Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van microbiologie, zoals het begrijpen van genexpressie veranderingen in duizenden enkele cellen na een blessure of een ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om transcripto's van individuele cellen binnen een complex weefsel te ontleden en de functionele dynamiek binnen een bepaalde populatie beter te waarderen. Het voordeel van ons protocol is dat het uitgebreide methoden biedt, van isolatie van enkele cellen in primaire weefsels tot analyse en visualisatie van deze gegevensset.

Hoewel deze methode begint met eencellige suspensies van de huid en de zenuw, kunnen de sequencing-methoden die we beschrijven worden toegepast om elk zoogdierweefsel te bestuderen. Het aantonen van deze procedure zal Elodie Labit zijn, en Wisoo Shin, twee stagiaires van mijn laboratorium. Om te beginnen ontleedt u de heupzenuw van een geëuthanaseerde muis door eerst de huid weg te snijden van het achterste gebied van de achterkant van de muis.

Gebruik een steriel scalpelblad om een incisie te maken langs de lengte van de dij. Gebruik dan fijne tang en schaar om de heupzenuw bloot te leggen en te verwijderen. Om de rughuid te ontleden, gebruik je fijne tangen en scharen om insnijdingen te maken van schouder tot schouder, over de romp en langs de rug.

Was de weefsels twee keer met ijskoude HBSS. Onder een ontledenmicroscoop, verwijder ongewenste bindweefsel, vetafzettingen, of puin. Voor de huid alleen, snijd de huid in dunne plakjes, met behulp van een steriele scalpel mes.

Om de huid dermis te verkrijgen, zweef de huid plakjes in dispase, in HBSS in een schaal van 10 centimeter, gedurende 30 tot 40 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik fijne tangen te schillen en scheiden van de opperhuid van de dermis, en gooi de opperhuid. Gebruik vervolgens voor huid en zenuw een paar steriele scalpelbladen om elk monster in stukken van één tot twee millimeter te hakken.

Plaats de weefselstukken in vers ontdooide, twee gram per milliliter koude collagenase-vier enzym in een 15 milliliter conische buis. Incubeer elk monster in het enzym in een 37-graden Celsius bad gedurende 30 minuten met zachte schudden om de 10 minuten. Gebruik na 30 minuten een P1000 pipetter om het weefsel 20 tot 30 keer te tritureren en terug te keren naar het waterbad.

Herhaal trituratie elke 30 minuten totdat de oplossing lijkt troebel, en brokken weefsel zijn grotendeels gescheiden. Voor de huid alleen, in het laatste uur van incubatie, voeg een milligram per milliliter DNAse aan het huidmonster. Aangezien sommige celtypes gevoeliger zijn dan anderen voor mechanische stress, kunnen overmatige dissociatietechnieken uw bevolking beïnvloeden.

Algemene dissociatie is van cruciaal belang voor het bereiken van hoge celopbrengsten en een nauwkeurige weergave van de weefselsamenstelling. Gebruik daarna een filter van 40 micrometer bovenop de 50 milliliter conische buis om elk weefselmonster twee keer te filteren. Spoel het filter af met één procent BSA/HBSS.

Na het centrifugeren van de monsters zoals beschreven in het manuscript, opnieuw opschorten de cel pellet in HBSS, met een procent BSA, met behulp van een breedboren tip, en plaats op ijs. De toevoeging van levensvatbaarheid kleurstof zal u helpen bij het optimaliseren van uw voorbereiding. Je moet streven naar ten minste 80 procent levensvatbare cellen.

Eenmaal geoptimaliseerd, kunnen deze en andere kwaliteitscontrolestappen worden weggelaten om het dissociatieproces te bespoedigen, dat de RNA-kwaliteit beter zal behouden en celverlies zal verminderen. Om levensvatbare en gezonde cellen te isoleren met behulp van FACS, eerst 15 milliliter smalbodembuizen bereiden met acht milliliter ijskoude een procent BSA/ HBSS voor monstercollecties. Om ervoor te zorgen dat de interface tussen het oppervlak van de vloeistof en de binnenkant van de buis vochtig is en om statische en oppervlaktespanning te voorkomen, keren de buizen voor de verzamelingen om.

Onmiddellijk na facs cel sorteren, zodra cellen worden verzameld in een 15 milliliter buis, gebruik maken van een milliliter van een procent BSA / HBSS te wassen en duw alle cellen naar beneden van het zijoppervlak van de buis. Centrifuge vervolgens elk monster op 260 g gedurende acht minuten. Na het weggooien van de supernatant, opnieuw opschorten de cel pellet in een procent BSA / HBSS, en voeg 33,8 microliters aan een buis, en houd die buis op ijs.

Deze stap is ontworpen om te worden gedaan met behulp van reagentia verkregen uit een gestandaardiseerde kit. Alle aangetoonde stappen moeten worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Ter voorbereiding op gem generatie, plaats een chip in de chiphouder, de bereid een cel master mix op ijs, volgens het protocol van de fabrikant.

Voeg 56,2 microliter van de master mix toe aan een buis met 33,8 microliter zelfsuspensie. Om de chip voor te bereiden, eerst op 50 procent glycerol aan de putten die niet zal worden gebruikt. Voeg vervolgens 90 microliters van de cel master mix goed een, 40 microliter van gel kralen tot goed twee, en 270 microliter van partitionering olie tot goed drie.

Bedek de chip met een pakking. Als u de chip wilt laden en in een eencellige controller wilt uitvoeren, jectt u eerst de lade. Plaats de chip in de lade.

Trek de lade in en druk op afspelen. Verzamel na de volledige run 100 microliter van het monster en plaats in een PCR-buis. Plaats PCR-buizen in een vooraf ingestelde PCR-machine en draait volgens de kit.

Na de run, GEMs zal omvatten full-length, barcoded cDNA, van polyadenylated mRNA. Plaats de buizen op min 20 graden Celsius 's nachts. Ga verder met bibliotheekbouw, sequencing, uitlijning en analyse.

Zodra monsters zijn gesequenced en uitgelijnd zoals beschreven in het manuscript, deponeren van de gegevens op een openbare repository, zoals NCBI's GEO. Om dit te doen, registreren voor de indiener account. Vul eerst de GEO-indiening in door het metagegevensblad te downloaden.

Zorg ervoor dat u slechts één metagegevensblad per projectinzending opneemt. Plaats de spreadsheet in de map. Voeg ten tweede het ruwe gegevensbestand dat is gegenereerd uit het rapport voor het aantal cellenranger voor alle bibliotheken toe aan de map.

De derde map bestaat uit verwerkte gegevensbestanden. Plaats verwerkte gegevensbestanden gegenereerd uit het count-script van de celranger voor alle bibliotheken in de map. Gebruik de FTP-serverreferenties van de GEO-indiener om de map met alle drie de componenten over te zetten.

Na het uitvoeren van Cell Ranger kunnen analyseklare genbarcodematrices verder worden verwerkt met behulp van geavanceerde bioinformatica. Eerst werden voorbewerkingshoeveelheden controles uitgevoerd met behulp van het Seurat R-pakket, dat viool- en verstrooiingspercelen genereerde om het aantal genen, het aantal unieke moleculaire identificatiemiddelen en het percentage mitochondriale genen te visualiseren om cel doubletten en uitschieters te identificeren. Voor de selectie van de belangrijkste componenten of pc's werden elleboogpercelen gebruikt, waarbij pc's buiten het plateau van de standaarddeviatie van de pc-as werden uitgesloten.

De resolutie van clustering werd ook gemanipuleerd. Lage resolutie leidde tot minder celclusters, waarbij elk cluster waarschijnlijk een gedefinieerd celtype vertegenwoordigt. Hoge resolutie leidde tot een hogere celkans, die subtypen of overgangstoestanden van een celpopulatie vertegenwoordigt.

Clusterinstellingen met lage resolutie werden gebruikt voor verdere analyse van expressiewarmtekaarten om de meest uitgedrukte genen in een bepaald cluster te identificeren. Individuele kandidaat-genen werden gevisualiseerd op tSNE-plots, met behulp van Seurat's functieplotfunctie, die het mogelijk maakten te ontcijferen, of er clusters waren die bijvoorbeeld macrofagen vertegenwoordigden. Zowel cluster twee als vier uitgedrukte CD68, een pan-macrophage marker.

Andere pakketten bieden ook tools voor kwaliteitscontrole, bijvoorbeeld Monocle, een R-pakket dat wordt gebruikt voor het bouwen van celtrajecten, verwijdert cellen van slechte kwaliteit en zorgt ervoor dat de verdeling van mRNA over alle cellen normaal is en tussen boven- en ondergrenzen valt. Enkele cellen werden vervolgens geclassificeerd en geteld, met behulp van bekende lijnmarkeringsgenen, en cellen die merkers van belang uitdrukken werden toegewezen aan celtype één. Er werd vastgesteld dat celtype nummer één fibroblasten waren.

Deze populatie werd beoordeeld om fibroblasten ontwikkelingstraject te bouwen. Na deze procedure, andere methoden zoals kwantitatieve PCR, in situ hybridisatie, een immunistische chemie moet worden uitgevoerd om de nauwkeurigheid van uw genexpressie resultaten te valideren. Single-cell mRNA sequencing heeft nu de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op veel verschillende gebieden om de cel-naar-cel heterogeniteit te verkennen, en functionele dynamiek te identificeren in verschillende weefsels tijdens homeostase, en hoe deze kunnen veranderen na letsel of in ontwikkeling van de ziekte.