Eencellige RNA Sequencing van Fluorescently geëtiketteerde muis neuronen met behulp van handmatig sorteren en dubbele In Vitro transcriptie met Absolute aantallen Sequencing (DIVA-Seq)

Deze methode kan helpen bij het oplossen van een belangrijk obstakel op het gebied van single-neuron isolatie en sequencing. Zoals het verzamelen van specifieke populatie of een subpopulatie van fluorescerend gelabeld neuron uit door de gebruiker gedefinieerd hersengebied. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zorgt ervoor dat de enkele neuron van belang wordt gevangen zonder vervuilende puin.

Het is ook relatief zacht, wat belangrijk is voor fragiele neuron types die snel sterven wanneer onderworpen aan de vloeistof druk van conventionele FACS sorteren. Begin met het bereiden van getrokken glazen microcapillaries met een uitgangsdiameter van 10 tot 15 micron met behulp van een capillaire trekker. Gebruik fijne schaar om de punt van de capillaire te snijden om de gewenste board diameter te krijgen.

Gebruik vervolgens buizenconnectoren om een 120 tot 150 centimeter lange flexibele siliconen slang met een binnendiameter van 0,8 millimeter te bevestigen aan een 0,2 micron PVDF membraanspuitfilter en een tweerichtingsbuizenklep. Bereid 500 milliliter gekoelde kunstmatige cerebrale spinale vloeistof of ACSF en zuurstofaat door borrelen 5%kooldioxide evenwichtige zuurstof door middel van een airstone gedurende 15 minuten of totdat de oplossing volledig wist. Bereid drie bekers van 150 milliliter met elk 100 milliliter ACSF.

Voeg er een cocktail van activiteitenblokkers toe. Aan een andere, voeg Streptococcus fractie voor protease aan een laatste concentratie van een milligram per milliliter. Voeg aan het laatste bekerglas FBS toe aan een uiteindelijke concentratie van 1% en zuurstof met 5% koolstofdioxide-uitgebalanceerde zuurstof via een Airstone.

Maak ten slotte drie pasteurpipettes met lange steel met afnemende uitgangsdiameters door ze over een open vlam te rollen. Ontleden de hersenen van een geëuthanaseerde muis door het openen van de schedel met een kleine schaar en het extraheren van de verse hersenen met behulp van fijne tangen zonder beschadiging van de cortex. Plaats de hersenen in gekoelde en zuurstofrijk ACSF waardoor een Airstone bevestigd aan 5%kooldioxide-evenwichtige zuurstof tijdens de gehele duur van de sectie.

Plaats de hersenen op de vibratome chuck en snijd coronale of sagittale secties op 300 micron dikte. Verzamel zoveel secties als nodig is om een minimum van 10 tot 50 gelabelde cellen te verkrijgen. Leg plakjes op een katoenmazige slice houder geplaatst in een beker, zodat ze worden badend in zuurstofrijk ACSF.

Verplaats de plakjes in het bekerglas met ACSF met activiteitsblokkers en blok gedurende 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur terwijl u zuurstof borrelt met behulp van een Airstone. Verplaats de plakjes naar het bekerglas met ACSF met de protease-oplossing om een milde spijsvertering bij kamertemperatuur uit te voeren. Na de spijsvertering, was de protease door het verplaatsen van plakjes terug naar de beker met ACSF met activiteit blocker oplossing voor vijf tot 10 minuten op kamertemperatuur.

Blijf zuurstof borrelen. Bereid vervolgens een petrischaal van 100 millimeter met ACSF met 1%FBS bij kamertemperatuur en verplaats afzonderlijke secties in de schijf voor microdissection. Gebruik onder een fluorescerende dissecties toepassingsgebied een paar fijne tangen om gebieden en lagen van belang met een minimum van 10 tot 50 cellen te micro-ontleden.

Verplaats met behulp van een Pasteur pipet de micro-ontleede stukken naar een 2 milliliter microcentrifugebuis met ongeveer 0,8 milliliter van 1%FBS in ACSF-oplossing. Titreert het ontleed weefsel in de microfuge buis bij kamertemperatuur. Voer ongeveer 10 slagen uit met elk van de gevlamde Pasteur pipetten te beginnen met de grootste en eindigend met de kleinste exit diameter.

Doe de gescheiden cellen in een petrischaaltje van 100 millimeter met zuurstofrijk ACSF en wacht vijf tot zeven minuten tot de cellen zich geleidelijk vestigen. Let op het GFP- en RFP-signaal onder een dissectiemicroscoop. Identificeer puin door het onderzoeken van de morfologie onder heldere-veld verlichting.

Zodra een gebied van cellen met weinig puin is geïdentificeerd, gebruik maken van de capillaire en hechten aan buizen om cellen te plukken door het blokkeren van het einde van de slang klep met de tong. Plaats vervolgens de capillaire dicht bij de cellen. Laat het blok los op de capillaire en blokkeer snel opnieuw om de cel vast te leggen met capillaire actie.

Verplaats de capillaire naar een 100-millimeter petrischaal met verse zuurstofhoudende ACSF en blaas zachtjes in de buis tijdens het observeren van de capillaire tip onder fluorescentie optica om de cellen in de schotel af te leveren. Herhaal de opvangprocedure tot er 100 tot 150 cellen worden verzameld om ervoor te zorgen dat verontreinigingen, zoals vuil, minimaal zijn in contrastoptica met een rooskleurig differentieel. Ten slotte, met behulp van een verse micro-capillaire pipet elke keer, kies een enkele cel en verdrijven in niet meer dan 0,5 microliter in een 0,2 microliter micro-fuge buis met een microliter van monster-collectie buffer met primers.

Breek de pipetpunt in de microfugebuis om ervoor te zorgen dat de cel in de opvangbuffer blijft. Vries de cellen door het zetten van de buizen op droog ijs. Bewaar in een min 80-graden Celsius vriezer tot verwerking voor RNA versterking.

GABAergic neuronen werden geïsoleerd uit de cingulet cortex van de muis hersenen. RNA versterkt van de handmatig gesorteerde neuronen varieerde tussen 200 tot 4,000 basisparen in grootte met een piekverdeling iets boven de 500 basisparen. Na de zuivering van kralen wordt de cDNA-bibliotheek verder groot door een tweede ronde zuivering met kralen om fragmenten van minder dan 200 basisparen te elimineren en voor de piek op ongeveer 350 basisparen.

Sequencing toonde een 4,8 keer 10 tot de 5e mediaan of 6,9 keer 10 tot de 5e gemiddeld in kaart gebrachte leest per cel. Na dubbele RNA-verwijdering met UMI's had elke cel een 1,0 keer 10 tot de 5e mediaan of 1,4 keer 10 tot het 5e gemiddelde unieke leest per cel. In elke eencellige externe RNA-besturingselementen consortium, piek in RNA werd gebruikt als een interne controle om het absolute aantal moleculen toegevoegd aan het monster te berekenen.

Er was een lineaire verhouding van input aan waargenomen tellingen met een helling van 0.92 en aangepast R vierkant van 0.94. Een gemiddelde van ongeveer 10.000 genen per enkel neuron werden gedetecteerd met behulp van deze procedure met meer dan 95% van de enkele cellen detecteren meer dan 6,000 genen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor moleculaire biologen om het transcriptonoom van verschillende goed gekarakteriseerde muizencorticale interneurons te verkennen en bepaalde gencategorieën te identificeren die verantwoordelijk zijn voor het coderen van de cellulaire identiteit.