Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Deze nieuwe methode voor het analyseren van omgekeerde transcriptie kan ons nieuwe dingen vertellen over het gebied van retro virologie. We kunnen bijvoorbeeld meer te weten komen over hoe cellulaire beperkingen werken of hoe antiretrovirale geneesmiddelen de HIV1-DNA-synthese remmen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat niet alleen informatie over de volgorde van Ontluikende Reverse Tran scrips biedt, maar het maakt het mogelijk om hun precieze 3-prime DNA termini in kaart te brengen bij een enkele nucleaire strakke resolutie.

De verrijking van HIV1 gratis NC's uit groothandel DNA van HIV1 geïnfecteerde cellen, wordt gedaan door hybride capture en moet worden uitgevoerd in een PCR-werkstation. Bereid een master mix van magnetische streptavidin kralen door pijp post honderd microliter kralen per monster in een enkele microcentrifuge buis plaats de buis op een magneet geschikt voor microcentrifuge buizen. Nadat de kralen zijn neergedaald naar de magneetzijde van de buis, verwijder de opslagbuffer, verwijder de buis van de magneet en schorten de kralen opnieuw op in vijfhonderd microliter van bindent wash of BW buffer.

Plaats de buis terug op de magneet, wacht tot de kralen te migreren naar de magneet, en verwijder de supernatant. Haal de buis uit de magneet, voeg vijfhonderd microliter caseïneoplossing toe, hang de kralen opnieuw op en broed tien minuten op kamertemperatuur. Na tien minuten, was de kralen met BW buffer.

Plaats de buis terug op de magneet, verwijder de supernatant en opnieuw zweven de kralen in vijfhonderd microliter van BW buffer. Voeg vijftig picomolen van elk gevangen biotinylated oligonucleotide per monster. Incubeer bij kamertemperatuur terwijl het schommelen in een eind over eindmixer dertig minuten.

Vervolgens, breng de buis terug naar de magneet, verwijder de supernatant, verwijder de buis van de magneet, voeg vijfhonderd microliter van 1x tien buffer, en opnieuw opschorten de kralen. Na de tweede wasbeurt opnieuw opschorten de kralen met de geïmmobiliseerde oligonucleotiden in tien microliter van 1x tien buffer per monster. Voor elk monster, label een microcetrofuge buis en voeg tien microliter van kraal suspensie, honderdzeventig microliter dna, en negentig microliters van 3x tien buffer.

Incubeer in een droog hitteblok bij tweeënnegentig graden celsius gedurende twee minuten om het DNA te ontaarden. Verplaats de buizen naar een ander droog warmteblok, dat is ingesteld op tweeënvijftig graden Celsius, en incubeer gedurende een uur. Elke tien minuten tijdens deze incubatie, omkeren van de buizen te mengen.

Wanneer de incubatie van een uur wordt gedaan, was de kralen eenmaal met vijfhonderd microliters van 1x tien buffer, en opnieuw op te schorten in vijfendertig microliters van nuclease vrij water. Zorg ervoor dat de kralen goed regelen door het verlaten van de buizen op de magneet voor ongeveer drie minuten voor het verwijderen van een vloeistof. Om elute, incubeer de buizen op tweeënnegentig graden Celsius in een droge warmte blok gedurende twee minuten.

Beweeg vervolgens snel de buizen op de magneet, één buis tegelijk. Zodra de kralen zijn gebonden aan de zijkant van de buis, breng de supernatant met de HIV1 DNA naar een verse buis. Om deze procedure te beginnen, opnieuw opschorten de lyophilized adapter op honderd micromolar in nuclease gratis water en vortex de buis.

Per monster, plus een controle monster, combineren nul punt vier vijf microliters van 10x T4 DNA ligase buffer, vier microliters van adapter, en punt nul vijf microliters van nuclease gratis water. Verwarm tot tweeënnegentig graden Celsius gedurende twee minuten, en laat het langzaam afkoelen tot zestien graden Celsius in een PCR-machine. Hierdoor kan de adapter een haarspeldstructuur vormen.

De belangrijkste stap in deze procedure is de efficiënte en onbevooroordeelde ligatie van aangepaste moleculen om 3-prime DNA termini te openen. Gezuiverde ontluikende cDNA moleculen van verschillende lengte worden gebondeerd aan een haarspeld enkele gestrande DNA adapter met behulp van T4 DNA ligase. De adapter draagt een willekeurige zes nucleotide barcode sequentie, die het mogelijk maakt voor paring om ligatie te vergemakkelijken, en dient tegelijkertijd als een identifier voor unieke leest.

De 3-prime termini adapter draagt een spacer om zelfligatie te voorkomen. Om zestig microliter uiteindelijke volume ligatie reacties, voeg het volgende aan elke PCR buis: zes microliters van 10x T4 DNA ligase buffer, vierentwintig microliter van veertig procent PEG, zes microliters van vijf molaire Betaïne, vier punt vijf microliter adapter, een punt twee microliter van T4 DNA ligase, en achttien punt thee microliters van DNA. Na het mengen van de reacties goed, incubeer in een PCR machine op zestien graden Celsius 's nachts.

Op de dag na de adapter ligatie, op dertig microliters van formamide met DNA-gel laden buffer aan elke ligatie reactie en meng goed door pijp post. Verwarm in een PCR-machine op vierennegentig graden Celsius gedurende twee minuten en zet dan meteen op ijs. De volgende stap is voor te bereiden op het denatureren van gel elektroforese.

Plaats een voorgegoten zes procent TBE denaturerende ureum polyacrylamide gel in een geschikte gel tank en voeg 1x TBE lopende buffer. Voer de gel twintig minuten uit. Gebruik vervolgens een spuit en een eenentwintig meter naald om de gelzakken met lopende buffer uit te wassen.

Laad vervolgens dertig microliter per put van hetzelfde monster in drie putten. Het is raadzaam om slechts één monster per gel uit te voeren om kruisbesmetting te voorkomen. Ren twintig minuten.

Terwijl de gel loopt, bereiden drie nul punt vijf milliliter microcentrifuge buizen per monster met behulp van een eenentwintig meter spuitnaald om gaten in de bodem te steken. Steek elk van de bereide buizen in een twee milliliter microcentrifuge buis en label ze met de steekproef naam plus laag, midden, of hoog. Wanneer de donkerblauwe kleurstof voorkant is ongeveer halverwege de gel, stop de elektroforese en verwijder de gel cassette.

Open de cassette en snijd de gel verticaal met een scheermesje. Om royaal accijnzen de strip met drie putten van geladen monsters. Voeg de gel strip aan een container met 1x TBE en vijf microliters van cyanine nucleïnezuur vlek en incubeer gedurende drie tot vijf minuten.

Zorg ervoor dat de kleuring voldoende is om de bovenkant van de vrije adapter die later moet worden verwijderd, gemakkelijk te identificeren. Maak vervolgens het oppervlak van een blauw lichttransilluminator grondig schoon met gedestilleerd geïoniseerd water. Haal vervolgens het gelstuk uit de kleuringscontainer en plaats het op de lichtbak.

Zet de lichtbak aan en inspecteer de gekleurde nucleïnezuren door het oranje filter. Een representatief gevedbonden DNA-monster op een gekleurde gel, wordt hier getoond. De adapter lijkt meestal overbelast en loopt als een grote blob met ligated HIV1 DNA loopt hierboven als een streep.

De rode lijnen geven de plaatsen aan de gel moet worden gesneden om de vrije adapter te verwijderen en het monster in drie gelijke stukken te verdelen. Met behulp van een nieuw scheermes, snijd de zijkanten van de gel als er gebieden met geen monster geladen nog steeds aanwezig. Snijd vervolgens net boven de adapter om de adapter en onderste geldelen te verwijderen.

Snijd ten slotte de bovenkant van de gel weg, inclusief ongeveer een millimeter van de gelzakken die vaak een scherp intens signaal van dna met een hoger moleculair gewicht hebben. Verdeel het resterende gelstuk dat het monster horizontaal in drie gelijke stukken bevat. Gebieden met een laag, midden en hoog moleculair gewicht.

Snijd vervolgens elk van de drie gelfragmenten in twee bij twee millimeter stukken en breng ze over in de bereide nulpunt vijf milliliter microcentrifugebuizen. Draai één minuut op topsnelheid met open deksels. Om de gel stukken door het gat in de twee milliliter buis te persen om een gel slush te creëren.

Als er geldeeltjes in de bodem van de nulpunt vijf milliliter buis blijven, breng ze dan handmatig naar de twee milliliter buis met behulp van een naald. Begin de DNA-extractie procedure door het toevoegen van een milliliter ureum gel extractie buffer aan de gel slush in elke microcentrifuge buis. Draai de buizen met een einde over-end mixer op kamertemperatuur voor een minimum van drie uur.

De filterkolommen voorbereiden. Gebruik een schone set pincet om een klein rond glasvezelfilter toe te voegen aan elke centrifugekolom met celluloseacetaatmembraanfilters, die membraanverstopping voorkomen. Zet het filter op zijn plaats met een omgekeerde pijp koppunt.

Draai de twee milliliterbuizen kort met gelslush en extractiebuffer in een microcentrifuge en breng zevenhonderd microliter van het supernatant over naar de voorbereide filterkolommen. Centrifugeren de filterkolommen in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende een minuut. Breng vervolgens de stroom door naar een nieuwe twee milliliter microcentrifugebuis.

Herlaad de kolommen met de resterende supernatant. Probeer zoveel mogelijk vloeistof uit de extractie slush te verkrijgen en maak je geen zorgen als er gelstukken zijn inbegrepen. Weer draaien.

Combineer de stroom door dezelfde extractiemonsters en ga verder zoals beschreven in het tekstprotocol. Dit protocol werd gebruikt in monsters van CEMS-ST cellen besmet met Vif-deficiënte HIV-1 in de afwezigheid of aanwezigheid van de antiretrovirale menselijke eiwit A3G. Een plot van het totale aantal unieke reads verkregen uit elk monster geeft aan dat toenemende niveaus van A3G het totale leesaantal verminderen.

Als gevolg van het remmende effect van A3G op omgekeerde transcriptase bemiddelde cdna synthese. In deze volgende drie percelen, de fractie van moleculen op elke mogelijke lengte binnen de eerste honderdtachtig tweeëntcleotiden, wordt weergegeven in blauwe histogrammen. De toevoeging van A3G kost een sterke toename van kortere afgekapte cdna moleculen op een paar zeer specifieke reproduceerbare posities.

De gestippelde rode lijnen, tonen de percentages van reads die C naar T mutaties op de respectievelijke positie. Een positieve controle kan worden geproduceerd door de verwerking van een pool van synthetische oligonucleotiden van know sequentie, lengte en concentratie. Alle moleculen moeten verschijnen in nauwe gelijke overvloed met slechts kleine variaties.

Als een bibliotheekuitloop een kleine lengtebias produceert, in het opeenvolgen, is het raadzaam om een normalisatiefactor toe te passen die van de helling wordt afgeleid die de groottebias vertegenwoordigt. Deze procedure kan gemakkelijk worden aangepast aan andere systemen waar het bepalen van de drie priemgevode uiteinden van DNA-moleculen zou belangrijke inzichten toe te voegen in ares van nucleïnezuur metabolisme. Vergeet niet dat het werken met HIV zeer gevaarlijk kan zijn en dat sommige infecties alleen mogen worden uitgevoerd in aangewezen veiligheidslaboratoria.