Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

Deze methode kan worden gebruikt om de effecten van reeds bestaande immuniteit tegen denguevirus op Zika virus infectie te evalueren, met behulp van de werkelijke menselijke patiënt serum en primaire menselijke immuuncellen. Het gebruik van de werkelijke menselijke patiënt serum monsters en menselijke primaire cellen bieden dieper inzicht in het antilichaam afhankelijke verbetering van het Zika-virus door pre-immuun sera en antilichamen. Deze methode geeft inzicht in het vermogen van antilichamen in het bloed van een patiënt om een virusinfectie in andere menselijke cellen te verbeteren.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de virale infectie niveaus zijn hoog genoeg voor detectie, maar laag genoeg om niet te overweldigen de cellen of om te interfereren met de interpretatie van de gegevens. Begin met het zaaien van drie keer tien tot de vierde cellen in 100 microliters van celkweek medium per goed in een steriele, platte bodem 96-put plaat. Wanneer alle cellen zijn verguld, plaats de plaat in een 37 graden Celsius en 5% kooldioxide incubator en maak 10 voudige seriële verdunningen van ontdooide menselijke serummonsters in serumvrij medium.

Zorg ervoor dat u de serumverdunning en verdunningsfactor constant houdt voor alle voor-immuunserums voordat u de verdunningen toevoegt aan de virusoplossingen en de cellen. Vervolgens, dooi Zika virus stammen voorraad oplossing in een 37 graden Celsius water bad voor een tot twee minuten voordat snel de overdracht van de voorraad naar ijs. Voeg een 0,1 multipliciteit van infectie equivalent volume van het Zika-virus aan het serum aliquots en plaats de plaat in de celcultuur incubator voor een uur om de dengue virus antilichamen te vormen complexen met de Zika virions.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen met 100 microliter PBS per put en voeg 50 microliters immuuncomplex aan elke put. Na de twee uur incubatie, verwijder het medium en was de putten twee keer met 100 microliters van PBS per put om de immuuncomplexen en eventuele niet-verbonden virions volledig te verwijderen. Voer vervolgens de cellen met 100 microliter per celkweekmedium aangevuld met 10%foetaal runderserum.

Breng de cellen vervolgens 48 uur terug naar de celkweek incubator. Twee dagen na de infectie, was de cellen twee keer met 100 microliter steriele PBS per goed alvorens 250 microliters van cellyse buffer met 10% beta mercaptothanol aan elke put toe te voegen. Pipet minstens vijf keer op en neer met krassen om het lyseproces te versnellen en de cellysates over te zetten op steriele gelabelde buizen van 1,5 milliliter.

Voeg een gelijk volume van 70% ethanol toe aan elke buis en pipet de lysate oplossing op en neer vier tot vijf keer. Wanneer de lysaatsuspensies helder zijn, breng elke oplossing in gelabelde silica-gebaseerde kolommen in twee milliliter opvangbuizen voor centrifugatie. Gooi de doorstroom weg met de kolommen in dezelfde opvangbuizen en voeg 700 microliter van Wash Buffer 1 toe aan elke kolom voor een tweede centrifugatie.

Na het verwijderen van de flow-through, spoel de kolommen nog twee keer met 500 microliters van Wash Buffer twee per wasbeurt. Breng na de tweede wasbeurt de kolommen over op nieuwe twee milliliter opvangbuizen voor nog een centrifugatie. Voeg 30 microliter van 42 graden Celsius RNase-Vrij water toe aan het midden van elke kolom voor centrifugatie en herstel het eluted RNA.

Voor kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie of QRTPCR analyse voeg een microliter van gen specifieke voorwaartse en omgekeerde primers van 10 micromolar voorraden samen met 0,25 microliters van omgekeerde transcriptase mix per reactie. Merk op dat primers die Zika virus genetisch materiaal te herkennen zal detecteren virale genen en zorgen voor infectie kwantificering. Voeg vervolgens 12,5 microliter SYBR Green Mix toe, gevolgd door 25 microliter water aan elke reactie en voeg 15 microliter mastermix toe in elke bron van 96-bron QPCR-plaat.

Voeg bij het gebruik van een Master Mix 100 nanogram van het RNA-monster toe aan de mix en pipet de Master Mix in afzonderlijke putten van de QRTPCR-plaat. Houd er rekening mee dat monsters in drievoud moeten worden uitgevoerd op dezelfde QRTPCR-plaat. Voer vervolgens de monsters uit op een kwantitatieve PCR-machine volgens de parameters die in de tabel worden beschreven.

Klik op het tabblad smeltcurve in de systeemsoftware om de smeltcurve te controleren. De smeltcurve toont enkele piek in alle monsters voor een bepaald gen om de aanwezigheid van slechts één amplicon te bevestigen. Voor optimale resultaten gebruikt u temperatuurverhogingen van 0,5 graden Celsius tussen stappen en een minimale houdtijd van 10 seconden in het melt curve protocol.

Klik vervolgens op het tabblad kwantificeringsgegevens om een kwantitatieve cyclus voor elk monster te verkrijgen en exporteer de gegevens naar een spreadsheet voor verdere kwantificeringsanalyse. De menselijke serummonsters kunnen worden gecategoriseerd in drie verschillende groepen: dengue virus infectie bevestigde monsters, dengue virus antilichaam bevestigde monsters, en gezonde sera zonder dengue virus neutraliseren antilichamen of RNA. Na 48 uur infectie, QRTPCR analyse toont aan dat de meeste sera met dengue virus serotype een tot vier antilichamen in staat zijn om Zika virus replicatie te verbeteren op verschillende niveaus.

De hoogste toename van Zika virus titers wordt gevonden in macrofagen behandeld met sera-bevattende dengue virus serotype twee en vier antilichamen in vergelijking met serotype een en drie die een relatief lagere inductie van het Zika-virus vertonen. Het is belangrijk om een steriele omgeving te behouden, de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen en om de ontdooide virusserummonsters en QPCR-reagentia altijd op ijs te houden. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om antilichaam-afhankelijke verbetering van andere flavivirus zoals geelkoortsvirus, denguevirus, of het virus van de Nijl van het Westen te bestuderen gebruikend een paneel van geduldig serum.

Deze techniek zal zeer nuttig zijn voor het uitvoeren van toekomstige antilichaam-afhankelijke verbetering studies in het arbovirus of virologie velden. Juiste bioveiligheid niveau twee persoonlijke bescherming apparatuur moet worden gebruikt te allen tijde en al het virale afval moet worden ontsmet in 10% bleekmiddel gedurende 30 minuten voor verwijdering.