Name: Listeria monocytogenes Infectie van de hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Leer hoe Listeria monocytogenes de bloed-hersenbarrière kruist en hoe bacteriële kolonisatie in hersenweefsel wordt gekwantificeerd met een geautomatiseerd perfusiesysteem. Deze methode biedt inzicht in pathogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de US Public Health Service verlenen van AI103806 van de National Institutes of Health.

Alle dieren moeten worden gehandhaafd en met maximale zorg aan het minimaliseren van ongemak in de loop van de procedure behandeld worden. De procedure moet worden uitgevoerd met inachtneming van de institutionele Animal Care gebruik Comité en alle federale, staats- en lokale wetten. Ook rekening mee dat de laboratoriumexperimenten te worden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de bioveiligheid niveau 2.
1. groei van L. monocytogenes voor muis infectie Studies
<ol><li>
Autoclaaf 500 mL hersenen hart infusie (BHI) agar-voedingsbodem in een erlenmeyer van 1 L te bereiden vaste voedingsbodems platen. Laat de media in een waterbad van 56 ° C afkoelen en voegt u een definitieve concentratie van 100 µg/mL streptomycine.
	<ol>
<li>Giet 25 mL media/petrischaal in petrischaal platen. Laat de platen te drogen bij kamertemperatuur (22 oC-25 ° C). Indien nodig kunnen de platen worden gedroogd bij 37 ° C tot volledig droog.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Met behulp van een steriele inoculating lus en aseptische techniek, verkrijgen een volledige lus van bevroren L. monocytogenes stam 10403S11,12 van een bevroren in BHI media plus 30% glycerol voorraadculturen en onderhouden in een vriezer-80 ° C.
	<ol>
<li>Streep de L. monocytogenes op een BHI agar/streptomycine plaat zodat één bacteriële kolonies kunnen worden geïsoleerd. Plaats de platen in een 37 ° C incubator's nachts (18 h tot 24 h) om te groeien van de kolonies van L. monocytogenes .</li>
		<li>Met behulp van een steriele inoculating lus, kies een honkslag L. monocytogenes kolonie van de agar BHI plaat en enten van de kolonie in een steriele reageerbuis met 5 mL BHI bouillon met 100 µg/mL streptomycine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubeer de L. monocytogenes cultuur buis licht gekanteld bij 30 ° 's nachts in een statische incubator.
	<ol>
<li>De volgende dag, Inspecteer visueel of de cultuur van L. monocytogenes voor groei (de BHI media zullen troebel) en vortex kort om een uniforme opschorting van de cultuur.</li>
		<li>Aseptisch verwijderen van een hoeveelheid van 1 mL van de bacteriecultuur en meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) gebruik van een spectrofotometer. Opmerking: Steriele BHI Bouillon wordt gebruikt als de blanco voor de spectrofotometer lezen voordat het meten van de extinctie van de L. monocytogenes cultuur. De cultuur van L. monocytogenes kan ook worden verdund (twee tot vijfvoudige) in BHI vóór het lezen van de optische dichtheid.</li>
		<li>Bepaal het aantal L. monocytogenes kolonie vormende eenheden (kve) per mL BHI cultuur door plating 10-fold seriële verdunningen van de cultuur. Dit is handig om een relatie tussen de extinctie van de L. monocytogenes cultuur en het aantal bacteriën per mL van de cultuur. In het algemeen, een OD-600 voor 1.0 voor een L. monocytogenes cultuur is gelijk aan ongeveer 1 x 109 CFU van bacteriën per mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van L. monocytogenes infectie van muizen
<ol><li>Achttien vierentwintig uur voor dierlijke infectie, groeien van L. monocytogenes culturen in BHI bouillon met 100 µg/mL streptomycine en bepalen van de OD600/ ~ CFU / mL zoals aangegeven in stap 1. Opmerking: Muizen zijn over het algemeen een week voorafgaand aan de infectie besteld en zijn gewend aan het dier faciliteit voor infectie studies zijn uitgevoerd. In deze studie, 6-8 weken oude vrouwelijke BALB/c muizen (5 muizen per groep) waren gehuisvest in een omgeving van de barrière in de Harvard Medical School BSL2-level dierlijke insluiting facility en voedsel en water ad libitumverstrekt.</li>
	<li>Bepalen van het bedrag van L. monocytogenes cultuur moet elke muis op basis van infecteren de ~ kve per mL bacteriecultuur. Een verdunning van de cultuur van L. monocytogenes in steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7,2 (PBS) aanbrengen in de juiste concentratie van bacteriën. Muizen zijn meestal intraveneus besmet met 200 µL van PBS met 1 – 2 × 104 CFU van bacteriën/dier.</li>
	<li>Controleer of het aantal L. monocytogenes in het entmateriaal door 10-fold seriële verdunningen op BHI agar platen met 100 µg/mL streptomycine plating. Incubeer de platen in een incubator van 37 ° C's nachts om te bepalen van het aantal L. monocytogenes geïnoculeerd per muis als volgt: Entmateriaal (CFU) = (aantal kolonies x verdunningsfactor) / mL verguld x geïnjecteerd volume (mL)</li>
</ol>3. infectie van muizen met L. monocytogenes via intraveneuze staart veneuze injectie
<ol><li>
De deksel en voedsel opslaglocaties verwijderen uit de kooi met de muizen en plaats van de kooi onder een 250 W infrarood warmte lamp voor 5 min. Opmerking: Deze methode maakt het mogelijk de staart aderen verwijden, ervoor te zorgen dat injecties eenvoudiger uit te voeren.<ol>
<li>Zorgvuldig plaats het dier in een gepaste afmetingen muis beteugeling van apparaat om het dier veilig te bedwingen tijdens staart ader injecties.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meng de L. monocytogenes entmateriaal (stap 2.2) en laadt het entmateriaal in een spuit van 1 mL uitgerust met een 26 G naald.</li>
	<li>Zoek een ader van de laterale staart van de muis en de injectieplaats met een alcohol-pad of een 75% ethanol spray reinigen.</li>
	<li>
Injecteer voorzichtig de muis met 200 µL van de schorsing van L. monocytogenes in een ader van de laterale staart de spuit met de naald 26 G.
	<ol>
<li>Gebruik van katoen gaas kort druk uitoefenen op de injectieplaats voor elke bloeden te stoppen, en plaats het dier in een nieuwe kooi. Opmerking: Voer dit proces voor alle van de muizen worden geïnjecteerd en het markeren van de kooi met passende etiketten. Om te bepalen van de concentratie na injectie van het entmateriaal L. monocytogenes , herhaalt u stap 2.3 met behulp van het resterende bedrag van entmateriaal. De intraveneuze L. monocytogenes infectie entmateriaal per muis wordt gemeld, de gemiddelde CFU vanaf de pre en post injectie entmateriaal monsters gemeten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De besmette dieren dagelijks controleren en opmerking van de openlijke symptomen van ziekte (bijvoorbeeld gegolfde bont, gebogen houding, trage beweging, verlies van het gewicht). Verwijderen van dieren die lijken te worden aanzienlijk stervende vóór 72 uur na infectie (bijvoorbeeld 24, 48 uur na infectie) uit de studie en humaan te offeren. Blijven dagelijks volgen totdat alle resterende dieren zijn geofferd op 72 uur na besmetting. Opmerking: De 50% letale dosis (LD50) voor L. monocytogenes stam 10403S in BALB/c muizen is ~ 1-2 x 104 CFU/dier. Muizen geïnfecteerd met LD50 doses van L. monocytogenes met behulp van dit protocol vertonen tekenen van ziekte, zoals hierboven aangegeven, en onderzoekers kunnen verwachten dat de muizen te bezwijken aan de infectie na 72 uur na besmetting.</li>
</ol>4. dissectie en cardiale perfusie van muizen geïnfecteerd met L. monocytogenes
<ol><li>
72 uur na infectie (of op een eerder gewenste tijdstip) euthanaseren de geïnfecteerde muizen met behulp van een protocol goedgekeurd door de institutionele dier ethisch comité, zoals CO2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. Opmerking: Als bloedinzameling worden uitgevoerd, minimaliseren scheuren van de bloedvaten terwijl het uitvoeren van cervicale dislocatie.<ol>
<li>Bevestigen muizen hebben zijn euthanized door het uitblijven van een antwoord van de poot-twitch. Opmerking: Als cardiale perfusie worden uitgevoerd, een automatische pomp/perfusie systeem opgezet op een debiet van 4 mL volume/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats het dier op zijn rug in een pan dissectie en 75% ethanol toe te passen op het oppervlak van de abdominale vacht/huid.</li>
	<li>Met behulp van schaar, maak een incisie in de buikwand en uit te breiden van de incisie tot net onder de ribbenkast.</li>
	<li>Bloot het middenrif en de viscerale organen. Opmerking: Wees voorzichtig niet te lacerate een viscerale organen.</li>
	<li>Open de borstholte door het snijden van het middenrif en snijd de ribbenkast bilateraal om het linkerventrikel van het hart bloot te stellen.</li>
	<li>Met behulp van botte pincet, zachtjes begrijpen het hart en het invoegen van een naald 21 G vlinder aangesloten op een perfusie-systeem in het linkerventrikel en dan snijd zorgvuldig de juiste atrium voor het verzamelen van het bloed (~0.2 mL) in een tube van 2 mL, met 10 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) om te voorkomen dat coagulatie. Een schematisch diagram van cardiale perfusie in de muis is afgebeeld in Figuur 2. Opmerking: Als perfusie is niet te worden uitgevoerd, bloed kan worden verzameld door cardiale punctie met behulp van een spuit van 1 mL en snel omgezet in een tube van 2 mL, met 10 mM EDTA om te voorkomen dat coagulatie. L. monocytogenes -besmet organen worden daarna geoogst als beschreven (stap 5.1).</li>
	<li>Beginnen perfusie en perfuse van het dier voor 4 min met 15-20 mL PBS met 10 mM EDTA. Opmerking: Beoordelen perfusie door het observeren van het bloed en stroomt door het juiste atrium en in de pan dissectie van PBS-EDTA-oplossing. De hersenen en de lever verschijnt na volledige perfusie ervoor te zorgen dat overige bacteriën uit de geoogste organen en niet het circulerende bloed geblancheerde.</li>
</ol>5. orgaan het oogsten en bepaling van bacteriële lasten
<ol><li>Volgende perfusie, oogst organen (bijvoorbeeld de lever, milt) door het zorgvuldig verwijderen van alle therapieën en ligamenten gekoppeld en plaatst de organen afzonderlijk in een steriele 15 mL conische buis met 5 mL steriele koud (4 ° C) PBS. Opslaan monsters op ijs totdat verdere verwerking plaatsvindt.</li>
	<li>
Oogst van de hersenen, decapitate het hoofd achter de oren met behulp van schaar en knip de hoofdhuid huid tussen de ogen van het dier neer de middellijn. Indien nodig, trim overtollige weefsel de schaar tegen de schedel gedrukt te houden.
	<ol>
<li>Zachtjes een tip van de schaar invoegen het foramen magnum (het gat in de onderkant van de schedel, waardoor het ruggenmerg loopt) en snijd lateraal in de schedel aan beide zijden.</li>
		<li>Voorzichtig snijden de schedel daar tussenin van het knaagdier ogen neer de middellijn, controleren of het zijdelingse druk uitoefenen. Voorkomen van verstoring van de hersenen en onderhouden van minimaal contact tussen het hersenweefsel en de schaar.</li>
		<li>Open met fijne punt pincet, de schedel het blootstellen van de hersenen en plaats een spatel tussen de onderkant van de hersenen en de onderkant van de schedel aan de hersenen te verwijderen. Opmerking: Dit resulteert in het scheuren van de zenuwvezels van de hersenen.</li>
		<li>Zorgvuldig overbrengen in de hersenen een conische tube van 15 mL met 5 mL steriele koude PBS.</li>
		<li>Negeren van het karkas van de muis, en herhaal deze stappen voor de resterende dieren. Opmerking: Zodra alle organen zijn geoogst, reinig de procedure gebied en voorbereiden van de homogenisering van de orgel om bacteriële lasten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen en steriliseren van het puntje van een weefsel homogenizer geplaatst in een bioveiligheid kabinet door het invoegen van de tip en de homogenizer actief is 10 s opeenvolgend in 5% bleekmiddel, steriel water, 75% ethanol, steriel water elke opgenomen in een aparte 15 mL conische buis.</li>
	<li>
Meng de besmette hersenen (~ 20 s op instelling 6, maximale rpm) in de conische tube van 15 mL tot geen zichtbare weefsel fragmenten blijven.
	<ol>
<li>Schoon overgedragen de homogenizer zoals beschreven in stap 5.3 ter voorkoming van bacteriële besmetting van het volgende monster van het orgel.</li>
		<li>Het proces van homogenisering voor alle andere organen (bijvoorbeeld de lever, milt) uitvoeren.</li>
		<li>Zodra de homogenisering proces wordt voltooid, reinig de homogenizer zoals beschreven in stap 5.3 en winkel tot verder gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maak 10-fold seriële verdunningen van het homogenates orgel in steriele PBS en plaat de verdunningen op BHI agar/streptomycine platen om te bepalen van de kve per orgel. Opmerking: Een soortgelijke methode wordt uitgevoerd om te bepalen van de kve per mL bloed.<ol>
<li>Nadat alle verdunningen zijn verguld, de platen naar overbrengen een incubator 37 ° C's nachts.</li>
		<li>De volgende dag, het aantal kolonies op elke plaat om te bepalen van het totale aantal bacteriën per orgel of mL bloed als volgt: CFU/orgel = (aantal kolonies x verdunningsfactor) / mL homogenaat verguld x 5 CFU/mL bloed = (aantal kolonies x verdunningsfactor) / mL bloed verguld</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Radoshevich, L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+towards+a+complete+picture+of+its+physiology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).</li>
<li>de Noordhout, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+listeriosis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).</li>
<li>Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+the+central+nervous+system+by+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).</li>
<li>Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+penetration+across+the+blood-brain+barrier+during+the+development+of+neonatal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis.</a> Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).</li>
<li>Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+diagnosis%2C+and+antimicrobial+treatment+of+acute+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).</li>
<li>Thigpen, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+meningitis+in+the+United+States%2C+1998-2007%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007.</a> New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).</li>
<li>Durand, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+adults.+A+review+of+493+episodes%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes.</a> The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).</li>
<li>Disson, O., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+central+nervous+system+by+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes.</a> Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://cshperspectives.cshlp.org/content/7/1/a020412.short">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).</li>
<li>Kirchner, M., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROCK+activity+allows+InlF-mediated+invasion+and+increased+virulence+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes.</a> Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).</li>
<li>Grubaugh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VirAB+ABC+transporter+is+required+for+VirR+regulation+of+Listeria+monocytogenes+virulence+and+resistance+to+nisin%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin.</a> Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).</li>
<li>Vazquez-Boland, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+pathogenesis+and+molecular+virulence+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).</li>
<li>Ghosh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+the+brain+by+Listeria+monocytogenes+is+mediated+by+InlF+and+host+cell+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin.</a> MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).</li>
<li>Henke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+spreads+within+the+brain+by+actin-based+intra-axonal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration.</a> Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).</li>
<li>Maury, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+Listeria+monocytogenes+hypervirulence+by+harnessing+its+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity.</a> Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

L. monocytogenes vermag levensbedreigende meningo bij de mens veroorzaken. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat het vermogen van bacteriën om over te steken van de bloed-hersen-barrière (BBB) en tot het koloniseren van de hersenen. Drie routes van hersenen invasie hebben ingediend tijdens de infectie: penetratie van de BBB door bacteriën, stealth vervoer door bacteriën bevatte binnenkant mononucleaire cellen3en axonale migratie door stammen van L. monocytogenes waardoor dir...

De gram-positieve bacterie Listeria monocytogenes is een facultatief intracellulaire pathogenen en één van de meeste dodelijke voedsel overgedragen ziekteverwekkers wereldwijd. Inname van L. monocytogenes besmet voedsel kan leiden tot listeriose bij de mens, een ernstige invasieve ziekte gericht op voornamelijk zwangere vrouwen, pasgeborenen, de ouderen en immuungecompromitteerde personen-1. L. monocytogenes behoort tot de belangrijkste doodsoorzaken door een ziekteverwekker van voedsel in de VS en case fatality tarieven van listeriose zijn zo hoog als 20-30%, de hoogste voor alle voedsel overgedragen ziekteverwekkers2. Geen vaccin bestaat momenteel voor L. monocytogenes en het vermogen van bacteriën om effectief verspreiden naar distale organen en de hersenen door overschrijding van de bloed - hersenbarrière (BBB) kan leiden tot levensbedreigende meningitis en kolonisatie van de hersenen3 , 4 , 5 , 6. bacteriële meningitis is meestal ernstig; terwijl de meeste mensen die behandeling ontvangen herstellen, infecties kunnen leiden tot ernstige complicaties, bijvoorbeeld, schade aan de hersenen, verlies van het gehoor of leerstoornissen bij kinderen. L. monocytogenes is voorspeld ter verantwoording voor ten minste 10% van alle communautaire verworven meningitis in de VS7.
Het is een belangrijke route voor bacteriële verspreiding aan de hersenen en hersenvliezen via de bloedbaan. Bacteriën in omloop in de bloedvaten in de hersenen zijn in staat om over te steken de BBB om infectie van de hersenen veroorzaken. De BBB is een zeer gevacuoliseerd barrière-systeem dat de hersenen beschermt tegen lichaamsvreemde deeltjes circuleren in het bloed. Endotheliale cellen vormen een laag die de binnenkant van de bloedvaten8,9lijnen. Naast L. monocytogeneskunnen meerdere bacteriële pathogenen zoals Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colien Haemophilus influenzae type b (Hib) koloniseren de hersenen door overschrijding van de BBB3,4,5,6. Bij de behandeling van bacteriële lasten in de hersenen van besmette muizen, is het echter belangrijk om te bepalen dat of bacteriën de BBB gekruist hebben, de bacteriële last in de hersenen anders bacteriën die zich nog in de bloedvaten van de hersenen kan vertegenwoordigen. Het is dus noodzakelijk om te perfuse van de muizen van alle bloed voorafgaand aan de vaststelling van de kolonie-vormende eenheden (kve) van hersenen homogenates.
In deze studie beschrijven we in vivo methoden te onderzoeken van L. monocytogenes infectie van de hersenen. We hebben voor de hier beschreven methoden, L. monocytogenes stam 10403S gebruikt. L. monocytogenes 10403S is één van de meest gebruikte laboratorium spanningen te bestuderen van systemische listeriose in de muismodel van infectie10. Dit protocol is gebaseerd op standaard intraveneuze injectie van L. monocytogenes gevolgd door perfusie van de muizen. Een schematisch overzicht van het protocol van de infectie in muizen is afgebeeld in Figuur 1. L. monocytogenes-besmette hersenen en andere organen van niet-geperfundeerd of geperfundeerd muizen werden verzameld en de lasten van de bacteriële orgel bepaald. Deze methoden zijn nuttig voor niet alleen bepalen totale bacteriële kolonisatie van de hersenen in besmette dieren, maar zijn ook nuttig om te bepalen of de bacteriën de BBB in vivo te bemiddelen invasie van de hersenen zijn doorgedrongen. Het is belangrijk om te benadrukken dat dit laboratorium protocol moet worden uitgevoerd na overleg met de relevante institutionele bioveiligheid Comité en dier Facilitair management.

<table><tbody><tr><td>Brain Heart Infusion media</td><td>Becton Dickinson</td><td>237200</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0382-50G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>97062-832</td><td></td></tr><tr><td>IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer</td><td>IKA</td><td>3352109</td><td>Model: T18BS1</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800 series</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Model #000651</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 G needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>21 G butterfly needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>367281</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom test tubes</td><td>VWR</td><td>60819-546</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline&nbsp;</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel spatula</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel scissors (6.5 in)</td><td>VWR</td><td>82027-592</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel scissors (4.5 in)</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel blunt forceps&nbsp; (4.5 in)</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel fine tip forceps&nbsp; (6 in)</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr></tbody></table>

listeria monocytogenes infectie van de hersenen

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is een intracellulaire bacteriële pathogenen die wordt vaak geassocieerd met voedsel overgedragen infectie. Het vermogen van L. monocytogenes te steken van de bloed - hersenbarrière (BBB) is over omdat het tot levensbedreigende meningitis en encefalitis leiden kan. De BBB beschermt de hersenen communicatie uit verschillende toxische metabolieten en microbiële ziekteverwekkers in het bloed na infectie gevonden, en steunt daarom de homeostase van de hersenen. De mechanismen waarmee L. monocytogenes aanwezig in de bloedbaan cross de BBB te veroorzaken hersenen infecties worden niet volledig begrepen en er is ook een gebrek aan een robuust modelsysteem te bestuderen hersenen infecties door L. monocytogenes. Hier presenteren we een simpele infectie model bepalen of bacteriën de BBB hebben gekruist en kwantificeren van de last van de bacteriën die de hersenen in vivozijn gekoloniseerd. Bij deze methode, dieren intraveneus besmet waren met L. monocytogenes en humaan waren euthanized door blootstelling aan CO2 gevolgd door cervicale dislocatie. Cardiale perfusie van de dieren werd uitgevoerd vóór de oogst van besmette organen. Bloed was verzameld voordat perfusie en het aantal bacteriën per orgel of mL bloed werd bepaald door plating verdunningen van het homogenates van het bloed of orgel op agar platen en het aantal kolonies tellen vormden. Deze methode kan worden gebruikt om te studeren van nieuwe receptor-ligand interacties die infectie van de hersenen door L. monocytogenes verbeteren en kunnen gemakkelijk aangepast voor de studie van meerdere bacteriële pathogenen.

De hersenen is zeer gevacuoliseerd en L. monocytogenes staat bekend om te infecteren celtypes aanwezig in het bloed3,13. De beschreven protocol wordt gebruikt om aan te tonen van het vermogen van L. monocytogenes te steken van de bloed - hersenbarrière (BBB) leidt tot infectie van de hersenen in muizen. Om te bepalen als bacteriën hebben gekruist het BBB in vivo, wordt perfusie van bloed in de muis uitge...

Tijdens de infectie is Listeria monocytogenes geschikt voor het oversteken van de bloed - hersen barrière om te koloniseren van de hersenen. In dit protocol, laten we zien hoe te beoordelen van bacteriële kolonisatie van organen na infectie van muizen. Is voorzien in een procedure voor het uitvoeren van hele orgel perfusie voor specifieke bepaling van bacteriële aantallen in de hersenen parenchym.

Listeria monocytogenes Infectie van de hersenen

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het bacteriële pathogenese veld over de vraag of door bloed overgedragen bacteriën de bloed-hersenbarrière kunnen passeren om het centrale zenuwstelsel en de hersenen te infecteren. Met deze techniek kunnen bacteriële getallen in het bloed en hersenweefsel van geïnfecteerde dieren worden bepaald, terwijl het aantal bacteriën dat zich in de bloedvaten van de hersenen bevat, uitsluit. Het aantonen van de procedure zal Pallab Ghosh zijn, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium.Stel na 72 uur na infectie een geautomatiseerd perfusiesysteem in op een stroomsnelheid van vier milliliter PBS, aangevuld met 10 millimolar EDTA per minuut. En plaats het geëuthanaseerde dier in de supine positie in een dissectie pan. Bevestig euthanasie door een gebrek aan reactie op poot snuifje.En nat de buik met 75% ethanol. Gebruik een schaar om een buikwand incisie te maken tot net onder de ribbenkast om het middenrif en viscerale organen bloot te leggen. En snijd het middenrif om de borstholte te openen.Snijd de wrijfkooi bilateraal om de linker ventrikel bloot te leggen en gebruik tangen om het hart zachtjes te grijpen. Steek

listeria-monocytogenes-infection-of-the-brain

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Listeria monocytogenes is een modelorganisme voor het bestuderen van immuunreacties en de genetische gevoeligheid voor bacteriën intracellulaire bij muizen. Deze methode stelt je in staat om bacteriële lading te meten en single-cell suspensies van de lever en de milt van de muizen voor het genereren van FACS-analyse van veranderingen in het immuunsysteem van cellen als gevolg van Listeria-infectie te bepalen.

Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes</em

Source: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the injection of Listeria monocytogenes into the tail vein of a mouse to establish systemic infection. It shows bacterial circulation, organ colonization, and the quantification of bacterial load in the heart by homogenizing tissue, performing serial dilutions, and plating.

Quantifying Bacterial Load in the Mouse Heart Following Tail Vein Injection of Listeria monocytogenes

This video demonstrates the quantification of the infective bacterial load from the perfused mouse brain infected with Listeria monocytogenes.

Assessing Bacterial Colonization in a Mouse Brain following Listeria monocytogenes Infection

Dit document beschrijft een nieuwe werkwijze voor orale infectie van muizen...

Mondelinge transmissie van<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Muizen via inname van besmet voedsel

Listeria monocytogenes is een Gram-positieve bacteriële pathogenen vaak gebruikt als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasieten. Beeldvorming laat L. monocytogenes infectie fasen in het kader van kleine interfererende RNA schermen maakt de globale studie van cellulaire mechanismen vereist voor bacteriële infectie van target gastheercellen.

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes veroorzaakt foetale infecties bij zwangere vrouwen en meningitis bij gevoelige populaties.  Subpopulaties van bacteriën kunnen hartweefsel koloniseren, waardoor myocarditis ontstaat bij patiënten en proefdieren.  Hier presenteren we een protocol dat beschrijft hoe L. monocytogenes cardiale celinvasie in vitro en cardiale kolonisatie bij geïnfecteerde dieren te beoordelen.

Beoordeling van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en hartkolonisatie bij geïnfecteerde muizen met listeria monocytogenes

Dit protocol beschrijft het enten van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) en interferon-γ (IFN-γ) responsen door natuurlijke killer (NK) cellen, natuurlijke killercellen (NKT) cellen te meten, en adaptieve T-lymfocyten na de infectie. Dit protocol beschrijft ook hoe om te overleven onderzoek bij muizen na infectie met een aangepaste LD 50 dosis van de ziekteverwekker.

Experimentele infectie met<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als een model voor de studie Host Interferon-γ Responses

Selectie van Plasmodium falciparum Parasieten voor Cytoadhesion Human Brain endotheelcellen

Tijdens het infectieproces, een belangrijke stap is de hechting van pathogenen met gastheercellen. In de meeste gevallen deze hechting stap gebeurt in de aanwezigheid van mechanische spanning opgewekt door stromende vloeistof. Beschrijven we een techniek die schuifspanning introduceert als een belangrijke parameter in de studie van bacteriële hechting.

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen...

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen

Leer hoe Listeria monocytogenes de bloed-hersenbarrière kruist en hoe bacteriële kolonisatie in hersenweefsel wordt gekwantificeerd met een geautomatiseerd perfusiesysteem. Deze methode biedt inzicht in pathogenese.

Listeria monocytogenes Infectie van de hersenen

Meer video's verkennen