Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Dus deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de macrofaag biologie veld te beantwoorden, zoals hoe de toestand van activering te karakteriseren onder verschillende omgevingen op eiwitniveau. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de mogelijkheid biedt om verschillende expressie van vele eiwitten in menselijke macrofagen te verkrijgen met behulp van labelvrije kwantificeringsmethode. Het demonstreren van de procedure zal Marie Malier en Magali Court uit mijn laboratorium.

Om te beginnen, voeg 15 milliliter van dichtheid gradiënt cel scheiding oplossing in elk van twee 50 milliliter centrifugatie buizen, zodat de oplossing kan opwarmen tot kamertemperatuur voor ontvangst van de LRSC. Dit is essentieel omdat de dichtheid afhankelijk is van de temperatuur. Maak de LRSC leeg in een 50 milliliter centrifugatiebuis.

Voeg 1x PBS tot 50 milliliter toe en meng. Voeg vervolgens heel langzaam 25 milliliter van het mengsel toe bovenop 15 milliliter geëquilibreerde dichtheidsgradiëntoplossing. Wees voorzichtig niet te mengen van de fasen tijdens deze stap.

Het bloed moet worden toegevoegd aan de dichtheidgradiëntoplossing zonder enige verstoring van deze fase. Centrifuge beide centrifugatiebuizen gedurende 25 minuten bij 700 G zonder pauzes. Aan het einde van de dichtheid gradiënt centrifugatie, de lagen van de bodem naar boven zijn de erytrocyten en granulocyten, de vorming van de pellet, de dichtheid gradiënt oplossing fase, een laag van PBMCs, en het verdunde plasma.

Met een pipet, door de plasmafase zonder het te aspireren. Verzamel vervolgens de PBMC-laag in een nieuwe 50 milliliter centrifugatiebuis. Voeg tot 50 milliliter 1x PBS toe aan de PBMCs als wassetup en centrifuge gedurende 10 minuten bij 300 G.Aspirate de supernatant en schort de pellet opnieuw op in 40 milliliter macrofaagmedium.

Nadat u de PBMC's in een Malassez-kamer hebt geplaatst, draagt u de hoeveelheid PBMCs die nodig is voor het uitvoeren van het experiment over naar een centrifugatiebuis. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 G.Aspirate de supernatant en schort de pellet opnieuw op in 80 microliter van de sorteerbuffer per 10 miljoen PBMCs. Voeg vervolgens 20 microliter cd14-microbeads per 10 miljoen PBMCs toe.

Meng goed, en incubeer gedurende 15 minuten op 4 graden Celsius onder constante agitatie. Voeg na incubatie een milliliter sorteerbuffer per 10 miljoen PBMCs toe als wasstap en centrifuge als voorheen. Vervolgens, aspirate de supernatant en opnieuw opschorten de pellet in 500 microliters van sorteren buffer per 100 miljoen PBMCs.

Plaats nu een kolom in het magnetisch veld van de scheidingsteken. Bereid de kolom door het spoelen met drie milliliter van sorteren buffer. Breng de celsuspensie aan op de kolom.

Dan verzamelen van de stroom door met niet-gelabelde cellen voor latere kleuring, indien nodig. Was de kolom drie keer met drie milliliter sorteerbuffer. Zorg ervoor dat u uw kolom niet droogt.

Plaats vervolgens een opvangbuis onder de kolom en verwijder deze uit de scheidingsteken. Na de was, pipet vijf milliliter van sorteren buffer in de kolom. Spoel onmiddellijk de magnetisch gelabelde cellen door de zuiger stevig in de kolom te duwen.

Herhaal deze stappen ten slotte met een nieuwe kolom voordat u de monocyten platmeert en de macrofaagpolarisatie uitvoert zoals beschreven in het tekstprotocol. Onderhoud de monocyten en de macrofagen in een zuurstofgecontroleerde omgeving om hypoxische conditieanalyse uit te voeren. Gebruik een hypoxie werkstation om cellen te behouden onder de gewenste zuurstof gedeeltelijke druk tijdens het experiment.

Bij het werken onder lage zuurstofdruk is het belangrijk om alle media- en wasbuffers onder het station voor te bereiden en voldoende te wachten om de juiste gedeeltelijke druk in de vloeistof te verkrijgen. Voer cellyse uit in een buffer onder een aangepaste kap. Laad het eiwitequivalent van 300.000 cellen voor elk monster op 4-12% bis-tris acrylamide gels.

Controleer de duur van de elektroforetische migratie om elk eiwitmonster te laten splitsen in zes gelbanden, zoals hier wordt getoond. Na het bevestigen en bevlekken zoals beschreven in het tekstprotocol, verlamt u de eiwitbanden met een schone scalpel. Dobbelstenen elke uitgesneden band voor het plaatsen van hen in 500 microliter buizen.

Nu, was de gel plakjes drie keer in 200 microliters van 25 millimolar ammonium bicarbonaat gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius, het weggooien van de ammonium bicarbonaat tussen elke stap. Volg dit met een wasbeurt in 25 millimolar ammonium bicarbonaat en acetonitril. Vervolgens dehydrateren de gel stukken met 200 microliters van 100%acetonitril gedurende 10 minuten.

Incubeer elk gelstuk met 10 millimolar DTT en 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 45 minuten bij 56 graden Celsius. Gooi vervolgens de DTT weg en ontcubeer het gelstuk met 55 millimolar iodoacetamide in 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 35 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Om alkylering te stoppen, gooi de gebruikte oplossing weg en ontcubeer je elk gelstuk met 200 microliter van 10 millimolar DTT in 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Was de gelstukken in 200 microliter van 25 millimolar ammoniumbicarbonaat. Vervolgens uitdrogen met 200 microliters van 100% acetonitril gedurende 10 minuten. Verteren de eiwitten 's nachts op 37 graden Celsius met Trypsin / Lys-C Mix volgens de instructies van de fabrikant.

Haal de resulterende peptiden uit gelstukken door 50 microliters van 50% acetonitril gedurende 15 minuten toe te voegen in laagabsorptiebuizen. Voeg na 15 minuten 50 microliter van 5% mierenzuur toe, voeg 50 microliter van 100% acetonitril gedurende 15 minuten toe. Trek en droog elke fractie in laagabsorptiebuizen om de absorptie van peptiden en monsterverlies te beperken.

Bewaar de monsters op 80 graden Celsius tot verdere analyse zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier is de representatieve zuiverheid beoordeeld door flow cytometrie na magnetische kraal selectie van CD14 positieve monocyten. Fase contrast beeldvorming van gedifferentieerde menselijke macrofagen tonen heterogeniteit van verkregen morfologieën voor twee verschillende polarisaties na negen dagen van cultuur.

Een voorbeeld van een off-gel spijsvertering met behulp van zilver-gekleurde SDS pagina gels wordt getoond. Evaluatie van eiwit uit cellyse en na in-oplossing spijsvertering toont de afwezigheid van afbraak tijdens lyse en de efficiëntie van de spijsvertering. Hier is een voorbeeld van een botsing-geïnduceerde dissociatie spectrum van een peptide gevonden bij massa-lading verhouding van 597,29 op het MS-spectrum met een elektrische lading van positieve twee.

Uit dit spectrum werd de overeenkomstige volgorde bepaald. Het uiteindelijke resultaat na analyse is een warmtekaart die de hiërarchische clustering van alle polarisatietoestanden vertegenwoordigt met differentiaal uitgedrukte eiwitten. Analyse onthult een cluster van eiwitten over-uitgedrukt in alle polarisaties in de 3%zuurstof conditie.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat je eerst moet beslissen wat voor soort fractionering u zal uitvoeren op nieuwe monsters om uw protocol dienovereenkomstig aan te passen. De proteomische benadering met behulp van dit werk is een aanvulling op genomische benaderingen die de afgelopen jaren zijn gebruikt op het gebied van de macrofaagbiologie polarisatiestudies. Na de ontwikkeling maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunologie om de verschillende staten van activering van immuuncellen bij mensen en ook bij andere zoogdieren te verkennen.

Vergeet niet dat het werken met DTT gevaarlijk kan zijn, dus je moet werken onder een aangepaste motorkap om deze procedure te doen.