Name: Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer hoe u leukocytenegress kwantificeert in muizenhuid en tumoren met behulp van in vivo fotoconversie. Deze methode maakt het volgen van endogene immuuncellen mogelijk voor onderzoek naar immuunresponsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Dr. Marcus Bosenberg voor het verstrekken van YUMM 1.1 en YUMM 1.7 lymfkliertest melanoom lijnen en Dr. Deborah J. Fowell voor het verstrekken van B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr muizen in overleg met RIKEN BRC via de nationale Bio-bron van de MEXT, Japan.

Alle dierlijke protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Oregon Health & Science University.
1. de inductie van ontsteking en FITC schilderij van muis Pinna
<ol><li>In een laminaire flow-kap, anesthetize een C57Bl/6-muis met behulp van gevaporiseerde isofluorane (induceren bij 3-5% isofluorane en zorg ervoor dat u 1-3% isofluorane; zuurstof debiet op 0.5-1.0 L/min). Zorgen voor goede afstomping door controle op het verlies van pedaal reflex, onwillekeurige bewegingen en respiratoire tarief.</li>
	<li>Leg een oor plat met de ventrale zijde van het oor naar boven. Pipetteer 20 µL van 5% FITC-oplossing opgelost in 1:1 aceton: dibutylftalaat (DBP) aan de ventrale zijde van oor pinna. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.</li>
	<li>24 h na FITC toepassing, euthanaseren de muizen via kooldioxide blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie. De veervormige oor in PBS verzamelen door het scheiden van de oren van het hoofd met behulp van schaar. De cervicale dLNs en inguïnale niet-drainage LNs in PBS met pincet te scheiden van de LNs van omringende weefsels verzamelen. Lies niet-drainage LNs zal dienen als negatieve controles op de aanwezigheid van FITC+/Kaede rode+ leukocyten. Verwijdering van karkassen per institutionele protocol. Opmerking: De optimale tijd post photoconversion voor analyse zal afhangen van het celtype en bekende trekkende gedrag. Dendritische cellen, kunnen bijvoorbeeld worden opgespoord in dLNs als vroeg als 6 h post DBP toepassing.</li>
</ol>2. de inductie van ontsteking en Photoconversion van muis Pinna
<ol><li>Anesthetize in de kap van een laminaire flow, een Kaede-Tg muis (achtergrond C57Bl/6) door intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine, opgelost in een zoutoplossing. Zorg ervoor u juiste afstomping zoals beschreven in stap 1.1.</li>
	<li>Leg een oor plat met de ventrale zijde van het oor naar boven. Pipetteer 20 µL van een 1:1 aceton: DBP aan de ventrale zijde van de pinna oor. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.</li>
	<li>Na toepassing van de DBP, Knip een spleet in een stuk aluminiumfolie en hecht van het oor door de gleuf aan het blootstellen van het oor naar de violet licht bron. Leg het oor plat met de dorsale zijde naar omhoog met behulp van dubbelzijdige tape teneinde het oor aan de folie.</li>
	<li>Plaats het oor direct onder de lichtbron, alsmede de photoconvert gedurende 3 minuten met behulp van een 405 nm lichtbron op 100 mW kracht.</li>
	<li>24u na photoconversion, euthanaseren de Kaede-Tg muizen en de oogst van het oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs zoals beschreven in stap 1.3. Opmerking: Naast overwegingen aangehaald in stap 1.3, de tarieven van proliferatie bepalend zijn voor de timing van de analyse als het verlies van Kaede rood optreden zal in de cellen snel te verdelen.</li>
</ol>3. "vacciniavirus" infectie van muis Pinna en FITC-toepassing
<ol><li>Anesthetize een C57Bl/6 muis met gevaporiseerde isofluorane zoals beschreven in stap 1.1.</li>
	<li>Leg de ventrale zijde van het oor plat. Pipetteer 5 x 106 plaque-vormende eenheden (PFU) van het "vacciniavirus" virus (VacV) verdund in 10 µL van PBS op de pinna oor. Met behulp van een 29-gauge-naald, steken de pinna 25 keer40.</li>
	<li>24 uur na infectie, anesthetize VacV-geïnfecteerde muizen met isofluorane zoals beschreven in stap 1.1 en Pipetteer 20 µL 5% FITC in aceton op de ventrale zijde van de pinna oor opgelost. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.</li>
	<li>24 h na FITC toepassing, euthanaseren van de muizen en de oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs verzamelen zoals beschreven in stap 1.3. Opmerking: FITC kan worden toegepast op eventuele infecties tijd punt bericht om te bepalen van DC mensenhandel op verschillende tijdstippen van de 24 h. Eerder meldden wij dat DC migratie naar dLNs op een vergelijkbaar niveau van dag 1 tot en met 3 post infectie41wordt gehandhaafd.</li>
</ol>4. "vacciniavirus" infectie van muis Pinna en Photoconversion.
<ol><li>Anesthetize een Kaede-Tg muis met gevaporiseerde isofluorane zoals beschreven in stap 1.1.</li>
	<li>Infecteren de pinna oor met VacV zoals beschreven in stap 3.2.</li>
	<li>24u na infectie, anesthetize VacV-geïnfecteerde Kaede muizen zoals beschreven in stap 2.1 en photoconversion uit te voeren zoals beschreven in stap 2.3-2.4.</li>
	<li>24 h na photoconversion, euthanaseren van de muizen en de oogst van het oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs zoals beschreven in stap 1.3. Opmerking: Zoals hierboven vermeld in stap 3.4, photoconversion kan worden beheerd op een tijd-punt post-infectie.</li>
</ol>5. oor en lymfeklier verwerking voor stroom Cytometry
<ol><li>Maken van eencellige schorsingen van oor veervormige: schil uit elkaar de ventrale en dorsale zijkanten van het oor pinna twee paar pincet en plaats met de binnenkant van het oor naar beneden in de putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund Henks gebufferde zout oplossing (HBSS) (met Ca2 + en Mg2 +). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten druk op het weefsel verteerd door een 70 µm nylon cel zeef.</li>
	<li>Maken van eencellige schorsingen van LNs: LNs in putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund in HBSS plaatsen. Open de lymfeklier capsule met behulp van twee 29-gauge naalden, en vervolgens uit te broeden de lymfeknopen bij 37 ° C gedurende 30 minuten druk op het weefsel verteerd door een 70 µm nylon cel zeef plagen.</li>
</ol>6. intradermale Melanoma Tumor implantatie en Photoconversion.
<ol><li>Scheren van de vacht van het midden van de achterkant van een Kaede-Tg-muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat.</li>
	<li>Plaats een 29-gauge naald in het midden van de rug tussen de linker- en rechter boven scapulae, en 5 x 105 tumorcellen (verdund in 50 µL zoutoplossing) intradermaal injecteren in de huid van Kaede-Tg muizen. Tumoren moeten zorgvuldig worden geplaatst zodat de lymfedrainage naar opgegeven lymfeklieren (d.w.z., links en rechts brachialis LNs voor tumoren in het midden van de bovenrug geplaatst). Vermijd het plaatsen van de tumor boven dLN als dit leiden directe photoconversion van de LNs via de huid/tumor tot kan.</li>
	<li>Toestaan dat de tumoren groeien tot de gewenste grootte (100-650 mm3).</li>
	<li>Een dag voorafgaand aan weefsel collectie, een muis Kaede-Tg anesthetize zoals beschreven in punt 2.1 en scheren van elk nieuw regrown vacht rond de tumor.</li>
	<li>Een circulaire gat in aluminiumfolie en haal de tumor door de tumor aan de lichtbron bloot te stellen. Het gat iets kleiner dan de tumor om te voorkomen dat de tumor terug te vallen door het gat en de conversie van aangrenzende, niet-tumor huid te minimaliseren.</li>
	<li>Plaats van de tumor direct onder de lichtbron en photoconvert voor 5 min met behulp van een lichtbron voor 405 nm bij 200 mW vermogen.</li>
	<li>24 h na photoconversion, euthanaseren de muizen zoals beschreven in stap 1.3. De tumoren, brachialis dLNs en inguïnale niet-drainage LNs in PBS verzamelen. Snij van de tumoren uit de buurt van de omliggende huid met behulp van schaar en verwijder LNs zoals beschreven in stap 1.3.</li>
</ol>7. de tumor en lymfeklieren verwerking voor stroom Cytometry
<ol><li>Maken van eencellige schorsingen van de tumoren: gehakt van de tumoren met een schaar in putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund in HBSS. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. pers het verteerd weefsel door een 70 µm nylon zeef.</li>
	<li>Maak één celsuspensie van lymfklieren zoals beschreven in stap 5.2.</li>
</ol>8. antilichaam kleuring voor stroom Cytometry
<ol><li>Voer na het verteren van de weefsels in eencellige schorsingen, standaard stroom cytometry kleuring technieken om de cellen van een label met markeringen van belang. Kort, Pipetteer 2 x 106 cellen in een 96-wells-plaat. Incubeer de monsters met Fc blok (1 µg/mL) voor 20 min op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer (1% bovien serumalbumine in PBS). Live/dode vlek (verdund in PBS) toevoegen aan de monsters en incubeer gedurende 15 minuten op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer. Incubeer met primaire antilichamen (Tabel of Materials) verdund in FACs buffer gedurende 30 minuten op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer. Opmerking: Kaede groen en Kaede rode fluorescentie met FITC en PE fluorophores overlapt; Dus, FITC en PE-geconjugeerde antilichamen kunnen niet worden gebruikt in combinatie met Kaede eiwitten.</li>
	<li>Na kleuring, de monsters worden uitgevoerd op een cytometer van de stroom. Als alternatief, het herstellen van de cellen met de 2% PFA.</li>
</ol>9. Stroom Cytometry analyse
<ol><li>Stel de FITC (Kaede groen) en PE (Kaede rood) kanaal bet spanningen tot 70-80% van het totale bereik (centreren bevolking op ongeveer 104) met ex vivo Kaede groene of rode Kaede eenkleurige splenocytes of bloed. Opmerking: Niet compenseren de Kaede groen (FITC) en Kaede rood (PE) kanalen zoals dit in meer signaal verspreid resulteren zal.<ol>
<li>Eenkleurige Kaede als besturingselementen wilt maken, een milt of bloed van een Kaede-Tg muis te verzamelen. Lyse van de rode bloedcellen met ACK buffer, dan de cellen in twee groepen verdelen: onbekeerde Kaede groen en geconverteerde Kaede rood.</li>
		<li>Voor één kleur Kaede rode besturingselementen, schorten de cellen in 1 mL PBS en photoconvert in een 24-well plaat voor 5 min met behulp van een 405 nm lichtbronnen op een vermogen van 100 mW. Gebruik van deze cellen om te stellen de Kaede groen (FITC) en Kaede rode bet spanningen op het stroom cytometer (stap 9.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de spanning voor de Kaede eiwitten is vastgesteld, compenseren voor alle andere primair antilichaam vlekken met behulp van de één-fluorophore label compensatie kralen per de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>De monsters worden uitgevoerd op een stroom cytometer om gegevens te verzamelen. Opmerking: Het eiwit Kaede voortdurend wordt geproduceerd door de cellen. Dit betekent dat 24 h na photoconversion, zullen de geconverteerde cellen dubbele positief voor Kaede groen en Kaede rood als nieuw samengestelde Kaede (groen) eiwit heeft opgelopen in de cel.</li>
	<li>Het analyseren van de gegevens met behulp van FlowJo of een soortgelijke software.</li>
</ol>

De auteurs er geen conflicten optreden bekend te maken.

Hoewel de leukocyten egress uit perifere, niet-lymfoïde weefsels essentieel voor de inleiding en de resolutie van de immuunrespons is, worden de moleculaire mechanismen die egress regeren slecht begrepen. Deze lacunes in de kennis is grotendeels te wijten aan de beschikbaarheid van instrumenten voor de kwantificering in vivo. Hier beschrijven we het gebruik van photoconvertible muizen (Kaede-Tg) te kwantificeren van endogene leukocyte uitgang van de huid en de tumoren en bieden een directe vergelijking van de he...

Perifere weefsel immuunresponsen zijn gevormd, niet alleen door leukocyten aanwerving aan de sites van ontsteking, maar ook door mechanismen die hun latere retentie regelen. Dus, beschermende immuniteit is ingegeven door cumulatieve cellulaire en moleculaire mechanismen die bepalen of een leukocyte invoert, blijft binnen, of liever gezegd migreert is uit perifere weefsel via de lymfevaten. Nog belangrijker is, is de neiging voor leukocyten om af te sluiten van weefsel via de lymfevaten (zogenaamde egress) gekoppeld aan hun gespecialiseerde functies. Dendritische cellen (DC) verwerven trekgedrag in reactie op signalen van de rijping leidt tot antigeen vervoer en presentatie in het aftappen lymfklieren (dLN), een proces dat nodig is voor adaptieve immuniteit1. Opruiming myeloïde cellen, zoals macrofagen en neutrofielen, dienen apoptotic puin door fagocytose te wissen. Tijdens de bacteriële infectie, neutrofielen egress weefsel en uiteindelijk ondergaan apoptosis in dLNs2 en een model van DSS-geïnduceerde colitis, gegevens ondersteunt de hypothese dat de macrofaag egress is noodzakelijk om te lossen lokale ontsteking3. Of neutrofiele en macrofaag egress plaatsvindt in alle inflammatoire contexten, is echter onbekend. Bewijs voor T lymfocyten uitgang uit de steady-state4,,5,,6,7, besmette8en ontstoken4,9,10, 11,12 perifere, niet-lymfoïde weefsels geeft aan dat T-cellen actief recirculate, hoewel de weefsel gebaseerde signalen die deze afslag rijden blijven slecht begrepen. Verschillende studies hebben geïdentificeerd signalen nodig voor de directionele overgang naar het aftappen van lymfatische haarvaten en latere egress inclusief chemokine (C-C motief) ligand 21 (CCL21) en de receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motief) ligand 12 (CXCL12) en de receptor CXCR42,14, en sphingosine-1-fosfaat (S1P)10,15,16. Deze mechanismen zijn niet actief in alle contexten, echter, en of ze bepalen uitgang van alle celtypes blijft een open vraag. Nog belangrijker is, verder vereist inzicht in de mechanismen die egress en haar functionele relevantie in ziekte regeren kwantitatieve in-vivo analysemethoden.
Verschillende methoden zijn gebruikt om het kwantificeren van de uitgang in meerdere diermodellen in vivo met inbegrip van directe cannulation van lymfevaten, adoptief overdracht van ex vivo label leukocyten, transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, injectie van gelabelde deeltjes, en in vivo photoconversion17,18. Directe cannulation van de lymfevaten afferent muis is moeilijk en kleine dieren beperkt door de hoeveelheid vloeistof die kunnen worden verzameld. Dus cannulation is grotendeels uitgevoerd in grote dieren (bv., schapen) waar dergelijke chirurgische manipulaties zijn praktische. Deze studies leveren direct bewijs voor de aanwezigheid van zowel lymfoïde en myeloïde cellen in lymfe10,19,20. Bovendien, schapen modellen onthullen dat acute en chronische ontsteking lymfocyt aanwezigheid in lymfe steeg met bijna 100-fold10,-21.
Adoptief overdracht van gelabelde en genetisch gemanipuleerde lymfocyten belangrijker is gebleken dat CCR7 vereist voor de uitgang van CD4 is+ T cellen van acuut ontstoken huid5,11, terwijl de voorbehandeling van lymfocyten met het kleine molecuul S1P receptor agonist remt FTY720, slechts gedeeltelijk hun egress-10. Interessant is dat de uitgang van overgedragen lymfocyten van chronisch ontstoken huid is CCR7-onafhankelijke10, maar kan gedeeltelijk CXCR49vereisen. Adoptief overdracht experimenten, leveren niet-fysiologische aantal ex vivo echter geactiveerd en gelabelde lymfocyten in weefsel via injectie, dat de biomechanische omgeving van weefsels en een verhoogde interstitiële vloeistof druk verandert dat opent eerste lymfatische haarvaten en veranderen hun vervoer eigenschappen22. Als een alternatieve, transdermale toepassing van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) in de aanwezigheid of afwezigheid van dermale irriterende stoffen (bv., dibutylftalaat, DBP) of infectie23,24 voorziet in het bijhouden van fagocytische cellen die accumuleren tracer en migreren naar dLNs. Evenzo fluorescently geëtiketteerde tumoren een manier bieden waarmee bijhouden fagocytische cellen die tumor materiële25hebben opgeslokt. Deze methoden hebben verstrekt belangrijk inzicht verschaffen in de mechanismen die regeren DC uitgang13,14,17,26,27 , maar zijn niet in staat om bij te houden van niet-fagocytische lymfocyten en interpretatie kunnen worden bemoeilijkt door gratis lymfedrainage van oplosbare FITC dus labeling niet-trekvogels, LN resident DCs.
U kunt ook is intravital microscopie een krachtig hulpmiddel waarmee voor in vivo bijhouden van fysiologisch relevante leukocyte populaties in real-time28,29. Gebruikt in combinatie met de verslaggever muizen en antilichaam gebaseerde in vivo immunefluorescentie labeling, intravital microscopie is gebleken dat de complexe ruimtelijke en temporele dynamiek van immuun cel mensenhandel, waaronder interstitiële migratie30 , zielsverhuizing over de lymfatische endotheel, passage binnen de lymfatische lumen en migratie op LN vermelding28,31. Brede goedkeuring van intravital beeldvormingstechnieken wordt beperkt door de kosten, de nodige expertise voor instellen, en doorvoer voor het kwantificeren van meerdere celtypen beperkt. Nog steeds, koppeling van de kwantitatieve methodes die het analyseren van de populatiedynamiek weefsels met intravital imaging geven extra en belangrijk mechanistische inzicht met betrekking tot de mechanismen van de motiliteit en migratie naar en binnen lymfatische haarvaten 18 , 31 , 32.
Bijgevolg, in vivo photoconversion heeft ontpopt als een methode voor het in situ labelen, waarmee onafhankelijk van fagocytische activiteit, en voor de kwantificering van fysiologische leukocyte egress (wanneer in combinatie met stroom cytometry) in de afwezigheid of aanwezigheid van uitdaging. Constitutively express Kaede-Tg muizen een proteïne van stony koraal dat groene fluorescentie (Kaede groene) vertoont totdat blootgesteld aan violet licht, waarna het onomkeerbaar wordt omgezet in rode fluorescentie (Kaede rode)33geïsoleerd. Photoconverted cellen kunnen worden getraceerd als zij egress van perifere weefsel sites en zich ophopen in de dLNs. Dit en andere soortgelijke photoconvertible muis modellen34,35 is gebleken dat belangrijke biologie met inbegrip van constituerende egress van regulatoire T-cellen van huid36, CXCR4-afhankelijke B-cel egress van Peyer van patches37 , mobilisatie van resident T geheugencellen op peptide opnieuw uitdaging38, en brede leukocyte egress tumor microenvironments €39. Hierin, voeren wij een head-to-head vergelijking van photoconversion met transdermaal FITC toepassing in het kader van cutane ontsteking en infectie te voorzien in rechtstreekse vergelijking van bestaande gegevens met de photoconvertible-methode. Bovendien, we tonen photoconversion geïmplanteerde tumoren en beschrijven van de omzettingsefficiëntie en selectieve egress van tumor microenvironments. Zo, we stellen dat verdere toepassing van deze methoden is nodig om te verhelderen van de kritische biologie van leukocyten egress van tumoren, die aanzienlijke gevolgen voor de interpretatie van intratumoral leukocyten complexiteit, anti-tumor immuniteit, zal hebben en respons op therapie.

<table><tbody><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Silver-LED-405B lichtbron met optische vezel en collimator</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne isothiocyanate isomer I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>dibutylftalaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>aceton</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>29-gauge spuiten</td><td>Exel International</td><td>26029</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>70 µm celzeefjes</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Caisson</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd Anti-muis CD16/CD32</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (clone 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (clone 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (clone M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (clone RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (Fractie V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Anit-Rat en Anti-Hamster Igk / Negatieve Controle Compensatiedeeltjeset</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificeren van de leukocyten egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyten egress uit perifere weefsels naar zuig lymfeklieren is niet alleen cruciaal voor immuun toezicht en inleiding maar draagt ook bij aan de resolutie van de perifere weefsel reacties. Hoewel een verscheidenheid van methoden worden gebruikt om te kwantificeren leukocyte egress uit niet-lymfoïde, perifere weefsels, blijven de cellulaire en moleculaire mechanismen die context-afhankelijke egress regeren slecht begrepen. Hier beschrijven we het gebruik van in situ photoconversion voor kwantitatieve analyse van leukocyten egress van lymfkliertest huid en tumoren. Photoconversion zorgt voor de directe etikettering van leukocyten woonachtig binnen cutane weefsel. Hoewel de blootstelling van de huid aan violet licht lokale induceert inflammatoire reacties gekenmerkt door leukocyten infiltreert en vasculaire leakiness, in een head-to-head vergelijking met transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, photoconversion specifiek Label trekkende dendritische cel populaties en gelijktijdig ingeschakeld de kwantificering van myeloïde en lymfoïde egress van cutane microenvironments en tumoren. De mechanismen van leukocyten egress blijven een ontbrekende onderdeel in ons begrip van intratumoral leukocyten complexiteit zal, en aldus de toepassing van de instrumenten die hierin worden beschreven uniek inzicht in de dynamiek van tumor immuun microenvironments beide bij steady state en in reactie op de therapie.

Wij willen eerst repliceren photoconversion resultaten gepubliceerd in de literatuur tot evaluatie van de doeltreffendheid en de bijbehorende ontsteking in de huid van de muis te bepalen. De pinna oor was blootgesteld aan 100 mW violet licht (405 nm) voor 3 min33zoals hiervoor is beschreven. Eén cel schorsingen gegenereerd op basis van het oor huid of cervicale dLNs onmiddellijk na de blootstelling bleek een omzettingsefficiëntie van 78% van alle CD45+ l...

Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Fotoconversie biedt een traceerbare in vivo methode voor de kwantitatieve analyse van leukocyte uitgang voor een mechanistisch inzicht in leukocytenverblijf en exitdynamiek van meerdere weefsellocaties in zieke toestanden. Nou, hier tonen we het nut van leukocyten tracking van cutane tumoren. De toepassing van deze test op andere weefsels en ziekten wordt alleen beperkt door de mogelijkheid om licht toe te dienen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt de kwantificering van endogene, in plaats van overgedragen immuuncel populaties als een uitgang van ontstoken weefsels in vivo. Om ontstekingen te veroorzaken, gebruik na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje een micropipet om 20 microliter dibutylftalaat of DBP toe te dienen aan de ventrale kant van de oorpinna van een verdoofde Kaede transgene muis. Nadat u de DBP hebt laten drogen, trekt u het oor door een spleet in een stuk aluminiumfolie en gebruikt u dubbelzijdige tape om het oor plat aan de folie te vastzetten met de rugzijde naar boven gericht.Dan, positie dat je direct onder een 405 nanometer lichtbron en photoconvert gedurende drie minuten op 100 milliwatt vermogen. Voor vaccinia-infectie gebruikt u een micropipet om 5 keer 10 toediening toe te dienen aan de 6e plaquevormende eenheden van het vacciniavirus in 10 microliter PBS op de oorpinna van een verdoofde Kaede-transgene muis en prik de pinna 25 keer. 24 uur later, photoconvert de pinna zoals net aangetoond.Oogst op het juiste experimentele tijdstip de pinnae en de cervicale en inguinale lymfeklieren en gebruik twee paar pincet om de ventrale en rugzijde van elke pinna uit elkaar te pellen. Plaats vervolgens de lymfeklieren en de pinna-stukken, met de binnenkant van het oor naar beneden gericht, in individuele putten van een 24-bronplaat met 1 milligram per milliliter Collagenase D en 80 eenheden per milliliter Dnase verdund in HBSS met calcium en magnesium. Gebruik twee naalden van 29 meter om elke lymfekliercapsule open te plagen en plaats de plaat gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius.Druk aan het einde van de incubatie op de verteerde pinna- en lymfeklierweefsels via afzonderlijke 70 Micron nylon cel strainers om eencellige suspensies van elk weefsel te verkrijgen. Wanneer de tumoren zijn uitgegroeid tot de juiste experimentele grootte, scheren een nieuw gekweekte vacht rond de tumor site en trek de tumor door een cirkelvormig gat gesneden in een stuk aluminiumfolie. Plaats de tumor direct onder de 405 nanometer lichtbron en fotoconvert gedurende 5 minuten op 200 milliwatt aan stroom.24 uur na de fotoconversie, oogst de tumoren en brachiale en inguinale lymfeklieren van elk dier en gebruik schaar om de tumoren in individuele putten van een 24-put plaat met Collagenase D en DNase in HBSS gehakt. Plaats de lymfeklieren in aparte putten en plaag open de capsules zoals net aangetoond. Na het uitbroeden van de tumoren gedurende een uur en de lymfeklieren gedurende een half uur bij 37 graden Celsius, druk op de verteerde weefsels door middel van aparte 70 Micron strainers om eencellige suspensies van elk weefsel te verkrijgen.Om de eencellige suspensies door stromingscytometrie te analyseren, verzamelt u eerst de milt of bloed van een Kaede-transgene muis en lyse de rode bloedcellen met ammoniumchloride kaliumbuffer. Splits de cellen in een onbekeerde Kaede FITC en een omgezet Kaede PE populatie en resuspend de enkele kleur Kaede PE cellen in een milliliter van PBS in een put van een 24-well plaat, dan fotoconvert de cellen voor 5 minuten onder een 405 nanometer lichtbron op 100 milliwatt van de macht. Gebruik vervolgens de fotogeconverteerde Kaede PE-cellen en de onbekeerde Kaede FITC-cellen om de fotomultiplierspanningen in te stellen op 70 tot 80% van het totale bereik van elk fluorescerend kanaal.Zodra de spanningen voor de Kaede eiwitten zijn ingesteld, compenseren voor alle andere primaire antilichaam vlekken met behulp van enkele fluorofofore gelabeld compensatie kralen, volgens de instructies van de fabrikant. Voer vervolgens de monsters uit op de stroomcytometer volgens de standaardtritometrische analyseprotocollen. Eencellige suspensies gegenereerd uit de oorhuid of cervicale drainerende lymfeklieren onmiddellijk na blootstelling aan fotoconversie onthullen een 78% conversie-efficiëntie van alle CD45 positieve leukocyten in de huid, zonder geconverteerde cellen waargenomen in de drainerende lymfeklieren.Kwantificering van de aantallen infiltrerende CD45 positieve leukocyten in fotogeconverteerde oren nul en 24 uur na de omzetting, toont aan dat blootstelling aan violet licht een statistisch significante toename van leukocyten infiltratie veroorzaakt. Deze toename van CD45 positieve leukocyten infiltratie is echter klein ten opzichte van de infiltratie veroorzaakt door een krachtige ontstekingsprikkel zoals vacciniavirus. Fotoconversie verhoogt ook vasculaire doorlaatbaarheid in de oor pinnae zoals gemeten door Miles test, samen aangeeft dat effecten van violet licht op weefselontsteking moet worden overwogen bij het optimaliseren van de dosis, blootstelling tijd en interpretatie van gegevens.Flow cytometrische analyse van gescheiden tumorcellen van fotoconverteerde dieren onthult een aanzienlijke conversie van intratumorale CD45 positieve cellen van Kaede FITC positief naar Kaede PE positief, terwijl het aftappen van lymfekliercellen onbekeerd blijven. De fotoconversie-efficiëntie van CD45 positieve leukocyten varieerde aanzienlijk tussen tumortypes en maten, met CD45 positieve leukocyten binnen kleine melanoomtumoren die de meest efficiënte fotoconversie aantonen. Als de tumor volumes toenemen, de conversie-efficiëntie daalt tot ongeveer 50%Met name melanine heeft een opvallende invloed op de efficiëntie van de fotoconversie met een maximale fotoconversie van CD45 positieve cellen waargenomen binnen melanine-producerende tumoren van slechts ongeveer 30%in kleinere tumoren, dat daalt tot 10%als de tumor volumes aanpak 400 kubieke millimeter.Het onderzoek van tumorafvoerende lymfeklieren 24 uur na de fotoconversie onthult de aanwezigheid van Kaede rode positieve immuuncellen van verschillende fenotypen, wat aantoont dat leukocyte-emigratie uit de fotoconverteerde tumor. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunologie om de kinetiek van steady state en ontstoken leukocytenomzet in perifeer weefsel bloot te leggen. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alleen het weefsel van belang wordt fotoconverted, als onbedoelde fotoconversie van het omliggende weefsel zal uw resultaten in gevaar brengen.Personen die nieuw zijn bij deze methode moeten de blootstellingstijd voor de omzetting van hun weefsel optimaliseren, evenals de duur van de tijden voordat de weefselverzameling plaatsvindt op basis van de dynamiek van leukocyten van belang.

quantifying-leukocyte-egress-via-lymphatic-vessels-from-murine-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Recent ontwikkelde beeldvormende technieken met behulp van nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) kan helpen verduidelijken van de rol het lymfestelsel speelt in kanker metastase, immuunrespons, wondheling, en andere lymfatische-geassocieerde ziekten.

Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis

This video demonstrates an assay for monitoring dendritic cell migration following footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG in mice. Upon bacterial infection, activated skin DC cells are labeled with a cell-permeable carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) dye. After a suitable interval for DC migration to the popliteal draining lymph node, the node cells are isolated and subjected to immunostaining for DC-specific surface markers. Identification of...

A CFSE-Based Assay to Monitor Skin Dendritic Cell Migration to Draining Lymph Nodes in Infected Mice

Dit protocol beschrijft een methode voor de gedetailleerde evaluatie van leukocytensubsets binnen de tumormicro-omgeving in een muistumormodel. Chemerin-uitdrukkende B16 melanoomcellen werden subcutaan geïmplanteerd in syngene muizen. Cellen uit de tumormicro-omgeving werden vervolgens gekleurd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie, wat gedetailleerde leukocytensubsetanalyses mogelijk maakt.

Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

Er wordt een test bij muizen beschreven om celmigratie van de huid naar de lymfeklieren te volgen, die de karakterisering van dendritische cellen in de huid mogelijk maakt die naar de lymfeklier zijn gemobiliseerd na infectie van de voetkussen met Bacille Calmette-Guérin.

A-CFSE gebaseerde test om de migratie van de huid van muizen dendritische cellen Onderzoek naar drainerende lymfeklieren tijdens infectie met<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

Hier beschrijven we een nauwkeurige methode voor het verzamelen van thoracale kanaallymfocyten en het observeren van de migratie van darm-tropenlymfocyten in de patches van rat Peyer gedurende 3 uur met behulp van time-lapse fotografie. Deze techniek kan verduidelijken hoe de dynamiek van lymfocyten wordt beïnvloed onder inflammatoire omstandigheden.

Microscopische observatie van lymfocytendynamiek in rat Peyer's patches

Melanoom is een zeer agressieve ziekte die zich snel verspreidt naar andere organen. Dit protocol beschrijft de toepassing van ultra-hoogfrequente echografie, gekoppeld aan 3D-rendering, om het volume van de inguinale lymfeklieren in het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te bewaken.

Analyse van het lymfekliervolume door ultra-hoogfrequente echografie in het Braf / Pten genetisch gemanipuleerde muismodel van melanoom

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

Leer hoe u leukocytenegress kwantificeert in muizenhuid en tumoren met behulp van in vivo fotoconversie. Deze methode maakt het volgen van endogene immuuncellen mogelijk voor onderzoek naar immuunresponsen.

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

Meer video's verkennen