Kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen als een standaard voor het valideren van de immunofluorescentietest voor het kwantificeren van Biomarker eiwitten in Routine weefselsteekproeven

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van kankerpathologie, door biomarkereiwitten te kwantificeren uit routinematig verwerkt biopsiemateriaal. De belangrijkste voordelen van deze techniek in relatie tot conventionele immunohistochemie, zijn dat het objectief is, een breed dynamisch bereik heeft en het mogelijk maakt voor de kwantificering van eiwitten in specifieke celtypen. De aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde zogenaamde biomarkereiwitten, of meer in het bijzonder, de relatieve overvloed van die eiwitten in kankerbiopsiemonsters kan zeer nuttig zijn bij het maken van een specifieke pathologische diagnose van specifieke soorten kanker.

Maar het kan ook nuttig zijn bij het voorspellen van de respons op kankerbehandelingen, dus daarom is deze techniek relevant voor zowel de diagnose als de behandeling van patiënten met kanker. Dit protocol gaat vooral over het gebruik van eiwitkwantificering in vereeuwigde cellijnen om de kwantitatieve aard van immunofluorescentie gebaseerde test te valideren. Maar het is belangrijk op te merken dat immunofluorescentie gemakkelijk kan worden opgenomen in een multiplexed benadering, en toegepast op primaire biopsie monsters.

Het assisteren en demonstreren van deze procedure zal Lee Boudreau, een technicus, en Shakeel Virk, de directeur van de operaties. Beide van het Queen's Laboratory for Molecular Pathology. Om te beginnen, centrifugeren de eerder geoogste cellen in een 50 milliliter conische buis op 225 Gs gedurende vijf minuten.

Decanteer de supernatant, en resuspend de cel pellet in 10 milliliter PBS. Dan, centrifuge de geresuspended cellen op 225 Gs gedurende vijf minuten. Hang de celpellet op met 10 milliliter van 10%NBF.

Dan incubeer de cellen bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar op 24 RPMs 's nachts. Na het bevestigen van de cellen, centrifugeren de cellen op 225 Gs gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de supernatant en resuspend de cellen in 500 microliter van PBS.

Breng de cellen naar een 1,5 milliliter microcentrifuge buis, en pellet de cellen via centrifugatie. Dan, aspirate de supernatant. Voeg ongeveer 500 microliters van 1% agarose oplossing aan elke buis met cellen.

Vervolgens pipet het mengsel op en neer te mengen. Nadat de agarose celoplossing verhardt, voeg een milliliter van 10% NBF toe aan de buizen. Verwijder later het NBF uit de monsters.

Gebruik een scheermesje om de celstekker te verwijderen en plaats de stekker in een plastic weefselcassette. Verwerk monsters 's nachts met een geautomatiseerde weefselprocessor. Vervolgens, insluiten van de monsters in paraffine was, met behulp van standaard histologie methoden.

Met behulp van een tissue arrayer instrument, oogst dubbele 6 millimeter kernen uit het paraffine blok, en steek ze in een lege paraffine blok. Gebruik hierna een microtome om twee histologische delen van de nieuw gecreëerde cellijn, TMA, voor te bereiden. Monteer vervolgens de secties op een histologieplaat en deparaffinize ze.

Laad eerst de twee dia's van de cellijn TMA in een geautomatiseerd kleursysteem. Vlek de ene kant met de optimale primaire antilichaamverdunning, waardoor de andere als een negatieve controle schuif. Breng op beide dia's een kernantistain en secundair antilichaam aan.

Voeg na het kleuringsproces de tyramide signaalversterkingsreagentia toe. Scan hierna de immunovlekken met behulp van de juiste excitatie- en detectiegolflengten voor de fluorofoforen die werden gebruikt. Gebruik beeldanalysesoftware om het cellulaire compartiment van belang te identificeren, of het nu kern of cytoplasma is, en kwantificeer de gemiddelde fluorescentieintensiteit, of MFI, voor elke regel.

Om te bepalen welke cellijn de grootste overvloed van het doeleiwit heeft, aliquot kostbaar voorbereid cel lysate in microcentrifuge buizen. Voeg vervolgens 2,5 microliter 6x laemly buffer, en genoeg RIPA lysis buffer om het totale volume te brengen tot 15 microliter. Laad vervolgens een SDS-paginagel, met een eiwitladder en de eerder bereide monsters.

Laad hierna laemly buffer in de lege putten. Voer de gel tot de blauwe kleurstof de onderkant van de plaat bereikt. Na het uitvoeren van een semi-droge eiwitoverdracht, gebruik een scheermesje om het membraan horizontaal te snijden om het eiwit van belang van het controle-eiwit te scheiden.

Uitvoeren van blokkeren en antilichaam incubaties volgens de instructies van de fabrikant. Plaats vervolgens de membraanstroken in een doorzichtige plastic zak. Gebruik een P1000 pipet om de membranen te bedekken met ECL mengsel.

Sluit vervolgens de zak af en ontcubeer de membranen bij kamertemperatuur in het donker gedurende één tot twee minuten. Plaats vervolgens de plastic zak met de membranen in een digitaal beeldverwerkingsplatform. Gebruik chemiluminescentie en colorimetrische markerdetectie om verschillende belichtingen van het membraan vast te leggen.

Met behulp van beeldanalysesoftware, of visuele observatie, bepalen welke cellijn het meest doeleiwit uitdrukt. Na het immunoblotting van een seriële verdunning van deze cellijn, open de belichtingsbeelden met behulp van beeldanalysesoftware. Gebruik het gereedschap Rechthoekige selecties om de eerste rijstrook van de gel te selecteren.

Ga dan naar analyseren, gels, en selecteer eerste rijstrook. Herhaal dit proces door het gereedschap Rechthoekige selecties naar de volgende rijstrook te verplaatsen en volgende rijstrook te analyseren, te gelen en te selecteren. Ga vervolgens naar analyseren, gels, en plot rijstroken.

Gebruik het gereedschap rechte lijn om lijnen te tekenen over de basissen van elke piek, om het achtergrondgeluid te verwijderen. Gebruik vervolgens het toverstokgereedschap om elke piek te selecteren en de bandintensiteit van elke piek uit het resultatenvenster te verkrijgen. Maak een scatterplot van bandintensiteit ten opzichte van de hoeveelheid totale eiwit geladen voor elk primair antilichaam met behulp van de densitometrie output.

Gebruik vervolgens een lijn van de beste pasvorm en visuele observatie om de locatie van het lineaire dynamische bereik van elk antilichaam te bepalen. Selecteer een eiwitconcentratie die een bandintensiteit binnen het lineaire bereik oplevert en voer een immunoblot uit van alle cellijn lysates met die eiwitconcentratie, zoals eerder aangetoond. Voer vervolgens densitometrie uit op de digitale scans en selecteer belichtingen die signalen opleveren binnen de eerder geïdentificeerde lineaire bereiken voor elk antilichaam.

Bereken hierna de verhouding tussen de intensiteit van de doeleiwitband en de intensiteit van de laadcontroleband voor elke cellijn. Ten slotte gebruikt u statistische software om een Pearson-correlatietest uit te voeren tussen de waarden die zijn verkregen uit beeldanalyse van de IF-kleuring en die welke zijn verkregen uit immunoblotting. Dit protocol werd gebruikt om het vermogen van IF te bevestigen om de relatieve hoeveelheid van het anti-apoptotische eiwit Bcl-2 te bepalen.

Wisselende verdunningen van het primaire antilichaam werden getest op menselijk tonsillenweefsel met een immunohistologie vlek. Voor dit experiment werd een een tot 50 verdunning bepaald als de optimale verdunning die een sterk signaal met weinig achtergrondgeluid opleverde. Deze verdunning werd gebruikt om de cellijn TMA te bevlekken door immunofluorescentie, en beeldanalyse werd gebruikt om het cytoplasmatische Cy5 signaal toegeschreven aan Bcl-2 te kwantificeren.

Op basis van de immunoblot voor alle geteste cellijnen had Granta-519 de grootste overvloed aan Bcl-2. Een immunoblot van de seriële verdunning van Granta-519 lysaat werd vervolgens gebruikt om het lineaire dynamische bereik van Bcl-2 te vinden en eiwit GAPDH te controleren. Het dynamisch bereik voor Bcl-2 in deze test varieerde van een bandintensiteit van bijna 0 tot 7500 eenheden.

Het dynamisch bereik voor GAPDH varieerde van 3000 tot 6500 eenheden. De immunoblot werd herhaald met blootstellingen binnen dat lineaire bereik. En de verhouding van Bcl-2 tot GAPDH werd berekend voor elke cellijn.

Een Pearson correlatietest toonde aan dat de intensiteitsverhoudingen van immunoblotting sterk en positief gecorreleerd waren met de intensiteitsmetingen van kwantitatieve IF. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om het laatste membraan bloot voor meerdere tijdstippen, Om de optimale belichting te vinden waar alle banden zich binnen hun respectieve lineaire bereiken bevinden. Na het valideren van de kwantitatieve aard van het IF-protocol, kan het worden aangepast voor multiplex IF, in routinematig verwerkte weefselmonsters om klinische vragen te beantwoorden, zoals waar een doeleiwit wordt uitgedrukt.