Name: Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer een proteoomanalyseprotocol voor menselijke macrofagen onder hypoxische omstandigheden met label-free kwantificatie. Deze methode karakteriseert activeringstoestanden op eiwitniveau voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AM wordt gefinancierd door de jonge groep Leader programma ATIP/Avenir Inserm-CNRS, door la Ligue Nationale contre le Cancer en la ARC van de Fondation pour la recherche sur le Cancer. Wij danken Mariette Matondo van de Spectrometrie van de massa voor biologie-platform (UTECHS MSBIO, Pasteur Instituut, Parijs). Wij danken Lauren Anderson voor haar lezing van het manuscript.

Menselijke bloedmonsters (LRSC) van gezonde, de aangeduide donoren waren verkregen EFS (Frans nationaal bloed Service) als onderdeel van een geautoriseerde protocol (CODECOH DC-2018 – 3114). Donoren gaf ondertekende toestemming voor het gebruik van bloed.
1. Media en Buffer voorbereiding
<ol><li>Bereiden van het medium van de macrofaag [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x niet-essentiële aminozuren (NEAA)] en het warm tot 37 ° C.</li>
	<li>Bereiden de macrofaag medium + 10% menselijk serum van AB plasma (GAB), filteren (0,22 µm filter), dan is het warm tot 37 ° C (hierna aangeduid als de macrofaag medium + 10% SAB hierna).</li>
	<li>Voorbereiden van de sorteer buffer [1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,5% bovien serumalbumine (BSA) + 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)], filteren (0,22 µm filter) en handhaven bij 4 ° C.</li>
</ol>2. isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit vol systeem kamer (LRSC)
<ol><li>15 mL dichtheid kleurovergang cel scheiding oplossing zetten (Zie Tabel van materialen) in een 50 mL tube centrifugeren zodat het kan opwarmen tot kamertemperatuur (RT) vóór de ontvangst van de LRSC. Opmerking: Dichtheid is afhankelijk van temperatuur. Omdat dit product is opgeslagen bij 4 ° C, moet deze stap van tevoren worden gedaan, zodat het kan equilibreer aan RT.</li>
	<li>Leeg de LRSC in een tube van 50 mL centrifugeren, voeg maximaal 50 mL 1 x PBS en meng. Heel langzaam, voeg 25 mL van het mengsel bereid tijdens stap 2.2 op de top van 15 mL dichtheid kleurovergang oplossing tijdens stap 2.1 opgewarmd. Opmerking: Wees voorzichtig niet te mengen de fasen tijdens deze stap. Het bloed moet worden toegevoegd over de dichtheid van de kleurovergang oplossing zonder enige verstoring van deze fase.</li>
	<li>Centrifugeer beide centrifugeren buizen voor 25 min op 700 x g zonder pauzes. Opmerking: Aan het einde van de kleurovergang centrifugeren van de dichtheid, de lagen van bodem tot bovenkant zijn: de erytrocyten en granulocyten vormen de pellet, dichtheid kleurovergang oplossing fase, laag PBMCs en plasma.</li>
	<li>Met een pipet, de plasma-fase passeren zonder het aspirating en de laag PBMC verzamelen in een nieuwe centrifugeren-tube van 50 mL. Voeg maximaal 50 mL 1 x PBS aan de PBMCs als een wassen stap en Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 x g.</li>
	<li>Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 40 mL van macrofaag medium.</li>
</ol>3. magnetische Labeling en isolatie van CD14+ cellen (monocyten)
<ol><li>Tellen de PBMCs in een Malassez kamer. Trekken van het bedrag van PBMCs nodig voor de uitvoering van het experiment (meestal 100 tot 300 x 106 cellen), plaats ze in een buis van centrifugeren, en Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 x g.</li>
	<li>Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 80 µL van de sorteer buffer bereid tijdens stap 1.3 per 107 PBMCs. toevoegen 20 µL van CD14 microbeads per 107 PBMCs. Mix goed en incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C onder voortdurende agitatie.</li>
	<li>Voeg 1 mL buffer per 107 PBMCs sorteren als een wassen stap en Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g. gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL buffer per 108 PBMCs te sorteren.</li>
	<li>Plaats een kolom in het magnetisch veld van het scheidingsteken. Bereid de kolom door het spoelen met 3 mL buffer sorteren.</li>
	<li>Toepassing van de celsuspensie op de kolom. De kolom is afhankelijk van het aantal cellen worden geïsoleerd (hier, LS kolommen voor maximaal 109 PBMCs worden gebruikt). Verzamelen doorstroomtest met labelloze cellen. Opmerking: Vanaf deze stap, worden alle de buizen (negatieve en positieve selecties) gehouden om later te controleren van de verschillende stappen door stroom cytometry.</li>
	<li>Was de kolom met 3 x 3 mL buffer sorteren. Verzamelen labelloze cellen passeren de dezelfde buis uit stap 3.12. Wassen stappen door toe te voegen sorteren buffer, wees voorzichtig niet te drogen uw kolom. Plaats een buis van de collectie onder de kolom en verwijderen uit het scheidingsteken.</li>
	<li>Pipetteer 5 mL buffer in de kolom sorteren. Onmiddellijk spoelen de magnetisch gelabelde cellen door stevig de zuiger te duwen in de kolom. Om de zuiverheid van het CD14+ cellen, de eluted breuk is verrijkt over een tweede kolom.</li>
	<li>Herhaal stap 3.4 tot en met 3.7 met een nieuwe kolom.</li>
</ol>4. de beplating van monocyten
<ol><li>Tellen de monocyten in een Malassez kamer. Controleer de zuiverheid van het CD14+ cellen door stroom cytometry. Trekken van het bedrag van de monocyten noodzakelijk voor het experiment en plaats ze in een buis van centrifugeren.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g. Aspirate het supernatant en resuspendeer de pellet monocyt in macrofaag medium. Plaat van de cellen en laat ze regelen voor 50 min. tot 1 h. gecombineerd van het medium en het vervangen met macrofaag medium + 10% SAB + 25 ng/mL macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) om differentiatie.</li>
</ol>5. de polarisatie van de macrofagen op dag 6
<ol><li>Het medium gecombineerd. Vervangen door de macrofaag medium + 10% SAB met verschillende prikkels. Bijvoorbeeld, voeg 10 ng/mL interferon gamma (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) te verkrijgen van M1 polarisatie, of 20 ng/mL Interleukine 4 (IL4) + 20 ng/mL Interleukine 13 (IL13) voor M2 polarisatie. Opmerking: De stimulatie kan tussen 24 en 48 uur voordat wij overgaan tot andere tests worden uitgevoerd.</li>
	<li>Oogsten van cellen met een ontkoppelen oplossing of een cel schraper.</li>
</ol>6. celkweek onder lage zuurstof voorwaarden
<ol><li>Vanaf stap 4, houden de monocyten en macrofagen in een zuurstof-gecontroleerde omgeving te hypoxische voorwaarde analyses uit te voeren. Gebruik een werkplek hypoxie teneinde cellen onder de gewenste zuurstof gedeeltelijke druk tijdens het experiment. Opmerking: Bij het werken onder lage zuurstof druk, het is belangrijk om te bereiden alle media en wassen buffers onder het station en wacht voldoende te verkrijgen van de juiste gedeeltelijke druk in de vloeistof. Bijvoorbeeld vereist 10 mL PBS in een 60 mm petrischaal ongeveer 2 h te bereiken 25 mmHg voor O2 gedeeltelijke druk van atmosferische druk te starten (zoals we hebben gemeten met behulp van een glasvezel zuurstofsensor). In vele hypoxische stations of starterscentra, is de druk van zuurstof ingesteld als een percentage van de atmosferische druk. Als nauwkeurige metingen nodig zijn, is het beter om te gebruiken een station machtigen rechtstreeks in te stellen de zuurstof Druk mmHg.</li>
</ol>7. lysis en In-Gel spijsvertering (Protocol 1)
Opmerking: In deze en de volgende secties, worden twee protocollen gebruikt voor het verkrijgen van peptiden en LC-MS/MS analyses uit te voeren beschreven. Protocol 1 beschrijft lysis van de cel en de in-gel fractionering en de spijsvertering, en protocol 2 beschrijft in-oplossing cellysis gevolgd door in-oplossing spijsvertering en fractionering met behulp van een elektrisch scherpstellen methode.
<ol><li>Lysis van de cel in Laemmli buffer [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7,5% SDS 37% glycerol, 33,3% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol blauwe 0,2% w/v] uitvoeren. Het laden van het eiwit equivalent van 300.000 cellen voor elk monster op 4-12% BIB-Tris acrylamide gels.</li>
	<li>Het bepalen van de duur van de elektroforetische migratie naar het toestaan van elke eiwitSteekproef worden gesplitst 6 gel bands zoals wordt geïllustreerd in Figuur 3.</li>
	<li>Herstellen van de gel met een fixing oplossing (30% ethanol + 7,5% azijnzuur voor 20 min), voeg dan de kleurstofoplossing (R-250 Coomassie blue voor 45 min). Toevoegen van de destaining oplossing (30% ethanol + 7,5% azijnzuur totdat banden worden weergegeven) voordat de eiwit bands met een schone scalpel middendoor.</li>
	<li>Dobbelstenen elke weggesneden band vóór invoering in 500 µL buizen. Een schone glazen oppervlak is gerechtvaardigd om te voorkomen dat besmetting met keratines (5%-oplossing van de SDS in gedeïoniseerd water kan worden gebruikt voor het reinigen van oppervlakken).</li>
	<li>Wassen van de gel-segmenten 3 keer in 200 µL van 25 mM Ammoniumbicarbonaat gedurende 20 minuten bij 37 ° C, gevolgd door een wassen in 25 mM Ammoniumbicarbonaat en acetonitril (50% v/v). Uitdrogen van de stukken van de gel met 200 µL van 100% acetonitril gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Incubeer elk stuk gel met 10 mM DTT (dithiothreitol) in 25 mM Ammoniumbicarbonaat gedurende 45 minuten op 56 ° C (200 µL), gevolgd door 55 mM iodoacetamide in 25 mM Ammoniumbicarbonaat (200 µL) gedurende 35 min. in het donker op RT.</li>
	<li>Stop alkylatie, incubeer elk stuk van de gel met 200 µL van 10 mM DTT in 25 mM Ammoniumbicarbonaat voor 10 min op RT. Wash de stukken van de gel in 200 µL van 25 mM Ammoniumbicarbonaat, dan uitdrogen met 200 µL van 100% acetonitril gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Verteren de eiwitten 's nachts bij 37 ° C met trypsine/Lys-C mix volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Extraheren van de resulterende peptiden van gel stukken door toevoeging van 50 μl van 50% acetonitril voor 15 min, dan 50 μl van mierenzuur van 5% gedurende 15 minuten, en ten slotte 50 μl van 100% acetonitril voor 15 min. zwembad en droog van elke fractie in lage-absorptie buizen te beperken van adsorptie van peptiden en monster verlies. Het bewaren van de monsters bij-80 ° C tot verdere analyse.</li>
</ol>8. eiwit extractie en In-oplossing spijsvertering (Protocol 2)
<ol><li>Lysis van de cel (2 x 106 cellen) met 150 µL van het volgende lysis-buffermengsel uitvoeren:<ol>
<li>7 M ureum, 2 M thioureum 40 mM Tris en 4% CHAPS, aangevuld met proteaseinhibitors (volledige mini, EDTA-vrije proteaseinhibitor cocktail).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meng de oplossingen voor 30 min op RT met een thermoshaker. Centrifugeer bij 13,800 x g gedurende 20 min RT en bewaar het supernatant.</li>
	<li>Verwijderen van verontreinigingen met een 2D-opschonen kit:<ol>
<li>De kit bevat precipitant oplossing, co neerslaande oplossing was buffer en wassen additief.</li>
		<li>Voeg 300 µL van precipitant oplossing en meng goed. Incubeer op ijs voor 15 min. 300 toevoegen µL van co neerslaande oplossing. Centrifugeer de buizen (ten minste) bij 12.000 x g gedurende 5 min. Een kleine pellet moet zichtbaar zijn. Ga snel naar de volgende stap om te voorkomen dat resuspensie of verdeling van de pellet. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen weer met de GLB-scharnier en de pellet tegenover naar buiten te brengen van eventuele resterende vloeistof naar de onderkant van de buis. Een korte puls is voldoende. Er mag geen zichtbaar vloeistof in de buizen blijft.</li>
		<li>Zonder de pellet te verstoren, voeg 40 µL van co neerslaande oplossing. Laat de buis zitten op ijs voor 5 min. Centrifuge voor 5 minuten, haal hem eruit en negeren het wassen. Voeg 25 µL-geïoniseerd water. Vortex elke buis voor 5-10 s. De pellet moet verspreiden maar niet los in het water.</li>
		<li>Voeg 1 mL was buffer (vooraf gekoeld gedurende ten minste 1 uur bij-20 ° C) en 5 µL van wassen toevoegingsmiddel. Vortex totdat de pellet is volledig verspreid. Incubeer de buizen bij-20 ° C gedurende ten minste 30 min. Vortex voor 20-30 s elke 10 min Opmerking: De buizen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor maximaal 1 week met minimale eiwit-afbraak- of wijziging.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen (ten minste) bij 12.000 × g voor 5 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant. Een witte pellet moet zichtbaar zijn. Toestaan dat de pellet te airdry voor niet meer dan 5 min (indien de pellet te droog is, dat het zal moeilijk zijn om resuspendeer).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendeer de pellet eiwit in 300 µL van 8 M ureum en 0,1 M Ammoniumbicarbonaat. Vortex sterk voor 1 min. bepalen de eiwitconcentratie met behulp van een colorimetrische bepaling.</li>
</ol>9. in-oplossing spijsvertering (Protocol 2)
<ol><li>Disulfide bruggen verminderen door toevoeging van 5.1 µL van een waterige oplossing van 700 mM DTT (eindconcentratie 12,5 mM) aan de geresuspendeerde eiwitten uit stap 8.4 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten met een thermoshaker. Alkylate van cysteïne residuen door toe te voegen 20.3 µL van een waterige oplossing van 700 mM iodoacetamide (eindconcentratie 40 mM) en bij 25° C gedurende 30 minuten in het donker met een thermoshaker aan het broeden.</li>
	<li>990 µL van 0,1 M Ammoniumbicarbonaat Voeg aan het monster. Voeg een overeenkomstige hoeveelheid trypsine/Lys-C mix (enzym: substraat verhouding 1:100 w/w) toe. Incubeer bij 37° C's nachts met een thermoshaker.</li>
</ol>10. schoonmaak cartridges (Protocol 2)
<ol><li>Natte een patroon met 1 kolom-volume (1 mL) methanol. Reinigen van de cassette met 1 kolom-volume (1 mL) voor 80% acetonitril/HPLC-kwaliteit water en gooi de doorstroming. Equilibreer de cartridge met 4 kolom-volumes (4 mL) van 0,1% mierenzuur/HPLC-kwaliteit water en gooi de doorstroming.</li>
	<li>Breng steekproeven met 90 µL van 10% mierenzuur of water met pH 2-3 (Controleer de pH met een pH-indicator). Laad de aangezuurde monsters en verzamelen de doorstroming. Herlaad de doorstroming (met de niet-retained peptiden). De cartridge met 6 kolom-volume (6 mL) van 0,1% mierenzuur/HPLC-kwaliteit water wassen.</li>
	<li>Elueer peptides van de cartridge met 1 kolom-volumes (1 mL) van 0,1% mierenzuur acid/50% acetonitril/HPLC-kwaliteit water. Overbrengen naar een 1,5 mL microcentrifuge buis. Het concentreren van het monster met behulp van een vacuüm concentrator (150 x g, vacuüm op 160 mBar).</li>
</ol>11. fractionering door elektrisch te focussen (Protocol 2)
Opmerking: Peptiden zijn opgedeeld volgens hun elektrisch punten met behulp van een off-gel-fractionator op een strip van 13 cm die betrekking hebben op een pH bereik van 3 tot 10. We gebruikten het volgende protocol geboden door de leverancier (samengevat hieronder):
<ol><li>Voorbereiding van de volgende oplossingen: oplossing een (600 µL van glycerol oplossing, 60 µL van OFFGEL buffer, 4.34 mL ultrazuiver water) en B (1.776 mL van oplossing A) en 444 ÂµL van ultrazuiver water-oplossing.</li>
	<li>Monteer de IPG parkeerstroken, frames en elektroden volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Resuspendeer de steekproef met 1.8 mL van oplossing B. Voeg 40 µL van oplossing B in elk putje. Laden 150 µL van monster in elk putje.</li>
	<li>Selecteer de standaardmethode voor peptides: OG12PE00 (OFFGEL standaardmethode voor peptides voor gebruik met een 3100 OFFGEL Low Res Kit, pH 3-10, 12-well frames. Wacht tot deze methode is voltooid (~ 20 h). Het verzamelen van de breuken in goed geëtiketteerde buizen.</li>
</ol>12. clean-up Harvard apparaat kolom omgekeerde C18 Post-IEF (Protocol 2)
<ol><li>Geleidelijk een paar μL toevoegen in een tijd van 1% TFA in-geïoniseerd water naar elke breuk te Breng het monster. Controleer met behulp van pH-papier dat de pH over 3 of lager is.</li>
	<li>Voorbereiding van de volgende oplossingen: oplossing 1 (5 mL acetonitril, 10 µL van mierenzuur, 4.99 mL ultrazuiver water) en oplossing 2 (0,5 mL acetonitril, 10 µL van mierenzuur, 9.49 mL ultrazuiver water).</li>
	<li>Vooraf nat de spin-kolom met 150 µL van oplossing 1. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g en negeren de doorstroming. Was de kolom van de spin met 150 μl van oplossing 2. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g en negeren de doorstroming.</li>
	<li>De breuk door de kolom te passeren. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g en negeren de doorstroming. Wassen met 150 μl van oplossing 2. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g en negeren de doorstroming.</li>
	<li>Elueer de breuk met 50 μl van oplossing 1. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g. Herhaal deze stappen opnieuw.</li>
	<li>Droog-fractie met behulp van een vacuüm concentrator (150 x g, vacuüm 160 mBar) en opslaan bij-80 ° C</li>
</ol>13. analyse van Proteomic gegevens en bio-informatica18
<ol><li>Analyseren van de gegevens die zijn verkregen door een nano-LC-MS/MS massa spectrometer met behulp kwantificering software zoals MaxQuant (versie 1.5.2.8) en de Andromeda-zoekmachine.</li>
	<li>Stelt valse ontdekking tarief (FDR) tot 1% voor eiwitten en peptiden en een minimale lengte van 7 aminozuren. Instellen van enzym specificiteit als C-terminal Arg en Lys. Laat 2 gemiste breuklijnen op proline obligaties. Selecteer carbamidomethylation van cysteïne als vaste wijziging en N-terminal eiwit acetylation en methionine oxidatie als variabele wijzigingen.</li>
	<li>Verdere analyse van de gegevens met statistische analysesoftware. Een analyse van de functionele verrijking met FunRich software (www.funrich.org/) uitvoeren. Een gen ontologie verrijking analyses met behulp van DAVID software (https://david.ncifcrf.gov/) uit te voeren.</li>
</ol>

<ol><li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+biology+perspective+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders%3A+functions+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li>
<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li>
<li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li>
<li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+morphological%2C+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li>
<li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li>
<li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926(2013).</li>
<li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction%2C+termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li>
<li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informed-Proteomics%3A+open-source+software+package+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li>
<li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li>
<li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Omdat proteomics een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de expressie van verschillende eiwitten uit een hele cel of subcellular compartimenten is, is optimalisatie van het protocol van de lysis van de cel en de vertering van eiwitten aangepakt door een aantal studies. Er zijn drie belangrijke klassen van methoden, waaronder in-gel spijsvertering (vertering van eiwitten in polyacrylamidegel matrix)17, spijsvertering in oplossing18 en filter-aided monster voorbereiding<...

Macrofagen zijn ingeboren immune cellen die betrokken zijn bij een aantal fysiologische functies variërend van reacties op infectieziekten pathogenen tot weefsel homeostase, met inbegrip van de verwijdering van apoptotic cellen en reorganisatie van de extracellulaire matrix1. Deze cellen worden gekenmerkt door een sterke fenotypische plasticiteit2 dat vertaalt zich in een veel mogelijke activering Staten, ook wel genoemd polarisaties. De exacte moleculaire beschrijving van deze verschillende polarisaties is een prioriteit op het gebied van macrofaag biologie3. Er is voorgesteld om te classificeren deze polarisaties met behulp van de zogenaamde M1/M2-tweedeling, waarin M1 staat voor pro-inflammatoire en M2 voor anti-inflammatoire macrofagen. Dit model past goed in diverse pathologische situaties zoals acute infecties, allergie en obesitas4. Echter in chronisch ontstoken weefsels en kanker, is gebleken dat deze indeling is niet in staat om te begrijpen de brede fenotypische repertoire dat macrofagen aanwezig in bepaalde cellulaire omgevingen5,6,, 7. de huidige consensus is dat de macrofaag polarisatie beter wordt beschreven met behulp van een multidimensionale model te integreren van specifieke microenvironmental signalen8. Deze conclusie werd bevestigd door transcriptomic analyse van menselijke macrofagen waaruit blijkt dat het model van de M1/M2 in het beschrijven van de verkregen polarisaties9inefficiënt.
De studie gepresenteerd is gericht op het bieden van een protocol voor proteomic handtekeningen voor verschillende polarisaties in menselijke macrofagen. We beschrijven hoe onderscheiden van menselijke macrofagen in omgevingen van verschillende zuurstofniveaus en peptiden te verkrijgen van de hele macrofaag Proteoom voor het uitvoeren van een label-vrije kwantificering. Deze kwantificering kan de vergelijking van de expressie niveaus van verschillende eiwitten. Als het onderzoek aan stamcellen blijkt het belang van zuurstof als een milieu belangrijke parameter10, proberen wij te begrijpen hoe deze parameter weefsel macrofaag polarisatie in mensen kan beïnvloeden. De gedeeltelijke druk van zuurstof is gebleken dat bereik van 3 tot 20% (van totale luchtdruk) in het menselijk lichaam, waarbij 20% overeenkomt met ongeveer wat vaak in een cel cultuur incubator gebruikt wordt (de exacte waarde is ongeveer 18,6% terwijl het nemen van de aanwezigheid van water rekening).
Vorige werk heeft aangetoond dat alveolaire verschillen van interstitiële macrofagen van functionele en morfologische punt van uitzicht11 en dat deze verschillen zijn waarschijnlijk gedeeltelijk te wijten aan de verschillende zuurstofniveaus waaraan zij blootgesteld12 zijn. Beenmerg-afgeleide macrofagen Toon bovendien een verhoogde kunnen bacteriën bij blootstelling aan een lage zuurstof milieu12phagocytize. Het tegenovergestelde effect is gebleken voor menselijke macrofagen THP1-gesplitste13, maar deze resultaten ondersteunen het idee dat zuurstof een regulator van macrofaag biologie is en dat het noodzakelijk is deze rol op moleculair niveau in menselijke macrofagen te verduidelijken. In een eerdere studie, hebben wij toegepast een proteomics benadering van deze kwesties. Door gelijktijdig bij het meten van expressie niveaus voor duizenden eiwitten, we gewezen op het effect van zuurstof op polarisatie en verstrekt een lijst van nieuwe moleculaire markers. We hebben ook kunnen betrekking hebben op deze bevindingen tot enkele functies van de macrofagen. Met name, vonden we dat het percentage fagocytose van apoptotic cellen was verhoogd in IL4/IL13-gepolariseerde macrofagen, die was gekoppeld aan de opregulatie van ALOX15 zoals geopenbaard door de Proteoom analyse14. In de huidige studie beschrijven we het uitvoeren van een dergelijke analyse.

<table><tbody><tr><td>Hypoxia Working Station</td><td>Oxford Optronix</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 Flow cytometer</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Coomassie blue</td><td>Biorad</td><td>1.610.436</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td><td>Calbiochem</td><td>437627</td><td></td></tr><tr><td>2D clean-up kit</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Life Technologies SAS</td><td>NP0321 BOX</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS separation column LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>Interleukin 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>Interleukin 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma (INF&gamma;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (clone T&Uuml;K4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td><td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C Mix</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Solution (Histopaque 1077)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum from human male AB plasma (SAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL sterile plastic pipette</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C Eppendorf</td><td>VWR</td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

proteoom analyse van menselijke macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrofagen zijn ingeboren immune cellen die betrokken zijn bij een aantal fysiologische functies variërend van reacties op infectieziekten pathogenen tot weefsel homeostase. De verschillende functies van deze cellen zijn gerelateerd aan hun activatie-Staten, die heet ook polarisatie. De exacte moleculaire beschrijving van deze verschillende polarisaties is een prioriteit op het gebied van macrofaag biologie. Momenteel wordt erkend dat een multidimensionale aanpak is noodzakelijk om te beschrijven hoe polarisatie wordt gecontroleerd door Milieusignalen. In dit verslag beschrijven we een protocol ontworpen voor de proteomic ondertekening van verschillende polarisaties in menselijke macrofagen. Dit protocol is gebaseerd op een label-vrije kwantificering van macrofaag eiwituitdrukking verkregen in-gel gespreide en Lys C/trypsine-verteerd cellulaire lysis inhoud. We bieden ook een protocol op basis van-oplossing spijsvertering en elektrisch gericht fractionering als alternatief te gebruiken. Omdat zuurstofconcentratie een relevante milieu-parameter in de weefsels is, we gebruiken dit protocol om te verkennen hoe atmosferische samenstelling of een lage zuurstof-omgeving is van invloed op de indeling van de macrofaag polarisatie.

Vanaf perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) verkregen door differentiële centrifugeren, het protocol toestaat het verkrijgen van een bevolking van CD14+ monocyten met een beoordeeld zuiverheid van meer dan 98% door stroom cytometry (Figuur 1). Deze monocyten zijn subsidiair gedifferentieerd naar verschillende polarisaties (Figuur 2). Wanneer een fractionering op gel wordt gekozen, de migratie op SDS-pagina gelen ...

Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Dus deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de macrofaag biologie veld te beantwoorden, zoals hoe de toestand van activering te karakteriseren onder verschillende omgevingen op eiwitniveau. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de mogelijkheid biedt om verschillende expressie van vele eiwitten in menselijke macrofagen te verkrijgen met behulp van labelvrije kwantificeringsmethode. Het demonstreren van de procedure zal Marie Malier en Magali Court uit mijn laboratorium.Om te beginnen, voeg 15 milliliter van dichtheid gradiënt cel scheiding oplossing in elk van twee 50 milliliter centrifugatie buizen, zodat de oplossing kan opwarmen tot kamertemperatuur voor ontvangst van de LRSC. Dit is essentieel omdat de dichtheid afhankelijk is van de temperatuur. Maak de LRSC leeg in een 50 milliliter centrifugatiebuis.Voeg 1x PBS tot 50 milliliter toe en meng. Voeg vervolgens heel langzaam 25 milliliter van het mengsel toe bovenop 15 milliliter geëquilibreerde dichtheidsgradiëntoplossing. Wees voorzichtig niet te mengen van de fasen tijdens deze stap.Het bloed moet worden toegevoegd aan de dichtheidgradiëntoplossing zonder enige verstoring van deze fase. Centrifuge beide centrifugatiebuizen gedurende 25 minuten bij 700 G zonder pauzes. Aan het einde van de dichtheid gradiënt centrifugatie, de lagen van de bodem naar boven zijn de erytrocyten en granulocyten, de vorming van de pellet, de dichtheid gradiënt oplossing fase, een laag van PBMCs, en het verdunde plasma.Met een pipet, door de plasmafase zonder het te aspireren. Verzamel vervolgens de PBMC-laag in een nieuwe 50 milliliter centrifugatiebuis. Voeg tot 50 milliliter 1x PBS toe aan de PBMCs als wassetup en centrifuge gedurende 10 minuten bij 300 G.Aspirate de supernatant en schort de pellet opnieuw op in 40 milliliter macrofaagmedium.Nadat u de PBMC's in een Malassez-kamer hebt geplaatst, draagt u de hoeveelheid PBMCs die nodig is voor het uitvoeren van het experiment over naar een centrifugatiebuis. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 G.Aspirate de supernatant en schort de pellet opnieuw op in 80 microliter van de sorteerbuffer per 10 miljoen PBMCs. Voeg vervolgens 20 microliter cd14-microbeads per 10 miljoen PBMCs toe.Meng goed, en incubeer gedurende 15 minuten op 4 graden Celsius onder constante agitatie. Voeg na incubatie een milliliter sorteerbuffer per 10 miljoen PBMCs toe als wasstap en centrifuge als voorheen. Vervolgens, aspirate de supernatant en opnieuw opschorten de pellet in 500 microliters van sorteren buffer per 100 miljoen PBMCs.Plaats nu een kolom in het magnetisch veld van de scheidingsteken. Bereid de kolom door het spoelen met drie milliliter van sorteren buffer. Breng de celsuspensie aan op de kolom.Dan verzamelen van de stroom door met niet-gelabelde cellen voor latere kleuring, indien nodig. Was de kolom drie keer met drie milliliter sorteerbuffer. Zorg ervoor dat u uw kolom niet droogt.Plaats vervolgens een opvangbuis onder de kolom en verwijder deze uit de scheidingsteken. Na de was, pipet vijf milliliter van sorteren buffer in de kolom. Spoel onmiddellijk de magnetisch gelabelde cellen door de zuiger stevig in de kolom te duwen.Herhaal deze stappen ten slotte met een nieuwe kolom voordat u de monocyten platmeert en de macrofaagpolarisatie uitvoert zoals beschreven in het tekstprotocol. Onderhoud de monocyten en de macrofagen in een zuurstofgecontroleerde omgeving om hypoxische conditieanalyse uit te voeren. Gebruik een hypoxie werkstation om cellen te behouden onder de gewenste zuurstof gedeeltelijke druk tijdens het experiment.Bij het werken onder lage zuurstofdruk is het belangrijk om alle media- en wasbuffers onder het station voor te bereiden en voldoende te wachten om de juiste gedeeltelijke druk in de vloeistof te verkrijgen. Voer cellyse uit in een buffer onder een aangepaste kap. Laad het eiwitequivalent van 300.000 cellen voor elk monster op 4-12% bis-tris acrylamide gels.Controleer de duur van de elektroforetische migratie om elk eiwitmonster te laten splitsen in zes gelbanden, zoals hier wordt getoond. Na het bevestigen en bevlekken zoals beschreven in het tekstprotocol, verlamt u de eiwitbanden met een schone scalpel. Dobbelstenen elke uitgesneden band voor het plaatsen van hen in 500 microliter buizen.Nu, was de gel plakjes drie keer in 200 microliters van 25 millimolar ammonium bicarbonaat gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius, het weggooien van de ammonium bicarbonaat tussen elke stap. Volg dit met een wasbeurt in 25 millimolar ammonium bicarbonaat en acetonitril. Vervolgens dehydrateren de gel stukken met 200 microliters van 100%acetonitril gedurende 10 minuten.Incubeer elk gelstuk met 10 millimolar DTT en 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 45 minuten bij 56 graden Celsius. Gooi vervolgens de DTT weg en ontcubeer het gelstuk met 55 millimolar iodoacetamide in 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 35 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Om alkylering te stoppen, gooi de gebruikte oplossing weg en ontcubeer je elk gelstuk met 200 microliter van 10 millimolar DTT in 25 millimolar ammoniumbicarbonaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Was de gelstukken in 200 microliter van 25 millimolar ammoniumbicarbonaat. Vervolgens uitdrogen met 200 microliters van 100% acetonitril gedurende 10 minuten. Verteren de eiwitten 's nachts op 37 graden Celsius met Trypsin / Lys-C Mix volgens de instructies van de fabrikant.Haal de resulterende peptiden uit gelstukken door 50 microliters van 50% acetonitril gedurende 15 minuten toe te voegen in laagabsorptiebuizen. Voeg na 15 minuten 50 microliter van 5% mierenzuur toe, voeg 50 microliter van 100% acetonitril gedurende 15 minuten toe. Trek en droog elke fractie in laagabsorptiebuizen om de absorptie van peptiden en monsterverlies te beperken.Bewaar de monsters op 80 graden Celsius tot verdere analyse zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier is de representatieve zuiverheid beoordeeld door flow cytometrie na magnetische kraal selectie van CD14 positieve monocyten. Fase contrast beeldvorming van gedifferentieerde menselijke macrofagen tonen heterogeniteit van verkregen morfologieën voor twee verschillende polarisaties na negen dagen van cultuur.Een voorbeeld van een off-gel spijsvertering met behulp van zilver-gekleurde SDS pagina gels wordt getoond. Evaluatie van eiwit uit cellyse en na in-oplossing spijsvertering toont de afwezigheid van afbraak tijdens lyse en de efficiëntie van de spijsvertering. Hier is een voorbeeld van een botsing-geïnduceerde dissociatie spectrum van een peptide gevonden bij massa-lading verhouding van 597,29 op het MS-spectrum met een elektrische lading van positieve twee.Uit dit spectrum werd de overeenkomstige volgorde bepaald. Het uiteindelijke resultaat na analyse is een warmtekaart die de hiërarchische clustering van alle polarisatietoestanden vertegenwoordigt met differentiaal uitgedrukte eiwitten. Analyse onthult een cluster van eiwitten over-uitgedrukt in alle polarisaties in de 3%zuurstof conditie.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat je eerst moet beslissen wat voor soort fractionering u zal uitvoeren op nieuwe monsters om uw protocol dienovereenkomstig aan te passen. De proteomische benadering met behulp van dit werk is een aanvulling op genomische benaderingen die de afgelopen jaren zijn gebruikt op het gebied van de macrofaagbiologie polarisatiestudies. Na de ontwikkeling maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunologie om de verschillende staten van activering van immuuncellen bij mensen en ook bij andere zoogdieren te verkennen.Vergeet niet dat het werken met DTT gevaarlijk kan zijn, dus je moet werken onder een aangepaste motorkap om deze procedure te doen.

proteomic-analysis-human-macrophage-polarization-under-low-oxygen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk...

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Macrofagen zijn de belangrijkste cellen die betrokken zijn bij de pathogeniteit van de gastheer. Macrofagen vertonen fenotypische en functionele diversiteit die kan worden geanalyseerd en gedetecteerd door middel van proteomische analyse. Dit artikel beschrijft hoe je 2D-elektroforese uitvoert van primaire culturen van humane macrofagen die zijn gedifferentieerd in M1- of M2-fenotype.

Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese

Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Dit protocol biedt een methode om Mycobacterium tuberculosis infectie in menselijke M1- of M2-gepolariseerde macrofagen te bestuderen op basis van differentiatie van perifere bloed-monocyten naar macrofaag-achtige cellen die zijn geïnfecteerd met de GFP-gelabelde virulente stam H37Rv, en geanalyseerd met flowcytometrie met behulp van een 10-kleurenpaneel inclusief expressie van geselecteerde M1/M2 markers.

Polarisatie van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide cellen en analyse met flowcytometrie bij mycobacterium tuberculosis-infectie

M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) zijn geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol dient als een gedetailleerde gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen reproduceerbaar te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Dit model is de basis om de ontstekingsremmende effecten van TAM in de tumormicro-omgeving te onderzoeken.

Macrofaagdifferentiatie en polarisatie in een M2-achtig fenotype met behulp van een menselijke monocytachtige THP-1 leukemie cellijn

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van het immunomodulerende potentieel van implantaatoppervlakken in vitro, met als doel de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de huidige protocollen te verbeteren en verder onderzoek te bevorderen. Secretoire cytokineprofielen, mRNA-expressie en markers op het celoppervlak werden gecontroleerd met behulp van van bloedmonocyten afgeleide macrofagen om macrofaagpolarisatie te onderzoeken die op titanium werd gekweekt.

Polarisatie en karakterisering van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide macrofagen op implantaatoppervlakken 

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Leer een proteoomanalyseprotocol voor menselijke macrofagen onder hypoxische omstandigheden met label-free kwantificatie. Deze methode karakteriseert activeringstoestanden op eiwitniveau voor immunologisch onderzoek.

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Meer video's verkennen