Visualiseren cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van plantenontwikkeling met betrekking tot de verdeling van de groei regulerende fytohormonen. Door gebruik te maken van genetisch gecodeerde FRET biosensoren, bijvoorbeeld nlsGPS1 die gibberellins detecteert, is het mogelijk om de dynamische verdeling van belangrijke verbindingen in Arabidopsis weefsels te meten op de cellulaire oplossing. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze zaak het moeilijk hebben, omdat het analyseren van FRET-biosensoren ratiometrische beeldvorming omvat, waardoor ruis en extra analytische stappen zijn toegenomen in vergelijking met intentiemetrische beeldvorming.

Begin met het zaaien van ongeveer 20 gesteriliseerde Arabidopsis zaden op 1/2 Murashige en Skoog of MS agar vierkante platen. Verzegel de platen met porie chirurgische tape en wikkel ze met aluminiumfolie voor een tot drie dagen van incubatie op vier graden Celsius voor stratificatie. Voor wortelbeeldvorming breng je de platen drie dagen in verticale oriëntatie naar een groeikamer onder de aangegeven omstandigheden.

Voor donker geteelde Hypocotyl, breng de platen naar de groeikamer voor een lichtpuls van één tot vier uur om de kieming te synchroniseren. Wikkel vervolgens de platen met aluminiumfolie en plaats ze drie dagen in de groeikamer in een verticale oriëntatie. Voor steady state metingen, voeg 50 microliters van mock oplossing aan een schone microscoop dia en voorzichtig plaats drie nucleaire gelokaliseerde gibberellin perceptie sensor een of nlsGPS1 uitdrukken zaailingen op de dia.

Dan ter plaatse een druppel een vacuüm vet op elke hoek van een schone deksel slip en voorzichtig plaats te dekken slip over de zaailingen. Voorzichtig toevoegen van extra mock oplossing om eventuele luchtbellen te verwijderen indien nodig. Gebruik voor de behandeling van gibberellin vier of GA4 een spuit van 20 milliliter gevuld met vacuümvet en uitgerust met een aangepaste pipettip van 200 microliter met een opening met een diameter van één millimeter om een gelijkmatig gelaagde rechthoek van drie en een halve centimeter te trekken op een schone glazen schuif.

Voeg 50 microliters van mock oplossing toe aan het midden van de rechthoek en gebruik schone tangen om nlsGPS1 te tillen die zaailingen door de onderkant van hun cotyledons uitdrukken voor zorgvuldige overdracht in de mock-oplossing. Plaats een afdekbrief gespot met vacuüm vet zoals net aangetoond in het midden van het vacuüm vet rechthoek en zorgvuldig vul het reservoir met extra mock oplossing zonder verstoring van de zaailingen. Dan verwerven beelden van de zaailingen op een confocale microscoop uitgerust met de juiste lasers voor spannende CFP en YFP om Forster resonantie energie overdracht imaging uit te voeren.

Voor GA4 voor behandeling, verwijder de dia van de microscoop stadium en stel een timer voor 20 minuten. Verwijder onmiddellijk de mock-oplossing van de rechterkant van de afdekslip terwijl u 17 microliters van een kwart MS-vloeistof toevoegt, aangevuld met één micro-molaire GA4 aan de linkerkant van de afdekslip totdat alle nepoplossing is vervangen. Plaats vervolgens de glazen schuif terug op de microscoop fase en wacht nog eens 10 minuten voor het verwerven van de na GA4 behandeling beeld.

Om een tijdscursus voor een interessant weefsel op te zetten, voeg je 200 microliters mock-oplossing toe aan het midden van het perfusiekanaal van een ibidi-sticky-slide en plaats je nlsGPS1-zaailingen voorzichtig in de schijnoplossing zoals aangetoond. Gebruik tangen om voorzichtig een afdekking slip over de zaailingen met behulp van de achterkant van de tangen om zachtjes te drukken op de buitenste randen van de cover slip totdat het vormt een sterke band met de kleverige materiaal op de periferie van de kleverige-slide. Gebruik vervolgens twee 0,8 millimeter binnendiameter elleboog Luer connectoren en 0,8 millimeter binnendiameter stuk siliconen buizen om de kleverige schuif te verbinden met een 20 millimeter spuit gevuld met mock oplossing en om de dia aan te sluiten op een uitlaat container voor het verzamelen van de uitstroom oplossing.

Druk de zuiger voorzichtig in om voldoende oplossing aan de kamer af te geven om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen zijn en laad de spuit vervolgens op een programmeerbare spuitpomp. Start dan de pomp om de tijdcursus te starten. Voor GA4-behandelingen tijdens de tijdscursus, pauzeer de pomp om de perfusie te stoppen en vervang de mock buffer met spuit door een spuit gevuld met een kwart MS vloeistof aangevuld met GA4.

Voor 3D-beeldanalyse importeert u de bestanden in het IMARIS-softwareprogramma voor beeldanalyse en opent u de wizard Oppervlakken. Stel de achtergrondaftrekking in op drie micron en de drempelwaarde op standaard. Tijdens de segmentatie van de kernen zorg ervoor dat de vele kernen met een schemerige fluorescentie niet worden opgenomen, omdat het signaal-ruisrantsoen van het object met bijna achtergrondniveaus van het signaal te laag zal zijn voor ratiometrische beeldanalyse.

Mask maskeert vervolgens de GVB- en FRET-emissiekanalen op basis van de oppervlakken die zijn gemaakt met behulp van de YFP-emissie. Gebruik de XT gemiddelde intensiteitsverhoudingsextensie om een verhouding van donorexcitatie acceptor emissie te berekenen gedeeld door de donor excitatiedonormissie tussen de gemiddelde intensiteitswaarden van de afzonderlijke oppervlakken in de twee kanalen. Als u de afzonderlijke oppervlakken wilt kleuren met de nlsGPS1-emissieverhouding, selecteert u kleurcodering met statistieken en stelt u de gemiddelde intensiteitsverhouding in als het type statistieken.

Exporteer onder het pictogram statistieken de verhoudingen van afzonderlijke waarden uit de tabel en kopieer en plak de waarden in een spreadsheet voor grafische weergave van de gegevens. In de Arabidopsis wortel is de nlsGPS1 emissieratio gradiënt indicatief voor lage GA4 niveaus in de meristematic en divisie zones en hoge GA niveaus in de late verlenging zone. Daarentegen wordt een emissieverhoudinggradiënt niet waargenomen in niet-responsieve wortels van NLSGPS1, wat suggereert dat de endogene GA4-gradiënt geen artefact is.

Een nlsGPS1-emissiegraad gradiënt wordt ook gevormd in donker geteelde hypocotylen met lage niveaus in de cotyledons en de typische haak en hoge niveaus in het snel langwerpige basale gebied van de hypocotyl. Daarentegen wordt een emissiegraadgradiënt niet waargenomen in de niet-responsieve hypocotyls van nlsGPS1. Bovendien accumuleert exogeen geleverde GA4 zich bij voorkeur in de rekzone in vergelijking met de delingszone van de Arabidopsiswortel, wat aangeeft dat nlsGPS1 kan worden gebruikt om endogene en exogene GA-patronen te bestuderen.

Bovendien, tijd cursus analyse van GA4 behandeld nlsGPS1 zaailingen, blijkt een snellere accumulatie van exogene GA4 in de wortel rek zo in vergelijking met de divisie zone. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om verzadigde pixels te vermijden tijdens de kwantitatieve beeldvorming om de beeldvormingsparameters constant te houden en om de drift- en brandpuntsproblemen tijdens de monsterperfusie te minimaliseren. Volgens deze procedure uitgewerkte methoden, zoals imaging wortels groeien in root chip type controle profusie apparaten kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe GA gradiënten veranderen in Arabidopsis wortel tips groeien in verschillende snelheden of in reactie op stress Na de ontwikkeling, deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoek op het gebied van plantengroei om de dynamische verdeling van de gibberellins in extra Arabidopsis thaliana weefsels en organen te verkennen.