnvloedt.
- Om een methode te ontwikkelen voor het bestuderen van eiwitinteracties in de extracellulaire omgeving.
Gebruikte methoden
- Binaire cellen afgeleid van menselijk weefsel werden gebruikt.
- Cellen mochten binden aan C1q dat gebonden was aan hyaluronzuur.
- Een uitgebreide procedure werd vastgesteld voor de evaluatie.
- Biologische functies van eiwitten werden beoordeeld in de context van de extracellulaire matrix.
Belangrijkste resultaten
- De interactie tussen C1q en hyaluronzuur bevordert celadhesie.
- Cellen reageren op de aanwezigheid van C1q in de extracellulaire matrix.
- Deze methode biedt inzicht in celdelingseigenschappen beïnvloed door extracellulaire factoren.
- Bevindingen kunnen implicaties hebben voor het begrijpen van immuunresponsen in weefsel omgevingen.
Conclusies
- C1q speelt een belangrijke rol in celadhesie door zijn interactie met hyaluronzuur.
- De ontwikkelde methode kan worden toegepast om eiwitinteracties verder te bestuderen.
- Het begrijpen van deze interacties kan de kennis over de functies van het immuunsysteem in verschillende weefsels verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
