Name: Tot oprichting van de cellijnen Overexpressing DR3 om te beoordelen van de Apoptotic reactie op anti-mitotische Therapeutics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Leer hoe je stabiele cellijnen genereert met DR3-overexpressie via retrovirale infectie voor apoptosestudies. Deze methode biedt betrouwbare tools om genfunctie in vitro en in vivo te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies 53110000117 (naar G.W.) en 043222019 (met X.W.) van Tsinghua Universiteit.

Houd er rekening mee dat alle hier beschreven muis experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd overeenkomstig de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Tsinghua.
1. generatie van DR3 overexpressie cellijnen
<ol><li>Bouw van de plasmide voor DR3 expressie (pMXs-IRES-DR3-FLAG) door het invoegen van full-length DR3 cDNA met 3 x vlag in het C-terminus in retrovirale vector pMXs-IRES-Blasticidin op de sites van de beperking van BamHI/XhoI.</li>
	<li>Groeien Plat-A cellen in 60 mm gerechten met 4 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM). De volgende dag, wanneer de cellen bereikt 80% - 90% samenvloeiing, transfect de cellen met 2 μg plasmide pMXs-IRES-DR3-FLAG transfectiereagens gebruiken (Zie Tabel van materialen) volgens de fabrikant handmatige20.</li>
	<li>Na 72 uur verzamelen het supernatant filtraat van de media met behulp van een 0,45 micrometer steriel filter en houden de virale schorsing in het donker bij 4 ° C.</li>
	<li>Groeien HT29 cellen in DMEM in een schotel van 60 mm en Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
	<li>De volgende dag, wanneer de cellen bereiken samenvloeiing van de 30% - 50%, de cellen met 2 mL virale schorsing in aanwezigheid van 8 μg van 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide per milliliter van virale schorsing infecteren. Na 4-6 uur incubatie bij 37 ° C, gecombineerd de virale schorsing, Voeg 4 mL verse DMEM en de schotel terugkomen in de incubator.</li>
	<li>Negeren van de media van de gerechten 24 h postinfection en cellen met 2 mL PBS voorverwarmde grondig te wassen. Voeg 1 mL trypsine-EDTA aan de cellen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Na het observeren onder een microscoop op 10 X vergroting die allermeest naar de cellen hebben losgemaakt, stoppen de trypsinebehandeling met 2 mL van volledige DMEM met 10% foetale runderserum (FBS). Verzamelen van de celsuspensie in een tube van 15 mL en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 10 mL DMEM. Meng goed door pipetteren zachtjes op en neer. Verdun de cellen door factoren van 30, 100 en 300. Zaad de cellen in 150 mm gerechten met 20 mL DMEM met 1 µg/mL blasticidin. Incubeer bij een incubator 37 ° C met 5% CO2 ~ 1-2 weken.</li>
	<li>Observeren tijdens deze periode elke dag op de kolonies met een omgekeerde Microscoop op 10 X vergroting. De goed geïsoleerde kolonies op de bodem van de schotel markeren als de waarde de kolonie diameter is ongeveer 1-2 mm.</li>
	<li>Het medium gecombineerd en wassen van de cellen met 3 mL voorverwarmde PBS. Voeg 2 milliliter trypsine-EDTA in een schotel van 60 mm. Gebruik van steriel pincet te halen gesteriliseerde met autoclaaf steriel klonen cilinders, en plaats ze in de schotel van 60 mm. Pak de cilinders met trypsine-EDTA en plaats ze voorzichtig over de gemarkeerde kolonies. Zorg ervoor dat elke klonen cilinder alleen bevat één kolonie en voorkoming van verontreiniging met nabijgelegen kolonies.</li>
	<li>Terug de schotel naar de incubator voor 3 minuten.</li>
	<li>Na 3 min, Controleer de cellen onder de Microscoop op 10 X vergroting om te zien of ze hebben losgemaakt. Wanneer de cellen hebben opgetild, 70 μL van kweekmedium aan elke cilinder naar de inactivering van de trypsine toevoegen. Meng voorzichtig de celsuspensie met een 200 μL pipet. Zorg ervoor dat niet te verhuizen van de cilinder tijdens dit proces.</li>
	<li>Overbrengen van de celsuspensie van elke kolonie naar twee 24-Wells-platen met DMEM 1 mL per putje. Voeg 30 μL van celsuspensie per putje in plaat A en 70 μL in de corresponderende putjes in de plaat B. Label de platen goed en leg ze terug in de incubator.</li>
</ol>2. controle van de DR3 overexpressie cellijn
<ol><li>Wanneer de cellen in de plaat B aan 90% samenvloeiing zijn, verwijder het medium en de cellen met 1 mL PBS grondig te wassen. Volledig verwijderen van PBS en lyse de cellen met 50 μl van 1 x SDS-pagina laden buffer. De cel lysates van de 24-well plaat overbrengen met 1,5 mL centrifuge buizen en kook de monsters gedurende 10 minuten bij 100 ° C.</li>
	<li>De monsters worden uitgevoerd op 10% natrium dodecyl sulfaat (SDS) gel bij een constante spanning van 80 V gedurende 15 minuten en vervolgens 120 V voor 1 h.</li>
	<li>Het eiwit overbrengen in een Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan door natte overdracht op een constante stroom van 400 mA gedurende 2 uur.</li>
	<li>Test de DR3 expressie in verschillende klonen met Anti-Flag antilichaam, met behulp van de wild-type HT29 cellen als een negatieve controle (Figuur 1). Het primaire antilichaam verdund met een factor van 5.000 in 5% nonfat melk die wordt opgelost in TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20). Incubeer het membraan met vlag antilichaam bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>Het membraan met TBST wassen door schudden op een decoloring shaker bij 200 t/min bij RT. Refresh de TBST elke 5 min voor een totaal tijd van 15 minuten wassen.</li>
	<li>Incubeer het membraan met anti-muis secundair antilichaam verdund met een factor van 10.000 in 5% nonfat melk bij 4 ° C gedurende 5-6 h.</li>
	<li>Het wassen van het membraan opnieuw zoals beschreven in stap 2.5.</li>
	<li>Detecteren van de expressie van de vlag met westerse Verbeterde Chemiluminescentie (ECL) substraat en beeld van het membraan met een documentatiesysteem gel (Zie Tabel van materialen). Het identificeren van de klonen DR3 uitdrukken als de positieve klonen.</li>
	<li>Overdracht van de klonen in plaat A die overeenstemmen met positieve klonen in plaat B naar een 6-well-plaat en blijven versterken de cellen tot het verbouwen ervan in 10 cm schotels. Maak bevroren voorraden van de cellen groeien uit positieve klonen en sla ze bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>3. beoordeling van de reactie van de Apoptotic cellen op antimitotische agenten
Opmerking: Diazonamide is een nieuwe klasse van mariene natuurproduct dat opmerkelijke activiteit heeft in het remmen van kanker-celgroei, die andere agenten tubuline-destabiliserende21weerspiegelt. Echter is zijn werkingsmechanisme onduidelijk. Om te testen het cellulaire antwoord van cellen op antimitotische agenten, werden paclitaxel en diazonamide gebruikt voor de behandeling van wild-type HT29 cellen en HT29-DR3 cellen. De drugs werden ontbonden in dimethylsulfoxide (DMSO) te maken van voorraden van 10 mM en, vervolgens verder verdund tot verschillende concentraties: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3000 nM, en 10.000 nM in DMSO.
<ol><li>HT29 en HT29-DR3 cellen verzamelen door trypsinebehandeling. Het meten van de celdichtheid met behulp van een automatische cel counter. Vervolgens, seed cellen in 12-Wells-platen in DMEM bij een dichtheid van 3 x 104 cellen per putje. De volgende dag, voeg 10 nM diazonamide en 1% DMSO gebruiken als een negatieve controle. Na 48u van behandeling, het imago van de cellen onder een microscoop op 10 X vergroting (Figuur 2).</li>
	<li>Zaad HT29 en HT29-DR3 cellen in 96-wells-platen in DMEM bij een dichtheid van 3 x 10-3 cellen per putje en laten groeien 's nachts bij 37 ° C. Voeg vervolgens dosis-escalatie diazonamide concentraties van 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, en 100 nM aan elk putje, met behulp van 1% DMSO als negatieve controle.</li>
	<li>Na 48u van behandeling, meten van de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een cel luminescentie gebaseerde levensvatbaarheid assay kit volgens de handleiding van de fabrikant.<ol>
<li>Neem de 96-wells-plaat uit de incubator en laat het staan op RT voor ongeveer 30 min. Voeg vervolgens toe 50 µL van assay reagentia aan elk putje, schud de plaat op RT voor 2 min Lyse de cellen en Incubeer de plaat duikt met RT voor een ander 10 min. bepalen de luminescentie van elk putje met behulp van een microplate reader (Figuur 3). Opmerking: De levensvatbaarheid van de cellen vertegenwoordigt de luminescentie van de relatieve intensiteit van elk goed tot dat van het besturingselement ook behandeld met 1% DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zes weken oude vrouwelijke BALB/c naakt muizen voor een in vivo onderzoek14gebruiken. Opmerking: De muizen werden onderhouden onder omstandigheden van specifieke pathogenen vrije.<ol>
<li>Trypsinize HT29 en HT29-DR3 cel en, vervolgens, stoppen de trypsinebehandeling met behulp van DMEM voorverwarmde bij 37 ° C. Verzamelen van de celsuspensie in een tube van 50 mL en centrifugeer de cellen bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten op RT. Discard het supernatant en resuspendeer de pellet cel in DMEM medium zonder FBS. Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer de cel pellet in PBS.</li>
		<li>Met behulp van een automatische cel counter cellen tellen en verdunnen van de cellen tot een concentratie van 2.5 x 107 cellen/mL met behulp van PBS. Genereren door een subcutane injectie van 200 μL van de HT29 of HT29-DR3 celsuspensie tumoren in de rechterflank van elke muis (5 x 106 cellen/muis)22.</li>
		<li>Meet het volume (TV) van de tumor met remklauwen elke 2 d na de transplantatie. De TV met behulp van de volgende formule berekenen: TV = 1 / 2L x W x W (hier, b: tumor breedte, L: tumor lengte). Wanneer het gemiddelde tumor volume ongeveer 100 mm3 bereikt, randomize de muizen in het besturingselement of de behandelde groep (n = 6 per groep) en de behandeling te starten.</li>
		<li>Bereid de paclitaxel-oplossing als volgt. Eerst, ontbinden paclitaxel volledig in 5% van het totale volume ethanol en voeg vervolgens toe 5% van het uiteindelijke volume van polyoxyl 35 gehydrogeneerde ricinusolie. Tot slot maken de resterende 90% van het volume met de D5W (5% dextrose in water, pH 7.4).</li>
		<li>Injecteer de paclitaxel intraveneus bij een dosis van 20 mg/kg 3 x per week gedurende twee weken. Het meten van de tumor volume en lichaamsgewicht 3 x een week14. Het experiment beëindigen en de dieren euthanaseren, als het lichaamsgewicht met 20 daalt % of het volume van de tumor ongeveer 2.000 mm3 bereikt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+for+gene+transfer%2C+expression%2C+knockdown%2C+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+BCR%2FABL-induced+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li>
<li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation%2C+self-inactivating+gp91%28phox%29+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD%2FSCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34%2B+cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li>
<li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry+-+Anti-Cancer+Agents%22%5BJournal%5D)">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li>
<li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+agents%3A+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li>
<li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li>
<li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+destabilising+agents%3A+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li>
<li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li>
<li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apo-3%2C+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family%2C+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li>
<li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+DR3%2C+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li>
<li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li>
<li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li>
<li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li>
<li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li>
<li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Model%3A+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li>
<li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9, Unit9 3 (2010).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li>
<li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li>
<li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

In dit manuscript beschrijven we een methode voor het genereren van HT29-DR3 stabiele cellijnen. HT29-DR3 cellen bieden een model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die door die DR3 draagt bij aan apoptosis geïnduceerd door antimitotische agenten. Deze aanpak is veelzijdig en herhaalbaar. Om te verzekeren het succes van de procedure, vier belangrijke stappen van het protocol moeten worden overwogen. Eerst, produceren een hoog genoeg virus titer, wordt u aangeraden uitvoeren DNA transfectie wanneer de Plat...

Heterologe genexpressie is vaak aangewend om te bestuderen van de functie van genen van belang. Twee methoden, voorbijgaande en stabiele transfectie, worden prevalently gebruikt in cellen en moleculaire biologie aan een segment van DNA of RNA invoegen een host cel1,2. Transient-transfected DNA of RNA kan niet worden doorgegeven aan dochtercellen, zodat de genetische wijziging kan alleen worden gehandhaafd voor een korte periode van tijd. Aan de andere kant, in stabiel transfected cellen, zijn exogene genen geïntegreerd in het ontvangende cel genoom, behoud van de expressie in de cellijn. Dus, stabiele transfectie is een methode die is meestal gereserveerd voor onderzoek naar lange termijn genetische verordening. De stabiele cellijn kan ook worden getransplanteerd zoals xenografts in Muismodellen voor in vivo studie3. Stabiele transfectie kan worden onderverdeeld in twee categorieën: virale en nonviral. In vergelijking met nonviral transfectie, kunt virale infectie overbrengen van genen in een breder scala aan menselijke cellen met een hogere efficiëntie4,5,6,7. Bovendien biedt een stabiele cellijn van een enkele kloon het voordeel van homogeniteit en klonen zuiverheid.
Ongecontroleerde celgroei en deling zijn de meest onderscheidende kenmerken van de kanker. In klinische instellingen zijn antimitotische agenten de primaire behandelingen voor vele soorten tumoren8. Echter, enkele belangrijke beperkingen van antimitotische agenten kunnen niet worden genegeerd. Eerst, deze chemokuren kunnen ook doden normale cellen samen met de ongewenste kankercellen en, dus, kunnen leiden tot ernstige bijwerkingen8. Tweede, antitubulin medicijnen zijn niet effectief tegen alle soorten tumoren, ondanks tubuline de alomtegenwoordige expressie in een breed scala aan verschillende weefsels als een cytoskeletal eiwit9,10. Het is onduidelijk waarom antitubulin agenten toonde veelbelovende werkzaamheid tegen ovariële, Long-, en hematologische kankers in klinische behandeling, maar niet in de nier, dubbele punt of alvleesklier kanker11. Ten slotte, zelfs patiënten met hetzelfde type tumor kunnen reageren op de antimitotics anders op een onvoorspelbare wijze. Kan er een belangrijke effector molecuul dat is van invloed op de gevoeligheid van verschillende patiënten aan antimitotische agentia, resulterend in de uiteenlopende resultaten gezien in klinische behandeling12. Dus moeten de potentiële differentiële gevoeligheden van patiënten antimitotische behandeling in aanmerking worden genomen voor het optimaliseren van therapeutische interventies13.
Een high-throughput geheel-genoom siRNA bibliotheek scherm aangetoond dat DR3 knockdown gevoelige cellen resistent tegen antimitotische geneesmiddelen, we een rol voor DR3 in chemotherapie-veroorzaakte apoptosis14kan renderen. Als een lid van de tumor necrose factor receptor (TNFR) superfamilie, is DR3 gemeld te bemiddelen cel apoptosis in verschillende systemen15,16,17,18. Dus zetten we uit om stabiele cellijnen DR3 om te bestuderen van de moleculaire mechanismen waarmee antimitotische geneesmiddelen apoptosis induceren overexpressing. Een model van de juiste cel voor het bestuderen van DR3 overexpressie kan worden verstrekt door de menselijke Colón kanker cellijn HT29, die bleek te zijn DR3-deficiënte. Bovendien, in de kliniek, dikke darm kankers zijn ongevoelig voor antimitotische geneesmiddelen19.
In dit artikel beschrijven we een methode waarmee de generatie van een HT29-DR3 stabiele cellijn door retrovirale infectie. Verder laten we zien hoe de DR3 expressie in deze cellen gebruikend het westelijke bevlekken valideren en hoe om te beoordelen van de gevoeligheid voor antimitotische agentia met behulp van een cel levensvatbaarheid assay en morfologische observatie. De cellen van één klonen worden versterkt en, dus, hebben het voordeel van een homogene genetische achtergrond. Bovendien mag de vlag-tag op DR3 voor de visualisatie van cellulaire DR3 door microscopie en analyse van gen expressie en eiwit interactie door biochemische benaderingen. Bovendien, kunnen de cellen xenografted in muizen aan tumor progressie in reactie op antimitotics in vivo14verder te analyseren.
De HT29-DR3 cel systeem gepresenteerd hier aangeboden een doeltreffend instrument voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van hoe antimitotics doden van kanker cellen14. Aangezien overexpressie en vechtpartij cellijnen gemeenschappelijke hulpmiddelen zijn voor de bestudering van de genfunctie, kan dit protocol worden aangepast gemakkelijk aan andere genen van belang of andere cellijnen en, dus, omgevormd tot een veel gebruikte aanpak.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>C11965500BT</td><td>Aangevuld met 10% FBS en 1% Penicilline/Streptomycine</td></tr><tr><td>Luminescent Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>C14190500BT</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Transfectie Reagens</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis secundair antilichaam</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag antilichaam</td><td>Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>HT29 cellijn</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A cellijn</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Kloon Cilinder</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Celbeelding Multi-Mode Reader</td><td>Biotek</td><td>BTCYT3MV</td><td></td></tr><tr><td>CKX53 Geïnverteerde Microscoop</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>12-well celkweek platen</td><td>Nest</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>60 mm celkweek platen</td><td>Nest</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge buizen</td><td>Nest</td><td>601052</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m steriele filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Witte Polystyreen Microplaat&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Western ECL Substraat</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ontkleurende Shaker&nbsp;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Geautomatiseerde celteller</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

tot oprichting van de cellijnen overexpressing dr3 om te beoordelen van de apoptotic reactie op anti-mitotische therapeutics

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Bestuderen van de functie van een gen van belang kan worden bereikt door het manipuleren van het niveau van meningsuiting, zoals minderen qua uitdrukkingswijze met vechtpartij cellijnen of het verhogen van de expressie met overexpressie cellijnen. Voorbijgaande en stabiele transfectie zijn twee methoden die worden vaak gebruikt voor exogene genexpressie. Voorbijgaande Transfectie is alleen handig voor korte termijn expressie, overwegende dat stabiele transfectie kunt exogene genen worden geïntegreerd in het genoom van de cel host waar het voortdurend zal worden uitgedrukt. Dientengevolge, is stabiele transfectie meestal werkzaam voor onderzoek in lange termijn genetische verordening. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het genereren van een stabiele cellijn tagged dood receptor 3 (DR3) te verkennen DR3 functie overexpressing. We pakte enkele klonen na een retrovirale infectie teneinde de homogeniteit en de zuiverheid van de stabiele cellijnen. De stabiele cellijnen gegenereerd met behulp van dit protocol maken DR3-deficiënte HT29 cellen gevoelig voor antimitotische geneesmiddelen, aldus bijenpopulatie de apoptotic reactie in HT29 cellen. Bovendien, de vlag-tag op DR3 compenseert de onbeschikbaarheid van goede DR3 antilichaam en vergemakkelijkt de biochemische studie van het moleculaire mechanisme waarmee antimitotische agenten apoptosis induceren.

Een karakterisering van HT29 cellen stabiel uiten DR3 is afgebeeld in Figuur 1. De klonen express uiteenlopende niveaus van DR3, terwijl de wild-type-cellen, die als een negatieve controle dienen, geen exogene genexpressie vertonen. Hier tonen we slechts vijf klonen, waaronder kloon 1 en 5 express het hoogste niveau van DR3. We kozen de kloon 1 en 5 voor de volgende experimenten.
De morfologie van c...

Tot vaststelling van een stabiel cellijn overexpressing een gen van belang zijn voor het bestuderen van de genfunctie kan gebeuren door stabiele transfectie-picking enkele klonen na transfecting hen via retrovirale infectie. Hier laten we zien dat HT29-DR3 cellijnen gegenereerd op deze manier verhelderen de mechanismen door welke dood receptor 3 (DR3) draagt bij tot antimitotics-veroorzaakte apoptosis.

Tot oprichting van de cellijnen Overexpressing DR3 om te beoordelen van de Apoptotic reactie op anti-mitotische Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Overexpressie genen in cellen is een belangrijke manier om genfunctie te bestuderen. Stabiele transfectie met het retrovirus maakt het mogelijk om endogene genen in het gastheergenoom te integreren en continu uit te laten. We pikten enkele kolonies van de retrovirale infectie op en genereerden stabiele cellijnen die de DR3 met flag-taggen overexpressen.De cellijnen compenseerden voor de onbeschikbaarheid van goed DR3-antilichaam en boden uitstekende instrumenten voor dr3-functiestudie post in vitro en in vivo. We genereerden de DR3 overexpressie cellijnen door het oppakken van een enkele kolonie van de retrovirale infectie. Cellijnen uit één kolonie kunnen de homogeniteit en zuiverheid behouden.Bovendien is het protocol eenvoudig en eenvoudig te hanteren. Om te beginnen met deze procedure, groeien plat-A cellen 's nachts in 60-millimeter gerechten met vier milliliter DMEM. Wanneer cellen 80 tot 90% samenvloeiing bereiken, gebruikt u transfection reagens om ze te transfecteren met twee microgram van het geconstrueerde plasmide zoals beschreven in de handleiding van de fabrikant.Na 72 uur, het verzamelen van de supernatant. Met behulp van een 0,45 micrometer steriel filter, filter de media, en houd de virale suspensie in het donker op vier graden Celsius. Vervolgens groeien HT29 cellen 's nachts in een 60-millimeter schotel met DMEM, het uitbroeden van de cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.Wanneer de cellen bereiken 30 tot 50%samenvloeiing, infecteren ze met twee milliliter virale suspensie in aanwezigheid van acht microgram polybrene per milliliter van virale suspensie. Broed de geïnfecteerde cellen op 37 graden Celsius gedurende vier tot zes uur. Dan, aspirate de virale schorsing.Voeg vier milliliter verse DMEM toe en breng de schotel terug naar de couveuse. Verwijder na 24 uur na infectie de media uit de afwas en was de cellen zorgvuldig met twee milliliter voorverwarmde PBS. Voeg een milliliter trypsine EDTA toe en broed de cellen gedurende drie minuten uit op 37 graden Celsius.Met behulp van een microscoop op 10 keer vergroting, observeren de cellen om ervoor te zorgen dat de meeste van hen hebben losgemaakt. Voeg hierna twee milliliter DMEM toe met 10%FBS om de trypsinisatie te stoppen en verzamel de celsuspensie in een buis van 15 milliliter. Centrifuge op 200 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, en verwijder de supernatant.Schort de celpellet opnieuw op in 10 milliliter DMEM enpipet zachtjes op en neer om te mengen. Verdun vervolgens de cellen met factoren van 30, 100 en 300. Zaad van de cellen is 150-millimeter schotels die elk 20 milliliter DMEM met blasticidin bevatten bij een concentratie van één microgram per milliliter.Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende ongeveer één tot twee weken. Gebruik tijdens deze periode een omgekeerde microscoop bij 10 keer vergroting om de kolonies elke dag te observeren. Markeer de goed geïsoleerde kolonies op de bodem van de schotel wanneer de diameter van de kolonies ongeveer één tot twee millimeter is.Wanneer de incubatietijd is voltooid, aspiraat het medium en was de cellen met drie milliliter van voorverwarmde PBS. Voeg twee milliliter trypsin EDTA toe in een schaal van 60 millimeter. Gebruik steriele tangen op te halen autoclaved steriele klooncilinders en leg ze in de schotel.Dan, pick-up van de cilinders die nu elk zal bevatten ongeveer 30 microliter trypsin EDTA, en voorzichtig plaats ze over de gemarkeerde kolonies. Breng de schotel drie minuten terug naar de couveuse. Controleer hierna de cellen onder een microscoop om er zeker van te zijn dat ze loskomen.Wanneer de cellen zijn opgetild, bij 70 microliter van cultuurmedium aan elke cilinder om trypsine te inactiveren. Gebruik een pipet van 200 microliter om de celsuspensie voorzichtig te mengen, zodat u de cilinder niet beweegt tijdens het mengen. Stel twee 24-well platen, en label ze plaat A en plaat B.Voeg een milliliter dmem aan elke put.Voeg 30 microliter celsuspensie toe aan elke put van plaat A en voeg 70 microliter toe aan de overeenkomstige putten van plaat B.Plaats de platen terug in de couveuse. Wanneer de cellen in plaat B op 90% samenvloeiing zijn, verwijder de media en was de cellen zorgvuldig met één milliliter PBS. Verwijderde de PBS volledig en voeg 50 microliters 1X SDS-PAGE laadbuffer toe om de cellen te lyse.Breng na vijf minuten de cellysaat van de 24-putplaat over naar 1,5 milliliter centrifugebuizen. Kook de monsters op 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voer de monsters op 10% SDS gel op een constante spanning van 80 volt gedurende 15 minuten en vervolgens op 120 volt gedurende een uur.Breng het eiwit vervolgens over op een polyvinylideenfluoridemembraan door natte overdracht bij een constante stroom van 400 milliampère gedurende twee uur. Verdun het primaire antilichaam met een factor 5.000 in 5% vetvrije melk die wordt opgelost in TBST. Voeg de VLAG-antilichaam aan het membraan, en incubeer op vier graden Celsius 's nachts.Met behulp van een ontkleurende shaker ingesteld op 200 RPM, was het membraan met TBST gedurende 15 minuten, het vernieuwen van de TBST om de vijf minuten. Verdun vervolgens een anti-muis secundair antilichaam met een factor 10.000 in 5% vetvrije melk. Incubeer het membraan met verdund secundair antilichaam bij vier graden Celsius gedurende vijf tot zes uur.Was het membraan op de ontkleuringshaker opnieuw zoals eerder beschreven. Gebruik hierna Western enhanced chemiluminescence en een geldocumentatiesysteem om het membraan in beeld te brengen en de FLAG-expressie te detecteren. Verzamel eerst zowel HT29- als HT29-DR3-cellen door trypsinisatie en gebruik een automatische celteller om de celdichtheid te meten.Zaad de cellen in de putten van 12-well platen met DMEM bij een dichtheid van 30.000 cellen per put, en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. De volgende dag, voeg 10 nanomolar van diazonamide aan elke put die cellen met behulp van 1%DMSO als een negatieve controle bevat, en breng de platen naar een incubator op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Na 48 uur behandeling, beeld de cellen onder een microscoop bij 10 keer vergroting.Vervolgens, zaad zowel HT29 en HT29-DR3 cellen in de putten van 96-well plaat met DMEM op een dichtheid van 3,000 cellen per put, en laat ze groeien op 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, voeg dosis-escalerende diazonamide concentraties zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik na 48 uur behandeling een op luminescentie gebaseerde celreetiekit om de levensvatbaarheid van de cel te meten.Haal de 96-put plaat uit de couveuse en laat hem ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur staan. Voeg vervolgens 50 microliter testsneert aan elke put toe en schud de plaat twee minuten bij kamertemperatuur om de cellen te lyse. Incubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 10 minuten, en gebruik vervolgens een microplaatlezer om de luminescentie van elke put te bepalen.Karakterisering van HT29 cellen stabiel uitdrukken DR3 blijkt dat de klonen verschillende niveaus van DR3 uitdrukken, terwijl de wild-type cellen geen exogene genexpressie vertonen. Genen een en vijf worden gezien om de hoogste niveaus van DR3 uit te drukken, en dus worden gekozen voor verdere experimenten. De morfologie van HT29- en HT29-DR3-cellen wordt waargenomen na 48 uur te zijn behandeld met diazonamide.HT29-DR3 cellen vertonen duidelijke apoptose met een gebroken celmembraan en celpuin. Echter, HT29 cellen tonen alleen mitotische arrestatie met intacte cellen die een round-up cel vorm vertonen. De cel levensvatbaarheid van deze celtypes wordt vervolgens bepaald na behandeling gedurende 48 uur met drie nanomolar van diazonamide.HT29-DR3 cellen worden gezien als een cel dood van meer dan 80%, terwijl de ouderlijke HT29 cellen tonen slechts een lichte reactie in de vorm van mitotische arrestatie. Dit geeft aan dat de overexpressie van DR3 de door diazonamide geïnduceerde apoptotische route in deze cellen reconstrueerde. Goede seriële verdunningen zijn belangrijk om een optimale dichtheid van enkele klonen te krijgen.Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat elke klooncilinder slechts één kolonie bevat en om te voorkomen dat nabijgelegen kolonies besmet raken. De DR3 overexpressie cellijnen vergemakkelijkten de biochemische studie van de moleculaire mechanismen in vitro. We genereerden HT29-DR3 xenografts door onderhuidse injectie van HT29-DR3 cellen, en het hielp bij het uitwerken van de mechanismen van antimitotische middelen-geïnduceerde apoptose in vivo.Dit protocol kan worden gebruikt om genen van belang in andere cellijnen te bestuderen. Bovendien is gen knock-out een andere manier voor functionele studie, en ons protocol kan worden aangepast aan de gen knockdown systemen. Het is dus algemeen toepasbaar om genfuncties te verduidelijken.Vergeet niet om het virus te laten vallen naar het afval naar specifieke containers voor de veiligheid verwijdering.

establishing-cell-lines-overexpressing-dr3-to-assess-apoptotic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We beschrijven hoe retrovirale of lentivirale infecties van overexpressie of shRNA-bevattende constructies in het menselijk Ramos B-cellijn en hoe somatische hypermutatie te meten in deze cellen. Uit te...

Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen

Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.

Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

De cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 in kankercellen ondergaan mitose werd in real time gedocumenteerd door levende confocale beeldvorming. PJ-34 uitgeroeide menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellen die extra-centrosomes in mitose. In tegenstelling tot normale bifocale mitose, werden de extra-centrosomes niet geclusterd in de twee polen spil in aanwezigheid van PJ-34.

Cel dood in verband met abnormale Mitosis Waargenomen door confocale Imaging Live kankercellen

Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van intracellulaire signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd in levensvatbare cellen door fysische interactie met aangrenzende dode of stervende cellen. Het protocol richt zich op signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd door receptor-gemedieerde herkenning van de dode cellen, in tegenstelling tot hun fagocytische opname of afgifte van oplosbare mediatoren.

Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8+ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

Het protocol Details een in vitro muriene carcinoom model van niet-genetische defecte transcriptie rek. Hier wordt chronische remming van CDK9 gebruikt voor het onderdrukken van productieve verlenging van RNA Pol II langs pro-inflammatoire respons genen om na te bootsen en bestuderen van de klinisch overgediend TEzeker fenomeen, aanwezig in ongeveer 20% van alle soorten kanker.

Een Muriene cellijn gebaseerd model van chronische CDK9 remming om wijdverbreide niet-genetische transcriptionele rek defecten te bestuderen (TEzeker) in kankers

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van formaline-vaste, paraffine-ingebedde celpelletcontroles voor immunohistochemie.

Gestandaardiseerde verwerking voor formaline-vaste, paraffine-ingebedde cel pellet immunohistochemische controles

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Leer hoe je stabiele cellijnen genereert met DR3-overexpressie via retrovirale infectie voor apoptosestudies. Deze methode biedt betrouwbare tools om genfunctie in vitro en in vivo te onderzoeken.

Tot oprichting van de cellijnen Overexpressing DR3 om te beoordelen van de Apoptotic reactie op anti-mitotische Therapeutics

Meer video's verkennen