Een studie van de Immunohistopathologic profileert de folaat Receptor Beta Macrophage en vasculaire immuun communicatie in gigantische cel Arteritis

Dit immunohistochemische en histopathologische protocol kan worden gebruikt om foliumzuurreceptor bèta te onderzoeken, dat is een kandidaat-eiwit met potentiële prognostische en therapeutische waarde voor de vasculaire micro-omgeving in gigantische cel arteritis. Dit protocol is beproefd en op grote schaal gebruikt en kan worden gebruikt om de foliumreceptor bèta-attributen in tijdelijke slagaderweefsels te verkennen, zelfs na langdurige opslag. Om weefselsecties te verwerven, gebruik een microtome om vier tot vijf micrometer dikke delen van paraffine-ingebedde tijdelijke slagaders te snijden, die elke sectie in een 40 graden Celsius waterbad drijven aangezien zij worden verkregen, om rimpels te verwijderen.

Gebruik glazen microscoopdia's om drie secties per dia vast te leggen en verwarm de dia's op een opwarmingsplaat gedurende 60 minuten in een oven van 60 graden Celsius. Wanneer de secties zich aan de glijbanen hebben gehecht, plaatst u de glijbanen gedurende 24 uur in een verticaal rek om te drogen bij 37 graden Celsius. Breng de dia's de volgende dag gedurende ten minste 12 uur over op een diacontainer voor opslag bij vier graden Celsius.

Laad vervolgens in een schuifrek en hydrateer de weefsels met twee vijf minuten, 100% xyleenonderdomies en een dalende, vijf minuten per concentratie ethanol onderdompelingsreeks, met 10 seconden agitatie om de 30 seconden. Na de 70%ethanol onderdompeling, spoel de dia's twee keer in dubbel gedestilleerd water gedurende vijf minuten, met 10 seconden van agitatie om de 30 seconden. Voor het ophalen van antigen, breng het rek in een glazen container met 200 microliters van 95 graden Celsius, 10 millimolar per liter citraat buffer gedurende 30 minuten.

Laat de glijbanen aan het einde van de incubatie 20 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat u vijf minuten met stromend water spoelt. Om de endogene peroxidaseactiviteit te verwijderen, gebruikt u eerst een hydrofobe marker om een cirkel rond elk weefselmonster te tekenen, voordat u de monsters in 200 microliters van 3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten uitbroedt, gevolgd door 3 wasbeurten in 200 micoliters van tris-gebufferde zoutoplossing, of TBSS, per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, dep elke dia voorzichtig om een overtollige buffer te verwijderen en voeg 200 microliters van de primaire antilichaam cocktail van belang en een cover slip aan elke dia voor een een uur incubatie in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.

Gooi aan het einde van de incubatie de afdekbonnen weg en spoel de glijbanen af met drie wasbeurten van twee minuten in verse tbs's. Voeg na het verwijderen van de overtollige buffer 200 microliter van een geschikte biotinylated secundaire antilichaamoplossing en een afdeksel toe aan elke dia voor een incubatie van 45 minuten in de vochtige kamer bij kamertemperatuur. Na het weggooien van de dek uitglijders, spoel de dia's met TBSS zoals aangetoond.

Verwijder eventuele overtollige buffer. En label de secties met 200 microliters van DAB substraat buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de dia's met TBSS en lopende kraanwater gedurende 10 minuten, voordat tellers met hematoxylin gedurende drie minuten.

Voeg vervolgens 70 microliters van een geschikt montagemedium toe aan elke dia en tip langzaam een glazen afdekkingsstrip op het montagemedium om te voorkomen dat er bellen ontstaan terwijl de afdeksel op zijn plaats wordt neergelaten. Voor histopathologische analyse plaatst u de dia op het podium van een lichtmicroscoop en beoordeelt u de vasculaire architectuur van de eerste weefselsectie. Kwantificeer vervolgens het aantal macrofagen ten opzichte van het aantal lymfocyten per sectie.

Voor immunohistochemische analyse, onderzoeken de folium receptor bèta-kleuring patroon op elke weefselsectie en kwantificeren van het aantal folium receptor bèta-positieve, CD68 positieve, en CD3 positieve cellen in 10 willekeurig geselecteerde high power velden per sectie. Hematoxylin en eosine kleuring in normale exemplaren onthult een normale arteriële anatomie, met endotheelcellen in de tunica intima, gladde spiercellen in de tunica media, en een heterogene collageen matrix, die fibroblasten en feeder vaten genaamd vasa vasorum in de tunica adventitia. Giant cell arteritis positieve tijdelijke slagaders tonen een matige tot ernstige ontsteking, met aggregaten en macrofagen, of histiocyten, lymfocyten, incidentele plasmacellen, en multi-nucleated gigantische cellen.

Luminale vernauwing wordt ook opgemerkt, en gepaard met intimale verdikking en een 90% verstoring van de interne elastische lamina. CD3 positieve lymfocyten en CD68 positieve macrofagen zijn ook aanwezig in alle gigantische cel arteritis positieve exemplaren, met vergelijkbare kleuring patronen waargenomen in alle biopten. Kleuring voor folium receptor beta is beperkt tot macrofagen en multi-nucleated gigantische cellen die bij voorkeur lokaliseren naar de adventitia en media.

Met name foliumzuurreceptor bèta bestond ongeveer 30% van de totale macrofagen. De tijdelijke slagader biopsie verwerking, snijden, en dewaxing vereisen zorgvuldige behendigheid om latere stappen uit te voeren. De dia-interpretatie vereist de expertise van een ervaren cardiovasculaire patholoog.

Herinner de kijkers eraan contact- en ademhalingsvoorzorgsmaatregelen te gebruiken, zoals handschoenen en geventileerde kappen, bij het hanteren van specimens en de reagentia.