Name: Een kwantitatieve analyse van rodopsine, vervoer door High-Content Imaging analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Leer een high-content imaging-methode om rhodopsinetransport te kwantificeren bij retinitis pigmentosa. Deze techniek gebruikt meerdere golflengten voor analyse van membraaneiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Mark E. Schurdak en de Universiteit van Pittsburgh drugontdekking Instituut voor het verstrekken van de hoge-inhoud imager en de eerste trainingen. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) deelden genereus de 1 d-4 en B630 anti-rhodopsine antilichamen. Het plasmide met cDNA voor muis rhodopsine-Venus construct werd gedeeld door Dr. Nevin Lambert (Augusta University). Dit werk werd gesteund door het Nationaal Instituut van gezondheid subsidie EY024992 YC en P30EY008098 van de Universiteit van Pittsburgh Vision onderzoek Core subsidie.

Opmerking: De rhodopsine vervoer assay.
1. voorbereiding en cultuur van cellen
<ol><li>Blazen cryo-bewaard U2OS stabiele cellen uiten het wild type (WT) of de mutant muis rhodopsine-Venus fusion eiwitten. Ontdooi de cellen bij 37 ° C totdat alleen kleine ijskristallen in het flesje zitten. Opmerking: De U2OS cellen worden gebruikt in dit protocol omdat er geen fotoreceptor cellijn beschikbaar voor in vitro studies is en de vooraf Ciliaire biosynthese van rodopsine wordt gereguleerd door soortgelijke moleculaire mechanismen in cellen van zoogdieren. Bovendien, de U2OS cellen strak hechten aan de onderkant van de plaat en hebben grote cel organen, zodat ze ideaal voor de rhodopsine vervoer assay zijn. Zeven U2OS stabiele cellen uiten de WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N en P267L rhodopsine mutanten worden gebruikt als een voorbeeld om te laten zien van de kwaliteit en betrouwbaarheid van de test. Stabiele cellen uiting van andere mutanten rhodopsine of andere membraaneiwitten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het doel van de test. Stabiele cellen uiten van menselijke rhodopsine kunnen in deze test worden gebruikt, indien beschikbaar. De muis rhodopsine werd hier gebruikt omdat muis en menselijke rhodopsine eiwitten 95% homologie delen en de verbindingen geïdentificeerd door deze test zal worden getest in vivo met behulp van een muismodel van het adRP met de rhodopsine P23H mutatie8uitvoering. De stabiele cellen werden gegenereerd, zoals eerder beschreven19. De WT en de mutant rhodopsine transcripties werden gekwantificeerd door q-PCR, en het klonen van stabiele cellen uiten van vergelijkbare niveaus van WT en mutant rhodopsine transcripties werden geselecteerd voor deze test. De expressie van rodopsine eiwitten werd bevestigd door de immunoblot en immunokleuring. De passage van de cellen die worden gebruikt in deze test moet lager zijn dan 20.</li>
	<li>Breng elke regel van cellen in een conische tube van 15 mL, met 10 mL groeimedium (hoge glucose Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 5 µg Mn/mL Plasmocin).</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 5 mL cel groeimedium voor elke regel van de cel. Elke regel van de celsuspensie Breng in een schotel van 60 mm weefselkweek en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
	<li>Subcultuur de cellen bij de weefselkweek schotel 90% samenvloeiing als bereikt in referentie12 beschreven.</li>
</ol>2. het zaaien van cellen op 5.000 cellen per Well
Opmerking: Voer de volgende procedures in de kap van een weefselkweek.
<ol><li>Behandelen van de plaat met poly-lysine.<ol>
<li>Één dag vóór het zaaien van de cellen, een zwart-muur behandelen en duidelijke 384-well bodemplaat met 20 µL per putje van poly-lysine oplossing voor 30 min.</li>
		<li>Gecombineerd de vloeistof en toestaan van alle putjes te drogen voor 1 h. uitgesteld de deksel van de plaat en de plaat bij 4 ° C's nachts voor het zaaien van de cel opslaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiden van de celsuspensie.<ol>
<li>Elke regel van de cel in groeimedium in een schotel van 100 mm weefselkweek cultuur tot 90% samenvloeiing.</li>
		<li>Elk gerecht met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) wassen en losmaken van de cellen met 1 mL van 0,05% trypsine bij 37 ° C.</li>
		<li>Resuspendeer elke regel van cellen in 10 mL assay voedingsbodem (hoge-glucose DMEM met 10% FBS, 100 eenheden/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine).</li>
		<li>Cellen tellen en elke regel van cellen naar 1.25 x 105 cellen/mL met het medium assay Verdun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het zaad van de cellen.<ol>
<li>Gebruik een elektronische meerkanaalspipet of een geautomatiseerde reagens dispenser afzien van 40 µL per putje van de celsuspensie drie kolommen per cellijn- en opvulstijlen kolommen 1-21 van de 384-well plaat (Figuur 2).</li>
		<li>Voeg toe 40 µL per putje van U2OS (P23H-rhodopsine-Venus) naar kolommen 22-23 en 40 µL per putje van U2OS (rhodopsine-Venus) naar kolom 24, als besturingselementen.</li>
		<li>Centrifugeer de plaat bij 300 x g gedurende 30 s te brengen van alle cellen aan de onderkant van de plaat 384-well. Opmerking: Vermijd fysieke schok aan de plaat na het zaaien van de cel. Anders, cellen naar een hoek van elk putje zal worden verpletterd, en de plaat zal niet geschikt voor hoge-inhoud imaging.</li>
		<li>Incubeer de 384-well plaat bij 37 ° C met 5% CO2 voor 3 h voor de cellen om te koppelen aan de onderkant van de plaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. behandeling van de cellen met de verbindingen
<ol><li>Een overzicht van de plaat met de voorwaarden van de behandeling zoals getoond in Figuur 2gegenereerd.</li>
	<li>300 µL van 5 x werkoplossingen voor maximaal 15 verbindingen in een 96-wells-plaat voor te bereiden.<ol>
<li>Verdun cps 1 tot en met 15 met de assay middellange tot vijfmaal van hun eindconcentraties in putten A1 naar G2 van de 96-wells-plaat (figuur 2A). Voeg 300 µL van assay medium in goed H2. Opmerking: De uiteindelijke concentratie van elke verbinding wordt gebruikt op de meest effectieve concentratie voor de redding van het vervoer van de P23H rhodopsine door de HTS12,13.</li>
		<li>Voeg 100 µL per putje van 2% dimethylsulfoxide (DMSO) en 25 µM 9 -cis-retinale die respectievelijk in de assay middellange tot kolommen 11 en 12, worden verdund. Voeg 9 -cis-netvlies in schemerige licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het toevoegen van 10 µL per putje van 5 x werken oplossingen aan de plaat van de 384-well gekweekt met de cellen (figuur 2B).<ol>
<li>Gebruik een elektronische multi-kanaals Pipetteer verbindingen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15 toevoegen aan rijen A, C, E, G, I, K, M en O uit kolommen 1 tot en met 21 (Figuur 2). Toevoegen van verbindingen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 en M naar rijen B, D, F, H, J, L, N en P uit kolommen 1 tot en met 21.</li>
		<li>Voeg toe 10 µL per putje van 2% DMSO aan kolommen 22 en 24. Voeg 10 µL per putje van 25 µM 9 -cis-netvlies naar kolom 23. Opmerking: DMSO wordt gebruikt als een voertuig controle omdat alle de verbindingen in eerste instantie in DMSO als voorraden opgelost worden. Kolom 22 met DMSO behandeld cellen uiten de P23H rhodopsine wordt gebruikt als het besturingselement 0%. 9 -Cis-netvlies behandelde cellen, uiting geven aan de P23H rhodopsine wordt gebruikt als de 100%-controle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De 384-well afdekplaat met aluminiumfolie en de plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur uit te broeden.</li>
</ol>4. immunokleuring zonder membraan Permeabilization om rhodopsine eiwitten op het celoppervlak vlek.
Opmerking: Vermijd een wasmiddel in het proces van de gehele immunokleuring celmembraan om intact te houden.
<ol><li>4% paraformaldehyde (PFA) bereid door verdunning van de 16% PFA met PBS in een 1:4-volumeverhouding in een chemische zuurkast. Overdracht van de 4% PFA in een reagens reservoir.</li>
	<li>Haal de 384-well-plaat in een donkere kamer met dim rood licht. Gebruik een 8-kanaals aspirator verbonden met een vacuüm collectie fles te zachtjes gecombineerd het medium. Gebruik van een elektronische meerkanaalspipet 20 µL per putje van vers bereide 4% toevoegen aan de gehele 384-well plaat PFA en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Om te voorkomen mobiele-detachement, altijd wijs de toppen van de aspirator dezelfde kant van elk putje tijdens aspiraties. Raak niet midden onder inzake elk putje. Bij het nemen van beelden, Selecteer velden om te voorkomen dat de regio geraakt door de aspirator. Voor de incubations langer dan 10 min, afdekplaat de 384-well met het deksel te voorkomen van verdamping. Opmerking: Cellen worden opgelost in een donkere kamer te vermijden photobleaching van de geregenereerde isorhodopsin die invloed op het resultaat van de 100%-controle hebben zullen. Na fixatie, kan de 384-well plaat worden genomen onder normaal licht.</li>
	<li>Gebruik een 8-kanaals aspirator gecombineerd de PFA in elk putje en gebruik van een elektronische multi-kanaals Pipet toe 50 μl per putje van PBS. Herhaal nog tweemaal uit te voeren drie wast met PBS. Let op: De afvalstoffen vloeibaar met PFA worden verzameld in een afgetopte fles en is als een gevaarlijk chemisch afval worden verwijderd na het experiment.</li>
	<li>Blokkeren van de cellen door 20 µL per putje van 5% geit serum toe te voegen aan de gehele 384-well-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
	<li>De 5% geit serum gecombineerd en 15 µL per putje van 20 µg mL-1 B6-30 anti-rhodopsine antilichaam in 1% geit serum toevoegen aan rijen A O. toevoegen 15 µL per putje van 1% geit serum naar rij P voor de secundaire antilichaam-alleen controlegroep.</li>
	<li>Incubeer de 384-well-plaat bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten of bij 4 ° C's nachts. De 384-well afdekplaat met aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching van de fluorophores.</li>
	<li>Het wassen van de plaat 3 keer met 50 µL per putje van PBS.</li>
	<li>PBS gecombineerd en voeg 15 µL per putje van 5 µg mL-1 Cy3-geconjugeerde geit anti-muis IgG antilichamen. De 384-well afdekplaat met aluminiumfolie en bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of bij 4 ° C na een nacht bebroeden.</li>
	<li>Het wassen van de plaat 3 keer met 50 µL per putje van PBS. Voeg 50 µL per putje van PBS met 1 µg mL-1 Hoechst 33342 om vlek kernen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Verzegel de 384-well-plaat met een transparante film voor imaging. De 384-well afdekplaat met aluminiumfolie en bewaren bij 4 ° C voor maximaal een week als beelden onmiddellijk worden genomen.</li>
</ol>5. beeldvorming.
Opmerking: Deze beeldvormende procedure van hoge-inhoud is aangepast aan het imaging systeem vermeld in de Tabel van materiaal. Procedures kunnen verschillen als ze zijn met behulp van andere beeldvormingssystemen van hoge-inhoud.
<ol><li>Verwijder het deksel en zet de 384-well-plaat in de hoge-inhoud imager met A1 op de linker bovenhoek van de plaat geplaatst.</li>
	<li>Open de afbeelding acquisitie software instellen van parameters voor Beeldacquisitie.<ol>
<li>De plaat overname Setup-venster te openen en nieuwe opgeven of een bestaande setup-bestand laden.</li>
		<li>Selecteer het doel 20 x en opzetten van pixel weggooien als 2 dus de geijkte pixelgrootte 0,80 x 0.80 is µm. Stel de scanlijnen als 2.000 en grootte van de afbeelding (W x H) als 1000 x 1000 pixels (800,00 x 800.00 µm) per site.</li>
		<li>Selecteer het type plaat aan het image worden gemaakt. Gebruik de informatie die door de fabrikant van de 384-well plaat te vullen in de afmetingen van de plaat.</li>
		<li>Selecteer de putjes te worden beeld voor de 384-well-plaat.</li>
		<li>Selecteer vier sites worden beeld per putje. Vermijd de kant van de goed getroffen door de aspiratie-tips.</li>
		<li>Selecteer excitatie lasers als 405, 488 en 561 nm. Emissie filters voor DAPI, FITC en Texas rood kanalen te selecteren. Optimaliseren van de kracht van de laser en winsten van elk kanaal om de helderheid van beelden uit de positieve controle putten lager dan de drempel van verzadiging.</li>
		<li>Selecteer goed-te-goed focus voor de autofocus. Selecteer de eerste put verworven als de initiële goed voor het vinden van de monsters. Bepaal site autofocus op alle sites.</li>
		<li>Selecteer vier gemiddelden per regel voor elk kanaal. Optimaliseren van de waarde van de Z-verschuiving voor elk kanaal.</li>
		<li>Test 2-3 putjes op de diagonale hoeken van de 384 goed plaat om ervoor te zorgen dat de beelden op focus zijn voor alle geteste putjes, images van alle sites per putje cellen met meer dan 40% samenvloeiing en intensiteit van de fluorescentie van alle kanalen hebben zijn ongeveer de helft verzadigd in de 100% controleputjes.</li>
		<li>Sla de afbeelding overname methode.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer de volledige plaat. Bekijk de imager totdat het klaar is met het vastleggen van beelden uit de eerste kolom van de plaat om te controleren of de beeldkwaliteit vóór het verlaten van de imager. Neem de 384-well-plaat en bewaren bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. Opmerking: Afhankelijk van het aantal websites geselecteerd per goed en de kanalen genomen, duurt 40 min 3 h tot finish imaging een 384-well plaat.</li>
</ol>6. beeldanalyse.
<ol><li>De afbeeldingsgegevens met behulp van een high-inhoud afbeelding analysesoftware uitlichten. Selecteer een van de 100%-controleputjes (kolom 23) parameters instellen.</li>
	<li>Selecteer het Scoren van de cel van de multi golflengte als de analysemethode en beginnen met het configureren van de instellingen.<ol>
<li>Definieer de kernen met behulp van beelden van de DAPI-kanaal. Controleer of de gedefinieerde kernen vormen in de geselecteerde goed sluit goed aan bij de kernen beelden bekijken.</li>
		<li>De vorm van cel definiëren in de FITC-kanaal waar rhodopsine-Venus is beeld.</li>
		<li>De rhodopsine cel oppervlakte vlek gebieden definiëren in de Texas rood kanaal.</li>
		<li>Test het huidige algoritme in 5 putten om te bepalen als de instellingen zijn geoptimaliseerd. Sla de instellingen op en sluit het venster configuratie .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alle de putjes met de geoptimaliseerde analysemethode worden uitgevoerd.</li>
	<li>Objectnummer als intact celaantal exporteren. De Gemiddelde intensiteit van de FITC-kanaal als rhodopsine-Venus intensiteit (rhodopsine-Venus INT) exporteren. De Gemiddelde intensiteit van de Texas Red-kanaal als rhodopsine intensiteit op het celoppervlak (rhodopsine INT op het celoppervlak) exporteren.</li>
	<li>Open de geëxporteerde gegevens in een spreadsheet-software. Verdeel de rhodopsine intensiteit op het celoppervlak door de rhodopsine-Venus INT als MEM-naar-total verhouding. Berekenen van de Z'-factoren voor elke parameter om te evalueren van de kwaliteit van de test. Z′ = 1−3X (STD100% controle+STD0% controle) / | :100% controle−Mean0% controle|. Opmerking: Een Z'-factor hoger dan 0 geeft aan een gematigde assay voldoende voor een hoge-inhoud-beeldscherm en een Z dat ' factor tussen 0,5 en 1 suggereert een uitstekende bepaling nodig is voor een scherm van hoge-doorvoer20,21.</li>
	<li>Gebruik de spreadsheet-software voor het genereren van een twee-kleuren warmte-kaart voor elke parameter. De naam van de cellijnen op de x-as en de verbindingen op de y-as te regelen.</li>
</ol>

<ol><li>Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Stenson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Gene+Mutation+Database%3A+towards+a+comprehensive+repository+of+inherited+mutation+data+for+medical+research%2C+genetic+diagnosis+and+next-generation+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies.</a> Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).</li>
<li>Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mutant+rhodopsins+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).</li>
<li>Athanasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+reveals+potential+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).</li>
<li>Chiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Endoplasmic+Reticulum-Associated+Degradation+of+Rhodopsin+Precedes+Retinal+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration.</a> Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).</li>
<li>Sakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+of+photoreceptor+degeneration+in+a+new+mouse+model+of+the+common+form+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+due+to+P23H+opsin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).</li>
<li>Dryja, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+rhodopsin+gene+in+patients+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).</li>
<li>Sohocki, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+mutations+causing+retinitis+pigmentosa+and+other+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies.</a> Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+chaperone+of+rod+opsin+and+its+potential+therapy+for+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration.</a> Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assays+to+identify+small+molecules+preventing+photoreceptor+degeneration+caused+by+the+rhodopsin+P23H+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation.</a> Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Drug+Screening+Strategy+for+Detecting+Rhodopsin+P23H+Mutant+Rescue+and+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).</li>
<li>Noorwez, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone-mediated+in+vivo+folding+and+stabilization+of+the+P23H-opsin+mutant+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).</li>
<li>Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+fate+of+mutant+rhodopsin%3A+quality+control%2C+degradation+and+aggresome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation.</a> Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).</li>
<li>Kaushal, S., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin.+7.+Point+mutations+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).</li>
<li>Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+NIH3T3+cell+lines+expressing+opsin+and+the+P23H+opsin+mutant+identifies+candidate+drugs+for+the+treatment+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa.</a> Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).</li>
<li>Adamus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-rhodopsin+monoclonal+antibodies+of+defined+specificity%3A+characterization+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application.</a> Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).</li>
<li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+mutations+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.+Clustering+of+functional+classes+along+the+polypeptide+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).</li>
<li>Krebs, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+and+the+efficacy+of+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier, toonden we een hoge-inhoud imaging assay gebruikt voor het karakteriseren van hits geïdentificeerd van een HTS. De enige automatisering die betrokken zijn bij deze protocollen is de high-inhoud imager. De immunokleuring en fluorescentie beeldvorming van rodopsine zijn vaak gebruikt om het karakteriseren van de lokalisatie van rodopsine5,14,15,16. De kwantificering van de beelden genomen d...

Eiwit misfolding is betrokken bij spierdystrofie, neurale degenerations, evenals de verblindende ziekten, met inbegrip van retinitis pigmentosa (RP)1. RP is een overgenomen en Progressieve Retina degeneratie geassocieerd met mutaties in meer dan 60 genen beïnvloeden de functie en de homeostase van rod researchdieren of de retinale pigment epitheliums (RPEs)2,3. Geen effectieve behandeling is momenteel beschikbaar voor RP. Rodopsine mutaties zijn goed voor ongeveer 25-30% van autosomaal dominant (ad) RP gevallen. Onder de meer dan 150 rhodopsine mutaties4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), de klasse II-mutaties veroorzaken de structurele instabiliteit van de rhodopsine proteïne dat aan de staaf fotoreceptor dood bijdraagt en visie verlies5,6,7,8. De P23H is de meest voorkomende rhodopsine mutatie in Noord-Amerika, dat is ook een typisch voorbeeld van de klasse II rhodopsine mutaties9,10. Als gevolg van de inherente structurele instabiliteit, wordt de misfolded rhodopsine geaccumuleerd in het endoplasmatisch reticulum (ER) in zoogdiercellen, overwegende dat de wild type rhodopsine zich op het plasma-membraan5 bevindt. De misfolded rhodopsine P23H mutant exposities dominante negatieve cytotoxiciteit die is niet te wijten aan haploinsufficiency, maar is gerelateerd aan de activering van ER geassocieerde eiwit aantasting van het traject en de organisatie van de buitenste segment onderbroken staaf. Om te verlichten staaf fotoreceptor cel stress, is een strategie te stabiliseren de inheemse vouwen van de mutant rhodopsine met behulp van een farmacologische chaperon.
Om dit te bereiken, hebben we een cel-gebaseerde high-throughput scherm (HTSs)11,12,13 met behulp van een β-galactosidase fragment complementatie assay te kwantificeren van de P23H rhodopsine mutant vervoerd op het plasma uitgevoerd membraan. Het robuuste en eenvoudige protocol voor deze HTS-test konden we verkennen van de activiteiten van ongeveer 79.000 kleine molecules voor elk scherm. Echter omdat deze HTS-assay luminescentie signalen leest, zijn valse positieven, met inbegrip van de β-gal-remmers, gekleurde of cytotoxische stoffen opgenomen in de hit-lijst te wachten om te worden geïdentificeerd met een secundaire assay.
De traditionele immunokleuring en fluorescentie beeldvormende methoden zijn gebruikt voor jaren te bestuderen van het vervoer van rodopsine in zoogdiercellen5,14,15,16. Echter, deze conventionele methoden te kwantificeren farmacologische effecten van meer dan 10 verbindingen naar rhodopsine vervoer omdat een betrouwbare beeldvormende analyse vereist een groot aantal opnamen onder een zeer consistente voorwaarde, die kunnen niet worden gebruikt niet geamendeerd door de conventionele beeldvormende methoden. Hier, ontwikkelden we een immunokleuring gebaseerd high-inhoud imaging protocol als een secundaire assay te kwantificeren van de cel oppervlaktevervoer misfolded rhodopsine mutanten11,13,17. Om rhodopsine op het plasma-membraan van een label, overgeslagen we de stap van de celmembraan permeabilization en immunostained de mutanten rhodopsine door een monoclonal (B6-30) anti-rhodopsine herkennen van de N-terminale epitoop van rodopsine aan de extracellulaire kant van de cel membraan18. Om te visualiseren de mutant rhodopsine in de hele cel, gesmolten we rhodopsine met de Venus fluorescentie eiwit. Door de kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie in verschillende fluorescentie kanalen zijn wij in staat om meerdere parameters van één enkele experiment met inbegrip van de totale rhodopsine intensiteit in de hele cel op het celoppervlak, en de verhouding van Rodopsine fluorescentie op het celoppervlak aan die in de hele cel. Toepassing van deze methode om stabiele cellen uiten van een totaal van zes misfolded rhodopsine mutanten, we kunnen het genereren van een farmacologisch profiel van meerdere kleine molecuul chaperones naar deze mutanten. In dit protocol, alle cellen zijn immunostained in een 384-well-plate en beeld met behulp van een geautomatiseerd imaging systeem onder een zeer consistente imaging voorwaarde. Een beeldanalyse wordt uitgevoerd aan elk putje, met beelden van meer dan 600 cellen om variatie als gevolg van de heterogeniteit van de cellen met verschillende celniveau vorm en eiwit expressie. De workflow van dit protocol is samengevat in Figuur 1. Het voordeel van deze methode is dat we hoge resolutie beelden evenals Multi-parameter ondermeer uit het beeld-gebaseerde analyse krijgen. In het algemeen, kan dit protocol worden aangepast en toegepast om te kwantificeren van het vervoer van een misfolded membraan eiwit van belang.

<table><tbody><tr><td>U2OS (rhodopsin-Venus) cellen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabile cellen gegeneerd uit U2OS cellen</td></tr><tr><td>U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cellen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabile cellen gegeneerd uit U2OS cellen</td></tr><tr><td>U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cellen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabile cellen gegeneerd uit U2OS cellen</td></tr><tr><td>U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cellen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabile cellen gegeneerd uit U2OS cellen</td></tr><tr><td>U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cellen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabile cellen gegeneerd uit U2OS cellen</td></tr><tr><td>U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cellen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabile cellen gegeneerd uit U2OS cellen</td></tr><tr><td>U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cellen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabile cellen gegeneerd uit U2OS cellen</td></tr><tr><td>DMEM hoge glucose</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>Met L-Glutamine, natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Heat geïnactiveerd</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>Mycoplasma eliminatie reagens</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X geconcentreerde antibiotica oplossingen om bacteriënbesmetting van celculturen te voorkomen</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>0.25%, 1mM EDTA in HBSS zonder calcium en magnesium</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol wt 70.000-150.000, 0.01%, sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Microplates</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>384-well tissue culutre-behandelde microplates met zwarte welwanden en een optisch heldere cyclische olefine bodem voor het afbeelden van cellen in hoogwaardige analyse</td></tr><tr><td>Steriele 96-well plate</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>Weefsel gekweekt met platte bodem, sterieel, vrij van detecteerbare pyrogenen, Rnase, DNase en DNA. Niet-cytotoxisch</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x PBS Buffer, pH 7.4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99,5%, celcultuur getest</td></tr><tr><td>9-cis-retinaal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>Verbonden getest</td><td>Selleckchem/Life Chemicals/Aangepast gesynthetiseerd</td><td>NA</td><td>Verbindingen werden gekocht bij verschillende leveranciers of op maat gesynthetiseerd</td></tr><tr><td>B6-30 anti-rhodopsin antilichaam</td><td>Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>Cadeau van Dr. Krzysztof Palczewski</td></tr><tr><td>Cy3-geconjugeerd geiten anti-muis secundair antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Methanol-vrij</td></tr><tr><td>10% Normaal geitenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>Blocking buffer</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Kernkleuring oplossing</td></tr><tr><td>High-content imager</td><td>Molecular Devices</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg; Micro Confocal High-Content Imaging System</td></tr><tr><td>MetaXpress high-content beeldverwerving en analyse software</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaXpress</td><td>High-content beeldverwerving en analyse software</td></tr><tr><td>Multikanaals pipet (0,5-10 &micro;L)</td><td>Rainin</td><td>17013802</td><td>Handmatige 8-kanaals pipet, 0,5-10 &micro;L</td></tr><tr><td>Multikanaals pipet (0,5-10c</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>Handmatige 8-kanaals pipet, 20-200 &micro;L</td></tr><tr><td>Elektronische multikanaals pipet (10-200 &mu;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>Elektronische multikanaals pipet voor 96- en 384-well microplate pipetting taken</td></tr><tr><td>50ml Reagens Reservoir</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-125</td><td>Reagens reservoir voor multikanaals pipette dispensering</td></tr><tr><td>8-Kanaals aspirator</td><td>ABC Scientific</td><td>EV503</td><td>8-Kanaals roestvrijstalen adapter voor het afzuiging van vloeistoffen uit 96- of 384-well platen</td></tr><tr><td>Excel spreadsheet software</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>De spreadsheetsoftware voor dataanalyse en heatmap generatie</td></tr><tr><td>Origin2018 wetenschappelijke data analyse en grafiek software</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>De data analyse software voor het genereren van de dosisresponscurven</td></tr></tbody></table>

een kwantitatieve analyse van rodopsine, vervoer door high-content imaging analyse

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rodopsine misfolding mutaties leiden tot de dood van rod fotoreceptor dat manifesteert zich als autosomaal dominante retinitis pigmentosa (RP), een progressieve ziekte die mist van effectieve behandeling verblindende. We veronderstellen dat de cytotoxiciteit van de mutant misfolded rhodopsine kan worden verlicht door het farmacologisch stabiliseren de mutant rhodopsine proteïne. De P23H mutatie, onder de andere klasse II rhodopsine mutaties, codeert een structureel unstable rhodopsine mutant eiwit dat is gecumuleerd in het endoplasmatisch reticulum (ER), overwegende dat de wild type rhodopsine wordt getransporteerd naar het plasmamembraan in zoogdieren cellen. Wij eerder uitgevoerd een scherm high-throughput luminescentie gebaseerde (HTS) en een groep van farmacologische chaperones die gered van het vervoer van de P23H rhodopsine van ER naar het plasmamembraan geïdentificeerd. Hier, met behulp van een methode van immunokleuring gevolgd door een hoge-inhoudsanalyse imaging, we de mutant rhodopsine eiwit bedrag in de hele cel en op het plasma-membraan gekwantificeerd. Deze methode is informatief en effectief te identificeren waar treffers van valse positieven na HTS. Bovendien, de hoge-inhoud beeldanalyse ons in staat gesteld te kwantificeren van meerdere parameters van een enkele experiment te evalueren van de farmacologische eigenschappen van elke stof. Met behulp van deze test, geanalyseerd wij het effect van 11 verschillende verbindingen naar zes RP verbonden rhodopsine mutanten, het verkrijgen van een 2D-farmacologische profiel voor een kwantitatieve en kwalitatieve inzicht over de structurele stabiliteit van deze rhodopsine mutanten en de werkzaamheid van verschillende verbindingen naar deze mutanten.

We gekenmerkt het rhodopsine vervoer met drie parameters: de intensiteit van rodopsine-Venus in de hele cel (rhodopsine-Venus INT), de intensiteit van immunokleuring van rodopsine op het plasma-membraan (rhodopsine INT op het celoppervlak), en de verhouding tussen Rodopsine vlek op het celoppervlak aan rhodopsine-Venus intensiteit in de hele cel (MEM-totaal Ratio). Een representatief resultaat voor de bepaling van rodopsine vervoer wordt weergegeven in Figuur 3</stron...

We beschreven hier, een hoge-inhoud beeldvorming methode om te kwantificeren van het vervoer van rodopsine mutanten retinitis pigmentosa is gekoppeld. Een meerdere-golflengte scoren analyse werd gebruikt voor het kwantificeren van rodopsine eiwitten op het celoppervlak of in de hele cel.

Een kwantitatieve analyse van rodopsine, vervoer door High-Content Imaging analyse

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Rhodopsine misfolding veroorzaakt progressieve retinale degeneratie genaamd retinitis pigmentosa. Terwijl een traditionele beeldvormingsmethode beperkte capaciteit heeft om het rhodopsinetransport te kwantificeren, zorgt deze nieuw ontwikkelde beeldgebaseerde test voor een hoge doorvoerscreening, waardoor valse positieven worden geëlimineerd. Deze techniek maakt een snelle evaluatie van de farmacodynamica van geneesmiddelen mogelijk.In het oog van het redden van het vouwen van ziekteverwekkende rhodopsine, waardoor het potentieel voor een behandeling voor de stille onbehandelbare en verblindende ziekte, retinitis pigmentosa wordt versneld. De cellulaire lokalisatie van een membraaneiwit is erg belangrijk voor zijn functie. Deze methode kan eenvoudig worden gewijzigd en toegepast om het transport van een ander membraaneiwit van belang te kwantificeren.Zorg ervoor dat u een plaat kaart voor te bereiden en voorzichtig toe te voegen en aanzuigen vloeistof uit elke put van de plaat, om celnummer en de immuno state voorwaarden consistent tussen de cellen te houden. Dit levert een hoge Z-factor en betrouwbare resultaten op. Om te beginnen, zaad 5000 cellen per goed in een zwarte ommuurde, heldere bodem, poly lysine behandeld 384-well-plate.Incubeer de plaat op 37 graden Celsius met vijf procent CO2 gedurende drie uur voor de cellen te hechten aan de bodem van de plaat. Gebruik vervolgens een multichannel pipet om 10 microliters per put van 5X werkoplossingen toe te voegen, volgens een vooraf bepaalde plaatkaart zoals die hier wordt getoond. Voeg nu 10 microliter per put van 2%DMSO toe aan de kolommen 22 en 24.Voeg ook 10 microliter per put van 25 micromolar 9-cis-retinal toe aan kolom 23 in een donkere kamer onder zwak rood licht. Wanneer u klaar bent met het laden van alle verschillende testverbindingen, dek de plaat af met aluminiumfolie en broed gedurende 24 uur in op 37 graden Celsius. Haal de 384-well-plate in een donkere kamer met schemerig rood licht.Hier, met behulp van 8-kanaals-aspirator, aangesloten op een vacuüm collectie fles, om zachte aspirate het medium uit de putten van de plaat. Gebruik vervolgens een multichannel pipet om 20 microliters per goed van vers bereide 4%Paraformaldehyde toe te voegen aan de gehele 384-well-plate, en bevestig de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na fixatie, plaats de plaat in normaal licht.Daar, gebruik maken van een 8-kanaals-aspirator, om de Paraformaldehyde aspirate in elke put, en gebruik een multichannel pipet om 50 microliters per put van PBS toe te voegen. Aspirate en vervang de PBS voor een totaal van drie wascycli. Voeg vervolgens 20 microliter per put van 5% geitenserum toe aan elke put en broed de plaat 30 minuten lang uit bij kamertemperatuur.Na incubatie, aspiraat de putten, en voeg 15 microliter van 20 microgram per milliliter B630 anti-rhodopsine antilichaam, in 1%geit serum aan de putten in rijen A naar O.Next, voeg 15 microliter per put van 1%geit serum naar rij P voor de secundaire antilichaam alleen controlegroep. Broed de plaat op kamertemperatuur gedurende 90 minuten, of op vier graden Celsius 's nachts. Bedek vervolgens de plaat met aluminiumfolie om fotobleaching van de fluoroforen te voorkomen.Was vervolgens de plaat drie keer met 50 microliter per put pbs. Na de laatste wasbeurt, aspirate de PBS, en voeg 15 microliter per put van vijf microgram per milliliter cy3-gevoegde geit anti-muis IgG antilichaam. Bedek de plaat met aluminiumfolie en ontcubeer de monsters een uur lang bij kamertemperatuur.Na de incubatie was je de plaat drie keer. Voeg vervolgens 50 microliter per put pbs toe, met een microgram per milliliter Hoechst-vlek bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Tot slot, verzegel de put plaat met een transparante film, bedek het met aluminiumfolie, en bewaar op vier graden Celsius voor maximaal een week.Verwijder de folie en plaats de monsterplaat in een afbeeldingsafbeelding met een hoog gehalte, met A1 in de linkerbovenhoek van de plaat. Open vervolgens de software voor het verkrijgen van afbeeldingen om parameters voor het verwerven van afbeeldingen in te stellen. Open het installatievenster voor plaatacquisitie en maak een nieuwe instelling of laad een bestaand installatiebestand.Selecteer de doelstelling 20X en stel pixel binning in als twee, zodat de gekalibreerde pixelgrootte 0,80 bij 0,80 micron is. Stel vervolgens de scanlijnen in op 2000 en de afbeeldingsgrootte als 1000 bij 1000 pixels per site. Selecteer vervolgens het te beelden plaattype.Gebruik de door de fabrikant verstrekte informatie om de plaatafmetingen in te vullen. Selecteer nu de putten die moeten worden afgebeeld, samen met vier sites die per put moeten worden afgebeeld. Vermijd de zijkant van de put, die worden geraakt door de aspiratie tips.Selecteer voor beeldvorming excitatielasers als 405, 488 en 461 nanometer. Selecteer vervolgens de emissiefilters voor de kanalen DAPI, FITC en Texas Red. Optimaliseer de laserkracht en de winsten van elk kanaal, om ervoor te zorgen, de positieve controleputten zijn niet verzadigd.Selecteer goed om goed scherp te stellen voor autofocus. Selecteer vervolgens de initiële put die moet worden verworven en stel de site autofocus in voor alle sites. Selecteer ook vier gemiddelden per regel voor elk kanaal en optimaliseer de Z-offsetwaarde voor elk kanaal.Valideren, dat alles goed is ingesteld, door eerst het testen van twee tot drie putten op de hoeken van de plaat, om ervoor te zorgen dat de beelden zijn op focus voor alle geteste putten. Controleer vervolgens of afbeeldingen van alle sites per put cellen hebben met meer dan 40% samenvloeiing. Tot slot, controleer, dat de fluorescentie intensiteiten in alle kanalen zijn allemaal ongeveer de helft verzadigd in de 100%controle putten.Sla vervolgens de methode voor het verkrijgen van afbeeldingen op en voer de hele plaat uit. Bekijk de imager totdat deze klaar is met het vastleggen van beelden van de eerste kolom van de plaat om de beeldkwaliteit te controleren voordat u de afbeeldingsmaker verlaat. Wanneer u klaar bent, verwijder de plaat en bewaar deze op vier graden Celsius voor toekomstig gebruik.Haal afbeeldingsgegevens tevoorschijn met behulp van een software voor beeldanalyse met hoge inhoud. Selecteer een van de 100% controleputten in kolom 23 om de parameters in te stellen. Selecteer eerst de multigolflengtecelscore als analysemethode en begin met het configureren van de extra instellingen.Definieer de kernen met afbeeldingen van het DAPI-kanaal. Voorbeeld, om ervoor te zorgen dat de gedefinieerde kernen vormen in de geselecteerde goed past goed bij de kernen beelden. Definieer vervolgens de vorm van cel in het FITC-kanaal, waar Rhodopsin Venus wordt afgebeeld.Om dit te bereiken, het opzetten van minimale en maximale diameters van elke cel, minimale fluorescentie intensiteit boven de achtergrond, evenals minimale oppervlakte van elke cel. Nu, definieer de rhodopsine cel oppervlak vlekken gebieden in de Texas Red kanaal, door het opzetten van de minimale en maximale diameters van de cel vorm, minium fluorescentie intensiteit boven de achtergrond, evenals minimale oppervlakte van elke gekleurde cel. Test het huidige algoritme in vijf putten om te bepalen of de instellingen zijn geoptimaliseerd.Sla vervolgens de instellingen op en sluit het configuratievenster. Voer alle putten uit met de geoptimaliseerde analysemethode. Als u klaar bent, exporteert u het objectnummer als het intacte celnummer.Exporteer de gemiddelde intensiteit van het FITC-kanaal als de Rhodopsin Venus-intensiteit en exporteer de gemiddelde intensiteit van het Texas Red Channel als Rhodopsine-intensiteit op het celoppervlak. Gebruik de spreadsheetsoftware om voor elke parameter een tweekleurige heatmap te genereren. Schik de naam van cellijnen op de x-as en de verbindingen op de y-as.Hier, onze beelden van P23H rhodopsine Venus behandeld U2OS cellen, het uitdrukken van Venus fluorescentie in het groen, en het celoppervlak immuno-kleuring in het rood. Cellen werden ofwel behandeld met DMSO of vijf micromolar 9-cis-retinale. De rhodopsine transporttest, waarbij de rhodopsinehoeveelheid in de hele cel onder verschillende omstandigheden wordt vergeleken, vertoont een aanzienlijk herstel in de P23H-gemuteerde cellijn, wanneer deze wordt behandeld met 9-cis-retinale.Bovendien zijn de rhodopsineintensiteit op het celoppervlak en de verhouding van rhodopsinevlek op het celoppervlak tot de intensiteit van rhodopsine Venus in de hele cel niet significant lager voor de P23H-mutant, vergeleken met het wilde rhodopsine dat met DMSO wordt behandeld. Een heat map is een efficiënte manier om de gemiddelde rhodopsine hoeveelheid en lokalisatie per cel te vergelijken over meerdere mutanten. Hier worden wildtypecontroles en zes rhodopsinemutanten horizontaal vermeld en worden de effecten van samengestelde behandelingen verticaal vergeleken.In overeenstemming met eerdere studies zijn de rhodopsineintensiteit op het celoppervlak en de verhouding van rhodopsinevlek op het celoppervlak tot de intensiteit van rhodopsine Venus lager voor de zes mutanten in vergelijking met het wildtype dat met DMSO wordt behandeld. Verbindingen een, twee, zes en negen aanzienlijk verhoogd de verhouding van rhodopsine vlek op het celoppervlak rhodopsine Venus intensiteit in T4R, P23H, D190N, en P267L rhodopsine mutanten, wat suggereert dat deze verbindingen het vervoer van deze rhodopsine mutanten te redden naar het plasmamembraan. Houd er rekening mee dat cellen tussen de 50 en 70% confluent moeten zijn voor fixatie, omdat dit essentieel is voor beeldanalyse.Ook toonden we beelden van een putten over de hele plaat. Zorg ervoor dat beelden scherp zijn en dat de fluorescentie, die niet wordt verlaten, alle drempelwaarde voor elk kanaal heeft. Tot een selectie verbindingen, die te redden verkeerd gevouwen rhodopsine vervoer, kunnen we valideren het proces, dan passeren de werkzaamheid van deze verbindingen in vivo, met behulp van een muis-model uitdrukken van de rhodopsine P23H mutant.Deze methode stelt ons in staat om membraan eiwit hoeveelheid kwantificeren, en de lokalisatie ervan. Daarom is het een geweldig hulpmiddel voor micro fout begonnen op membraan eiwit per assist opslaan en degradatie. Paraformaldehyde, zoals in dit experiment, heeft procedures met betrekking tot de behandeling van dit reagens.Het zal worden gedaan onder de motorkap. Afval, met inbegrip van dit reagens, moet op de juiste wijze als gevaarlijke chemische stof worden afgevoerd.

a-rhodopsin-transport-assay-by-high-content-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We beschrijven een methodiek combineert geautomatiseerde cel kweken met een hoog-content imaging te visualiseren en te kwantificeren meerdere cellulaire processen en structuren, in een high-throughput manier. Dergelijke methoden kunnen helpen bij de verdere functionele annotatie van genomen en te identificeren ziektegen netwerken en potentiële drug targets.

Hoog gehalte Screening bij neurodegeneratieve ziekten

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

Een construct dat codeert TMEM184A met een GFP-tag aan het carboxy-uiteinde ontworpen voor eukaryotische expressie, werd gebruikt in testen die de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen bevestigen.

Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

Dit rapport beschrijft de screening van verschillende detergenten voor de voorbereiding van de visuele GPCR, rododenine, en het complex met mini-Go. Biochemische methoden die de kwaliteit van het complex in verschillende stadia tijdens de zuivering karakteriseren, worden gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar andere membraan eiwitcomplexen voor hun toekomstige structurele studies.

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Dit protocol beschrijft een lipofuscine accumulatiemodel in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheel (RPE) culturen en een verbeterde buitensegment (OS) fagocytosetest om het totale OS-verbruik / degradatievermogen van de RPE te detecteren. Deze methoden overwinnen de beperkingen van eerdere lipofuscinemodellen en klassieke pulse-chase buitenste segment fagocytose-assays.

Verbeterde lipofuscinemodellen en kwantificering van de fagocytosecapaciteit van het buitenste segment in sterk gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheelculturen

Hier beschrijven we twee kwantitatieve methoden voor het bestuderen van de eiwit-ligand interacties van vitamine A-membraanreceptoren en fotoreceptoropsine met hun respectievelijke fysiologische liganden.

Methodologie voor het bestuderen van interacties van vitamine A-membraanreceptoren en opsine-eiwit met hun liganden bij het genereren van het retinylideen-eiwit

Leer een high-content imaging-methode om rhodopsinetransport te kwantificeren bij retinitis pigmentosa. Deze techniek gebruikt meerdere golflengten voor analyse van membraaneiwitten.

Een kwantitatieve analyse van rodopsine, vervoer door High-Content Imaging analyse

Meer video's verkennen