Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

Onze methode voor het oogsten van epidermale cellen van volwassen muizen is nuttig voor downstream toepassingen zoals keratinocyten stamcellen. Onze techniek is zeer reproduceerbaar en kan worden gebruikt in combinatie met in vivo procedures bij muizen in de context van het huidverwekkendeesemodel. Na het oogsten van dorsale huid monsters van geëuthanaseerde volwassen muizen, gebruik autoclaved tang en een scalpel om een dorsale huid plaats op een moment harige kant naar beneden in een dunne petrischaal en schroot uit het onderhuidse weefsel met inbegrip van het vet uit de ventrale huidweefsel totdat het weefsel is semi-doorschijnend.

Plaats de geschraapte huid in PBS totdat alle andere resterende skins zijn verwerkt. Gebruik vervolgens een scalpel om de huidmonsters in 0,5 bij één tot 1,5 centimeter te snijden. Plaats de stroken harige kant omhoog in een steriele petrischaal voordat drijvende de monsters harige kant omhoog op het oppervlak van een 20 milliliter PBS plus twee x gentamicine oplossing, aangevuld met 0,25%trypsine in een plastic 100 bij 20 millimeter petrischaal gedurende twee uur bij 32 graden Celsius.

Plaats aan het einde van de incubatie een steriele, plastic, vierkante petrischaal met 15 milliliter oogstmedium bij een helling van 30 graden en gebruik gebogen tangen om een drijvende huidstrook zorgvuldig in de schaal over te brengen. Met een nieuw scalpelblad onder een loodrechte hoek van de huid en met behulp van voldoende, maar niet overmatige kracht, schroot uit de opperhuid en de haren van het monster in het medium. Wanneer alle stroken zijn geschraapt, voorzichtig decanteren de opperhuidcel met supernatant in een steriele 60 milliliter pot met een 1,5 inch magnetische roerstaaf en spoel de petrischaal met extra oogstmedium om eventuele resterende epidermale cellen te verzamelen.

Breng het uiteindelijke volume in de pot op 30 milliliter met vers medium en roer de epidermale celoplossing op 100 rotaties per minuut gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Verwijder aan het einde van de opzwepende incubatie in een bioveiligheidskast de roerstaaf en filter de celoplossing door een zeef van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Gebruik tangen en vervolgens een pipet om de haren en de stratum corneum materialen door de zeef te drukken om het weefsel te manipuleren om de gevangen haarcellen vrij te geven en gebruik een extra vijf milliliter oogstmedium om de achterge houdende haarcellen in de buis vrij te geven.

Het is van cruciaal belang dat de epidermale cellen en de haren worden gemanipuleerd om de cellen vrij te maken van de haarzakjes. Breng het totale volume in de buis tot 50 milliliter met vers medium en verzamel de celfiltraat door centrifugatie. Resuspend de pellet in 5 milliliter vers oogstmedium in ongeveer 20 trituraties met een 5 milliliter pipet.

Neem 0,5 milliliter van de een tot 20 verdunning en breng het over naar een 2 milliliter microfuge buis. Neem na het mengen van het monster zorgvuldig 200 microliter uit de microfugebuis en meng voorzichtig met een gelijk volume van 0,4% trypanblauwe oplossing. Meng deze oplossing voorzichtig drie keer en breng de cellen over naar een hemocytometer voor het tellen van nucleated keratinocyten.

Scoor alle donkerblauwe cellen als niet-levensvatbare cellen en scoor kleine goud- en rozecellen als levensvatbare cellen. De levensvatbaarheid gemiddeld ongeveer 80%, en de uiteindelijke keratinocyten opbrengst per muis moet ongeveer 30 miljoen levensvatbare cellen. Na het tellen, verzamel de cellen met een andere centrifugatie, en voor massacultuur resuspend twee tot vier keer 10 tot de zesde levensvatbare keratinocyten per 35 millimeter Petri schotel in 2 milliliter van celkweekmedium.

Voor een clonogene kolonie vorming test, resuspend de cellen op een een keer 10 tot de derde keratinocyten per vier milliliter van gemodificeerde William's E Medium met supplementen in serum concentratie per collageen bekleed 60 millimeter Petri schotel op X-ray bestraalde Zwitserse muis 3T3 feeder lagen. Voor de massacultuur, groeien de culturen op 32 graden Celsius in 5%kooldioxide voor de juiste celcultuur periode. Het veranderen van het medium 24 uur na de eerste zaaien voor massacultuur en drie keer per week daarna.

Aan het einde van de klonale cultuur aspirate het medium en fix de kolonies in 10%gebufferd formaline 's nachts bij kamertemperatuur. De volgende ochtend, bevlek de kolonies met 0,5%rhodamine B in autoclaved water voor een uur, voordat spoelen de gerechten in koud autoclaved water totdat het water loopt duidelijk. Dan helling de gerechten op hun deksels te drogen voor het tellen van de kolonies.

Hier worden typische resultaten van keratinocytenkolonievormingstesten getoond nadat verschillende actuele behandelingen worden getoond. Haarzakle stamcellen meestal make-up ongeveer 9% van de cellen geïsoleerd van volwassen C57BL/6 muis dorsale huid zoals beoordeeld door flow cytometrische vlekken voor muis haarzakje stamcel markers. In dit cijfer kunnen de groeikenmerken van keratinocytenstamcelkolonies na cultuur onder vier verschillende middelgrote voorwaarden worden waargenomen.

Na deze procedure kunnen de cellen worden gebruikt voor flow cytometrie, fluorescentie-geactiveerde celsorling, celkweek en moleculaire biologische analyses. Deze techniek heeft ons in staat gesteld om te bepalen dat het aantal opperhuidstamcellen een kwantitatieve en complexe eigenschap is die leidt tot de identificatie van een nieuw stamcelregulerend gen.