Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen

Deze video toont een eenvoudige methode voor het onderzoeken van meerdere kandidaat-genen in AML parallel, met behulp van de Crisper-Cas9 systeem in combinatie met de stroom cytometrie gebaseerde concurrerende groeitest. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel en schaalbaar is. Het aantonen van de procedure zal Bo Rui Chen zijn, een postdoc van ons lab.

Een web gebaseerde CRISPR ontwerp software wordt gebruikt om vier tot zes enkele gids RNAs ontwerpen voor het gen van belang. Vul om te beginnen de juiste informatie in de velden met sterretjes in. Selecteer vervolgens het doelgenoom voor het RNA-ontwerp met één gids.

Plak de doelreeks in het volgordevak en klik op de knop Verzenden. Voor het klonen in de gewenste gids RNA expressie plasmid, prepend de nucleotiden CACC aan de zin oglionucleotide en AAAC aan de omgekeerde gratis antisense oligonucleotide. Voorgemengde zin en antisense oligonucleotiden worden vervolgens besteld bij een bedrijf in een 96 put plaat, gelabeld Oligo Mix.

Zet een aparte U-Bottom 96 putplaat, gelabeld Annealing Plate. Bereid een master mix van een microliter van T4 polynucleotide kinase, een microliter van 10x T4 DNA ligatie buffer, en zes microliters van water per gloeiende reactie. Voeg 8 microliters van de master mix toe aan elke put van de Annealing Plate, gevolgd door 2 microliter voorgemengde zin en antisense oligonucleotiden.

Pipette twee tot drie keer voorzichtig om goed te mengen, en draai de plaat kort om de mixen naar de bodem van de putten te krijgen. Gebruik het volgende annealing-programma in een PCR-machine. 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, 95 graden Celsius gedurende twee minuten en 30 seconden, gevolgd door langzame koeling tot 22 graden Celsius met een snelheid van 0,1 graden Celsius per seconde.

Wanneer de annealing is voltooid, bereid een verse 96 put plaat, gelabeld Verdunde Oligo Mix, door het verdunnen van de fosforyleerde en geannealed oligonucleotiden uit de gloeiende reactie een tot 200 met water. Lineariseer de single guide RNA-expressievector door vijf microgram van de vector te verteren met 1,5 microliter BBS1-beperkingsenzym, met behulp van een geschikte buffer bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Neem vervolgens een verse 96 goed plaat gelabeld Ligation Plate, en voeg 20 nanogram van de BBS1 verteerde enkele gids RNA expressie vector aan een goed per gewenste gids RNA ligatie.

Voeg hiervoor 2 microliter fosforgeyleerde geannealde oligonucleotiden toe aan de verdunde Oligo Mix-plaat. Voeg aan elke put, een microliter van 10X T4 ligase buffer, en een microliter van T4 ligase enzym, en zachtjes pipette te mengen. Broed de plaat twee uur lang op kamertemperatuur.

Ongeveer 10 minuten voordat de ligatiereactie is uitgevoerd, Vul 90 microliters van chemisch competente E.coli cellen op ijs. Breng 10 microliter aliquots van de bevoegde cellen in elke put van een aparte 96 put plaat individueel. Voeg het ligatiemengsel toe aan de putten die de bevoegde cellen bevatten.

Pipet op en neer zachtjes, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Pipette vijf microliters van de bacteriën DNA mix van elke transformatie reactie direct in een put van een 6 put plaat, met LB agar met 100 milligram per milliliter ampicilline. Voeg ongeveer vijf tot acht glazen kralen aan elke put, en schud de 6 put plaat acht tot 10 keer in een cirkelvormige beweging.

Incubeer de platen op 37 graden Celsius 's nachts. Op de volgende dag, kies een tot twee enkele kolonies uit elke put, met een steriele 20 microliter pipette tip, en streep het op een gelabelde plek op een steriele 10 centimeter petrischaal, met LB agar en 100 milligram per milliliter van ampicilline Na strepen op de LB plaat, eject de tip in drie milliliter ampicilline medium in een 14 milliliter bodem buis , gemarkeerd met het overeenkomstige bacteriële kloonnummer. De bacteriële plaat wordt dan direct verzonden voor Sanger sequencing.

Na een sequentie bevestiging van de gekloonde single guide RNAs, zuiveren het DNA van de overeenkomstige 14 milliliter buis, met behulp van een miniprep kit volgens de instructies van de fabrikant. Single guide RNA lentiviral deeltjes worden geproduceerd in een 96 put formaat, zoals beschreven in het tekstprotocol. En de virale supernatant wordt onmiddellijk bevroren bij min 80 graden Celsius.

Een dag voorafgaand aan de transductie van enkele gids RNAs in AML Cas9 cellen, coat een platte bodem niet weefsel cultuur behandeld 96 put plaat, met 100 milliliter van recombinant menselijke fibronectine fragment bij een concentratie van 10 microgram per milliliter. Wikkel de plaat met vastklampen wrap om verdamping verlies te voorkomen, en laat het op de bank 's nachts. Op de volgende dag, verwijder de recombinant menselijke fibronectin fragment uit elke put van de 96 put plaat.

Ontdooi de virale supernatant van elke gids RNA bij kamertemperatuur. Voeg 50 microliters virale supernatant van elke buis aan elke gecoate put van de transductieplaat. Wikkel de plaat met vastklampen wrap om mogelijke besmetting tijdens centrifugatie te voorkomen.

Draai de plaat op 1, 300 keer g bij 35 graden Celsius gedurende 90 minuten. Tegen het einde van de spinfectie, tel de hoge Cas9 uitdrukken kloon B3 cellen uit de cultuur kolf. Na het tellen, spin het vereiste aantal cellen, en resuspend in vers medium.

Gebruik na de spinfectie van 90 minuten een meerkanaals pipet aangepast aan 50 microliter om de supernatant langzaam uit alle putten te verwijderen door de plaat te kantelen. Voeg 100 microliter van de cultuur van kloon B3 cellen aan elke goed langzaam, naar beneden glijden van de velg. Draai de plaat op 1, 300 keer g bij 35 graden Celsius gedurende twee minuten om de cellen te laten settelen naar de bodem.

Breng de plaat naar een 37 graden Celsius weefsel cultuur rang incubator. Voeg de volgende dag 100 microliter vers medium toe aan elke put met afzonderlijke RNA-transduceerde cellen, zodat het uiteindelijke gemiddelde volume 200 microliters is. Breng de plaat terug naar de couveuse.

72 uur na de transductie, controleer het percentage van de enkele gids RNA met BFP positieve cellen in elke put door de stroom cytometrie. Gebruik een cel levensvatbaarheid kleurstof te markeren en uit te sluiten dode cellen van de analyse. Ga na elke feitenanalyse verder met het opnieuw plating van een deel van de cellen in nieuwe putten met vers medium om overgroei tijdens de test te voorkomen.

Elke twee tot drie dagen herhaalt u de feitenanalyse om het relatieve aandeel van BFP-positieve cellen te controleren in vergelijking met de bfp-negatieve tegenhangers. Analyseer het percentage BFP-positieve cellen voor elk tijdpunt, met behulp van een analysesoftware voor feiten. De sleutel tot het succes van de concurrerende proliferatie test is het gebruik van de juiste gating technieken om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke live cel nummers nauwkeurig zijn.

Sleep FCS-bestanden voor elk monster naar de software. Dubbelklik op een voorbeeldbestand en plot een puntplot van voorwaartse spreiding versus zijverstrooiing, met voorwaartse spreiding op de x-as en zijverstrooiing op de y-as. Bek je alle cellen.

Dubbelklik op de gated cellen, en plot levensvatbaarheid vlek op de y-as versus voorwaartse spreiding hoogte of gebied stip plot. Poort de levensvatbaarheid vlek negatieve cellen. Dubbelklik op de gated live cellen en plot BFP op de y-as versus forward scatter op de x-as.

Poort de BFP positieve cellen. Pas al deze poorten toe op alle monsters door het geselecteerde monster naar alle voorbeelden onder het groepstabblad te slepen. Klik op de tabeleditor om een analysetabel te maken van alle voorbeelden.

Sleep het positieve BFP-aantal van het ene voorbeeld naar de tabel en klik op de weergaveknop in de tabeleditor om een batchrapport van alle voorbeelden te maken, waarbij de tabel het percentage BFP-positieve cellen weergeeft. Sla de tabel op als een excel-bestand. Dit systeem werd gebruikt om de rol van genen te onderzoeken die een rol kunnen spelen in de proliferatie of overleving van menselijke en murine AML-cellijnen.

Gericht op de AAVS1 safe-harbor locus met twee afzonderlijke single guide RNAs had geen effect op de proliferatie van menselijke MOM13 Cas9 cellen Daarentegen, toen het DNA-replicatie geassocieerd gen, RPA3, werd gericht, een geleidelijke en significante daling van het percentage BFP-positieve cellen in vergelijking met de BFP negatieve niet-getransduceerde tegenhangers werd waargenomen. Ook de effecten van single guide RNAs gericht op Dot1l, een epigenetische regulator, en Rhodopsine, het oogpigmentatiegen, werden getest in muis MLL-AF9 Cas9 cellen. Single guide RNAs gericht op Dot1l, toonde een dramatische en progressieve daling van de concurrentie proliferatie in tegenstelling tot enkele gids RNAs gericht rhodopsine.

Deze resultaten tonen de kwetsbaarheid aan van de MLL-AF9 die massa leukemiecellen uitdrukt tot Dot1l-uitputting, wat eerder gepubliceerde resultaten bevestigt. Uitgaande van vier tot zes gids RNAs per gen, deze methode is zeer geschikt om te worden gebruikt voor het testen van ten minste 16 tot 24 genen in parallel, en het kan ook worden toegepast op het testen van genafhankelijkheden in een kankercellijn. In het geval van een groter aantal genen, zoals een hele moleculaire route die moet worden getest in AML-cellen, zal pool CRISPR-Cas9 gebaseerde schermen nuttiger zijn.