Name: Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Leer de Trojan Horse-methode voor in situ levering van eiwitten in maïsweefsels met Ustilago maydis. Deze aanpak vereenvoudigt onderzoek naar geheime eiwitten en plant-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella en Armin Hildebrand voor het verstrekken van lab ruimte en plant materiaal. Het originele werk op het paard van Troje-methode werd gesteund door een Leopoldina postdoc fellowship en NSF project IOS13-39229. Het werk gepresenteerd in dit artikel werd gesteund door SFB924 (projecten A14 en B14) van de DFG.

1. bouw een U. maydis paard van Troje
Opmerking: Zie Figuur 1.
<ol><li>Het versterken van een gen van belang van maïs cDNA met behulp van gen-specifieke primers en een corrigeren polymerase van DNA. Kloon van het primaire product van PCR en transformeren van de constructie in E. coli instructies van de leverancier van de plasmide. Controleer of het juiste gen van belang opeenvolging van Sanger sequencing prior te gebruiken voor de volgende klonen stappen. Opmerking: PCR specificaties dienen te worden geoptimaliseerd door primer reeks specifieke kenmerken en optimale polymerase van DNA reactie omstandigheden.</li>
	<li>Inleidingen tot de maïs gen van belang te versterken zonder de volgorde codering een signaal peptide (SP) te ontwerpen.</li>
	<li>Uitbreiden van het 5´-einde van de omgekeerde primer met het motief van de RSIATA en een Ncoik snijden site (tabel 1).</li>
	<li>Versterken de maïs gen van belang met een corrigeren polymerase van DNA, met behulp van de PCR-construct gegenereerd in 1.1 als de PCR-sjabloon.</li>
	<li>Dubbel-digest het PCR product en de U. maydis transformatie plasmide, p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, met Xbaik en Nco I. zuiveren het verteerd PCR product en de plasmide.</li>
	<li>Afbinden het verteerd PCR-product naar de p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha sjabloon met behulp van T4 DNA ligase volgens de instructies van de manufacturer´s. De afbinding product transformeren in E. coli en controleer of het juiste gen van belang volgorde door Sanger sequencing.</li>
	<li>De p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgen van belang-mCherry-Ha met het beperkingsenzym SspLinearize ik en transformatie DNA in het solopathogenic U. maydis stam SG20016. Isoleren van U. maydis transformants door carboxin te selecteren en bevestig geïsoleerde transformants door Southern blot analyse16. Opmerking: Voor elk eiwit van belang, ten minste drie onafhankelijke U. maydis transformants moeten worden geïsoleerd en geanalyseerd om te schatten van eventuele fenotype effecten van willekeurige achtergrond mutaties.</li>
</ol>2. kweekmedia
<ol><li>YEPSlight vloeibare middellange16bereiden: 1,0% (m/v) gistextract, 0,4% (m/v) Bacto-pepton, en 0,4% (m/v) sacharose. Los van alle componenten in ddH2O en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.</li>
	<li>Aardappel-dextrose-agar (PD-agar)20bereiden: 3,9% (m/v) aardappel dextrose agar en 1,0% (m/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (FC 0,01 M). Meng alle onderdelen direct in de fles voor de autoclaaf en voeg ddH2O plus een magnetische roer bar. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.</li>
	<li>Bereiden van PD-houtskool agar20: 3,9% (m/v) aardappel dextrose agar, 1% (m/v) houtskool en 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (FC 0,01 M). Meng alle onderdelen direct in de fles voor de autoclaaf en voeg ddH2O plus een magnetische roer bar. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.</li>
</ol>3. plant infectie
<ol><li>Analyses van maïs celdeling uit te voeren in antwoord op een Trojaans paard geleverd eiwit (bijvoorbeeld microscopie gebaseerde cel tellen) vooraf. U. maydis -geïnduceerde maïs celproliferatie en latere tumor vorming begint rond 4-5 dagen post infectie. Kwantitatieve ziekte evaluaties zijn afhankelijk van weefsel en van 6 tot 14 dagen bericht infectie moeten worden uitgevoerd. Opmerking: Verschillende maïs cultivars tonen verschillende niveaus van gevoeligheid voor U. maydis infectie. Maïs cvs. W23, A188, Gaspe flint, vroege gouden Bantam of Va35 Toon gevoeligheid naar deze pathogenen en zijn dus geschikt cultivars voor paard van Troje studies.</li>
	<li>Bereiding van het entmateriaal U. maydis
	<ol>
<li>Omvatten de voorlopercellen stam SG200 als een negatieve controle in alle Trojaans paard experimenten om te kunnen inschatten van bijwerkingen op de infectie door de transgene stam. Hier, gebruik een U. maydis stam uiting geven aan een niet-afgescheiden versie van de proteïne van belang als een negatieve controle. Om redenen in verband met uitvoerbaarheid (bijvoorbeeld grotere vertoningen), kan de voorvader stam evenwel de gemakkelijker keuze van controle.</li>
		<li>Voordat u het experiment start, schatten welke bedragen van infectie cultuur nodig zijn. Houd in gedachten dat besmetting van elke plant 1 tot 1,5 mL van U. maydis schorsing vereist afhankelijk van de maïs weefseltype. Opmerking: Ongeveer 1 mL van een overnachting cultuur is voldoende voor verdunning een OD600 van 0,2 in 20 mL van YEPSlicht medium, en 25 mL van een cultuur van U. maydis met een OD-600 voor 0.8-1.0 volstaan voor infectie van 13-16 planten.</li>
		<li>Kras U. maydis van een PD-agar plaat met behulp van een steriele Pipet van Pasteur, enten in 5 mL YEPSlicht voedingsbodem en laat de cultuur groeien bij 28 ° C met constante schudden bij 200 t/min voor 16 h.</li>
		<li>Voorafgaand aan de infectie, onderzoeken de U. maydis inoculatie cultuur door standaard de lichte microscopie van voor de juiste groei en bacteriële besmetting bij 400 X vergroting. Opmerking: In een geschikte cultuur is alleen de sigaar-vormige schimmel zichtbaar (Figuur 2).</li>
		<li>Meng 900 µL van verse YEPSlicht met 100 µL van de overnachting cultuur en meten van de OD600 YEPSlicht medium als een leeg in de analyse van de spectrofotometer gebruiken.</li>
		<li>Verdun de overnachting cultuur met verse YEPSlicht medium op een OD600 van 0,2 en laat de cultuur groeien bij 28 ° C met constante schudden bij 200 t/min, totdat het bereiken van de mid log groeifase door een OD aangegeven600 nm voor 0.8-1.0. Opmerking: U. maydis cellen dupliceren elke 2 h onder deze omstandigheden, dus de gewenste OD600 wordt bereikt na 4-5 uur van de teelt.</li>
		<li>Oogst van de cellen bij OD600 van 0.8-1.0 door spinnen bij 3000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Wassen van de cel pellet één keer met ddH2O. Voor dit doel, voeg cultuur volumedeel ddH2O, spin met 3000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel zorgvuldig in ddH2O met behulp van een 20-mL glazen pipet, waardoor aanpassing van de definitieve OD600 naar 3.0 (voor een paard van Troje-assay) of 1.0 (voor ziekte rating).</li>
	</ol></li>
	<li>Verificatie van het Trojaanse paard: in planta secretie van de maïs fusieproteïne
	<ol>
<li>Maïs zaailingen met een paard van Troje stam17infecteren.</li>
		<li>Microscopische beeldvorming van besmette zaailingen op 2-3 dagen post-infectie met behulp van een confocale laser scanning microscoop uitvoeren Te dien einde een rechthoekig stuk van het blad 1 cm onder het punt van injectie accijnzen, leg het monster op een microscoopglaasje en voeg een druppel ddH2O. Om te visualiseren mCherry fusieproteïne, prikkelen specimens op λ = 561 nm en record emissie bij λ = 580-630 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Infectie van volwassen maïs bladeren
	<ol>
<li>Maïs planten naar het werkgebied van volwassen bladeren cultiveren (wanneer ten minste blad 7 groeit in de stengel). Opmerking: Dit stadium wordt bereikt na vier weken na het zaaien van 14 h, 28 ° C dag/10 h, 22 ° C nacht ritme met cv. W23 voorwaarden broeikasgassen. Duur kan variëren met de maïs cultivar en broeikasgassen voorwaarden.</li>
		<li>Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3-mL spuit met een 20G x 1 hypodermische naald.</li>
		<li>Druk op de stengel zorgvuldig te lokaliseren het meristeem weefsel in de stengel. De basis van het meristeem kan worden onderscheiden door een overgang van moeilijker stengel naar zachtere weefsel.</li>
		<li>Markeer het meristeem op de stengel met behulp van een pen.</li>
		<li>Injecteren van 1,5 mL van U. maydis cultuur 1 cm boven de shoot meristeem of bloeiwijze meristeem.</li>
		<li>Stem op symptomen van de ziekte bij 6 en 12 dagen post infectie.</li>
	</ol></li>
	<li>Infectie van kwasten
	<ol>
<li>Maïs planten groeien tot het bereiken van de fase van de kwast. Opmerking: Een gedetailleerde tijdlijn ontwikkelingssamenwerking helmknop en kwast in maïs cv. W23 was eerder beschreven1819. Kwastjes met vooraf Meiotische helmknoppen zijn zeer gevoelig voor U. maydis infectie; in de maïs cv. W23 zijn kwasten de grootte van 4-7 cm.</li>
		<li>Druk op de stengel zorgvuldig te lokaliseren van de kwast in de stengel.</li>
		<li>Mark de tip en de boekwaarde van de kwast op de stengel met behulp van een pen.</li>
		<li>Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3-mL spuit met een 20G x 1 hypodermische naald.</li>
		<li>Injecteren van 1,5 mL van het entmateriaal rond de kwast. Gelijke verdeling van het entmateriaal, langzaam uitgevoerd 0,5 mL elke bij het uiteinde, het middengedeelte, en de basis van de kwast gemarkeerd met de pen.</li>
		<li>10 dagen post infectie die de ziekte symptomen snelheid.</li>
	</ol></li>
	<li>Infectie van oren Opmerking: de oor weefsel ontwikkeling verschilt in verschillende maïs cultivars en broeikasgassen voorwaarden en voorafgaand aan de enting moet worden geobserveerd. Oren beginnen te ontgroeien zijde zijn zeer gevoelig voor U. maydis infectie.<ol>
<li>Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3 mL spuit met een 20 G x 1 hypodermische naald.</li>
		<li>Injecteren de inoculatie naald in de ruimte tussen de bladeren van de schil zo diep mogelijk zonder verwonden van het oor.</li>
		<li>Versie 1.5 mL van het entmateriaal rond het oor.</li>
		<li>Verwijder de injectiespuit plus naald en zorgvuldig massage de kolf om de oplossing voor U. maydis gelijkmatig moeten verdelen.</li>
		<li>14 dagen bericht infectie die de ziekte symptomen snelheid.</li>
	</ol></li>
	<li>Bevestigen van de levensvatbaarheid van U. maydis entmateriaal
	<ol>
<li>10 µL van het entmateriaal op een PD houtskool agarplaat neerzet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen. Opmerking: Als de respectieve U. maydis cultuur vermag formulier filamenten, pluizige, witte mycelium wordt zichtbaar (Figuur 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+tumour%3A+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+a+maize+plant%3A+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep1%2C+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.%2C+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290(2009).</li>
<li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li>
<li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355(2014).</li>
<li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177(2013).</li>
<li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li>
<li>Juárez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut+%28%27Huitlacoche%27%29+as+a+new+platform+for+oral+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535(2015).</li>
<li>Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarkari%2C+P+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).</li>
<li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+%28Zea+mays%29+anther+cell+behavior+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li>
<li>Bösch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522(2016).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li>
<li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li>
<li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Maydica%22%5BJournal%5D)">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34(2015).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Bacteria%2C+Bacteriophages%2C+and+Fungi%3A+Volume+1%22">Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1</a>. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).</li>
<li>Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li>
<li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li>
<li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Moderne gewas onderzoek eist protocollen voor moleculaire analyse van genetische en eiwitniveaus. Genetische toegankelijkheid via transformatie is niet beschikbaar of inefficiënte en tijdrovende voor de meeste soorten van gewassen zoals maïs. Bovendien zijn betrouwbare genetische hulpmiddelen zoals promotor verslaggever systemen schaars is, waardoor het moeilijk is om te studeren in situ eiwitfunctie met hoge Spatio resolutie op verschillende weefsel sites. Die apoplastisch eiwitten kunnen worden bestudeerd door...

De biotrophic pathogen Ustilago maydis is de verwekker van de maïs smut ziekte1. Het infecteert alle luchtfoto delen van maïs resulterend in grote tumoren die melanized, zwarte sporen bevatten. Op mondiaal niveau, wordt U. maydis geraamd op een jaarlijks verlies van ongeveer 2% van de opbrengst van maïs, veroorzaken terwijl tumoren worden gewaardeerd als een gastronomische delicatesse in Mexico. Infectie van de plant wordt geïnitieerd door een appressorium die scheidt van de celwand lysing enzymen te dringen de eerste laag van maïs epidermale cellen. Van een primaire infectie site, U. maydis groeit intracellulair en intercellularly, invasie van één tot twee cel lagen elke dag1,2. Succesvolle infectie resultaten in hypertrofie van de plant dat in zichtbaar tumoren op vijf dagen verandert post infectie1,3,4. Tijdens alle stadia van de infectie invaginate schimmeldraden van de schimmel de plant cytoplasma membraan zonder ieder rechtstreeks contact naar de host cytoplasma1,2. De strakke apoplasmic ruimte tussen de infecteren schimmeldraden en de plant plasmamembraan wordt beschouwd als de host/pathogen interactieve site, genaamd de biotrophic interactie zone. Om te overwinnen van het aangeboren immuunsysteem van de plant, scheidt U. maydis een array van effector eiwitten in de biotrophic interactie zone1. Sommige effectoren worden overgenomen door plantencellen, terwijl anderen in de biotrophic interactie zone5,6,7,8 blijven. Één die apoplastisch effector is UmPit2, die samenwerkt met die apoplastisch maïs proteasen het vrijkomen van de signalering peptide ZmZIP1 van ZmPROZIP door die apoplastisch protease activiteit9,10te voorkomen.
In de afgelopen decennia, U. maydis werd niet alleen een model voor schimmel genetica in plant-pathogen interactions, maar ook een waardevol hulpmiddel in de biotechnologie als gevolg van een goed begrepen life cycle, genetische bereikbaarheid en heterologe uitdrukking van uitgescheiden eiwitten11,12,13. Signalen voor de secretie van zowel conventionele en onconventionele eiwit zijn vastgesteld waarmee de posttranslationele modificaties14. Onlangs, U. maydis was werkzaam als een paard van Troje hulpmiddel om te studeren klein, maïseiwitten in situ15uitgescheiden. Het paard van Troje aanpak werd met succes gebruikt voor het analyseren van de functie van de kleine, secreted eiwit ZmMAC1 dat is betrokken bij helmknop ontwikkeling. ZmMAC1 induceert de periclinal verdeling van pluripotente cellen en cel lot specificatie van de nieuw gevormde cellen15. Op dezelfde wijze, werd de biologische functie van de maïs schade-geassocieerde peptide ZmZIP1 geopenbaard. U. maydis afscheidende de maïs die zmzip1 resulteerde in verminderde tumor vorming10. Dus, het paard van Troje aanpak vormt een waardevolle alternatieve route naar eiwit in situ studies met hoge Spatio resolutie dat noch doet vereisen generatie van stabiele maïs transformatie lijnen noch weefsel infiltratie met geïnfecteerd uitgedrukt en de zuivere eiwitten. In het bijzonder, maakt het paard van Troje-strategie de secretie van een heteroloog eiwit in de maïs apoplast en directe vergelijking van besmette versus niet-besmette plantencellen binnen de dezelfde weefsel.
Dit protocol illustreert de belangrijke stappen voor het genereren van een soort paard van Troje U. maydis om een proteïne van belang bestuderen. Verder bevat precieze informatie over infectie procedures van drie verschillende maïs weefseltypes (HLA) (volwassen bladeren, kwastjes en oren) met U. maydis, dat is een voorwaarde voor het bestuderen van de spatio infectie progressie en eiwit-functie in deze onderzoeken weefsels. Geen bijkomende specificaties zijn bepaald op maïs gene versterking en microscopische beeldvormende technieken, aangezien deze stappen doelgroepen gerichte en instrument-afhankelijk zijn. Dus, dit protocol is bedoeld voor ervaren gebruikers van standaard moleculaire biologietechnieken.

<table><tbody><tr><td>2 mL-spuit&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 hypodermische naald</td><td>B. Braun</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>cDNA van maïs</td><td></td><td></td><td>van maïsweefsel dat het gen van belang tot expressie brengt</td></tr><tr><td>Aktieve kool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laserscanningmicroscoop</td><td></td><td></td><td>gebruik lokaal beschikbare apparatuur</td></tr><tr><td>Cuvet (10 mm x 4 mm x 45 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>Incubator-schudder ingesteld op 28 &deg;C, 200 rpm</td><td></td><td></td><td>gebruik lokaal beschikbare apparatuur</td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop met 400-voudige vergroting</td><td></td><td></td><td>gebruik lokaal beschikbare apparatuur</td></tr><tr><td>Nco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>neem contact op met de corresponderende auteur&nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur-pipet (glas, lange punt)</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td><td>kan worden uitgewisseld voor andere basis-kloneringsvectoren zoals pENTR of pJET</td></tr><tr><td>Aardappeldextrose-agar&nbsp;</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie-pen</td><td></td><td></td><td>gebruik lokaal beschikbare apparatuur</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td></td><td></td><td>gebruik lokaal beschikbare apparatuur</td></tr><tr><td>Ssp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Xba I</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van ustilago maydis als een paard van troje voor in situ levering van maïs eiwitten

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Geïnspireerd door Homer´s Trojan paard mythe, we ontworpen de maïs pathogen Ustilago maydis secreted eiwitten om in te leveren de maïs apoplast toelaat in vivo fenotypische analyse. Deze methode niet afhankelijk is van maïs transformatie maar exploiteert microbiële genetica en secretoire mogelijkheden van ziekteverwekkers. Hierin staat het inspectie van in vivo geleverd secreted eiwitten met een hoge Spatio resolutie op verschillende soorten infectie sites en weefsels. De strategie van het paard van Troje kan worden gebruikt om de Transient aanvulling op maïs verlies-van-functie fenotypen, functioneel karakteriseren eiwit domeinen, af-target eiwit effecten te analyseren, of om te studeren van onside eiwit overdosering, waardoor het een krachtig hulpmiddel voor eiwit studies in het systeem van maïs gewas. Dit werk bevat een precieze protocol over het maken van een paard van Troje stam gevolgd door gestandaardiseerde infectie protocollen bij deze methode toepassen op drie verschillende maïs weefseltypes (HLA).

Constructies voor U. maydis Trojaans paard experimenten zijn gekloond in de plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gen van belang-mCherry-Ha. De maïs gen van belang is gesmolten tot een verslaggever van de fluorescentie mCherry en een epitoop HA-label. De uitdrukking van de fusieproteïne is onder controle van de promoter van U. maydis Umpit2 die specifiek is geacti...

Dit werk beschrijft het klonen van een Ustilago maydis Trojaans paard stam voor de in-situ levering van secreted maïseiwitten in drie verschillende types van maïs weefsels.

Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Het onderzoeken van processen op genetische en eiwitniveaus is cruciaal in gewasonderzoek. Onze aanpak maakt inspectie van uitgescheiden doolhofeiwitten met hoogste ruimtelijke temporele resolutie aan verschillende infectiezijden en weefsels mogelijk. De Trojan Horse Methode verkent nuttige automaat secretoire mogelijkheden.Het omzeilt tijdrovende en uitdagende doolhof transformaties, en vergemakkelijkt gedetailleerde studies over uitgescheiden eiwitten binnen het doolhof appelplatz. Gedetailleerde informatie over de juiste infectie van toegevoegde doolhof bladeren, kwasten en oor. En toont de succesvolle studie van infectieprogressie en eiwitfunctie in het doelweefsel.Het aantonen van de procedure zal Zijn Isabell Fiedler, een grad student van het laboratorium. Om te beginnen met het experiment, krassen Eumadous van een pediatr plaat met behulp van een steriele pasteur pipet. Inoculate 5 milliliter YEPS Light Medium met Eumadous.Laat de cultuur groeien op 28 graden Celsius, met constant schudden bij 200 rpm gedurende 16 uur. De volgende dag mix 900 microliters van verse YEPS Light met 100 microliters van de nachtelijke cultuur. Meet de OD-600 met YEPS Light Medium als een blanco in de spectrofotometer analyse.Verdun de nachtcultuur met verse YEPS Light Medium tot een OD-600 van 2. Laat de cultuur groeien op 28 graden Celsius met constante schudden bij 200 rpm, totdat het bereikt het midden van log groeifase, aangegeven door een OD-600 van 8 tot 1,0. Na incubatie, oogst de cellen door ze te draaien op 3000 keer chi gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant weg. Was vervolgens de celpilette een keer met 1 kweekvolume van DDH2O. Draai de cellen op 3000 time chi gedurende 10 minuten en gooi de supernatant.Dan, opnieuw op te schorten de cel pilette zorgvuldig in DDH2O, met behulp van een 20 milliliter glazen pipet. Daardoor het aanpassen van de laatste OD-600 TOT 3.0 voor een Trojaans paard test of 1.0 voor ziekte rating. Cultiveren het doolhof planten tot een stadium van volwassen bladeren, waar ten minste blad 7 groeit binnen de stengel.Breng vervolgens de Eumadous-cultuur over in een 3 milliliter spuit met een 20-meterbiedernaald. Druk voorzichtig op de steel om het spiegelstamweefsel te lokaliseren. De basis van de Mirror Stem kan worden onderscheiden door een overgang van hardere stengel naar zachter weefsel.Markeer de Mirror Stem op de steel met een pen. Injecteer 1,5 milliliter Eumadous cultuur 1 centimeter boven de Shoot Mirror Stem of Inflorescence Mirror Stem. Zodra de doolhofplanten het kwaststadium bereiken, drukt u voorzichtig op de steel om de kwast in de steel te lokaliseren.Markeer de punt en de basis van de kwast op de steel met behulp van een pen. Breng de Eumadous cultuur in een 3 milliliter spuit met een 20 gauge bi een hypodermische naald om een totaal van 1,5 milliliter van het entmateriaal rond de kwast te injecteren. Om gelijke verdeling van het entmateriaal te verzekeren, plaats u langzaam 5 milliliter op de punt, het midden en de basis van de kwast die met de pen is gemarkeerd.Breng de Eumadous cultuur in een 3 milliliter spuit met 20 meter bi een hypodermische naald. Injecteer de inentingsnaald zo diep mogelijk in de ruimte tussen de kafbladeren zonder het oor te verwonden en laat vervolgens 1,5 milliliter van het entmateriaal rond het oor vrij. Verwijder vervolgens de spuit en naald en masseer de kolf zorgvuldig om de Eumadous-oplossing gelijkmatig te verdelen.Drop 10 microliter van entmateriaal op een PD houtskool vijzelplaat. Dan incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen. Hyphae afscheid ZM Mach1 zijn omgeven door fluorescerende en kersensignaal.In tegenstelling, niet-krijten hyphae alleen laten zien fluorescerend signaal in de schimmel cytoplasma. Onjuiste kwastlokalisatie of ongelijke verdeling van het entmateriaal kan leiden tot niet-infecteerde kwast of slechts gedeeltelijke infectie van de kwast in vergelijking met zelfs distributie. De solo pathogene Trojan Horse Progenester stam SG-200, gekweekt op PD houtskool vijzel, vormt witte pluis filamenten op de plaat zoals afgebeeld.Terwijl de Eumadous stam FB1 paring vereist voor infectieuze filamentvorming. Na infectie, de mogelijke reactie van tekenen van de Trojan Horse lever eiwit kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende methoden, waaronder ziekte ratings of microscopische beeldvorming. Voor veel ziekteverwekkers zijn transformatie en afscheiding goed begrepen en kunnen ze op een vergelijkbare manier worden verkend.Daarom maken ze de studie van de gastheer mogelijk, die niet gevoelig zijn voor transformatie.

using-ustilago-maydis-as-trojan-horse-for-situ-delivery-maize

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Source: Beernink, B. M. et al. Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the Agrobacterium-mediated delivery of recombinant viral clones into maize seedlings for gene silencing. It outlines the process of Agrobacterium infection, systemic viral spread, and RNA interference-driven phenotypic changes.

Agrobacterium-Mediated Delivery of Recombinant Viral Clones into Maize Seedlings for Gene Silencing

Het gebruik van een naaldinjectiemethode om maïs- en teosinteplanten te enten met de biotrofe ziekteverwekker Ustilago maydis wordt beschreven.  De inentingsmethode voor naaldinjectie vergemakkelijkt de gecontroleerde afgifte van de schimmelpathogenese tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria. Deze methode is zeer efficiënt, waardoor reproduceerbare inentingen met U. maydis mogelijk zijn.

Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

Plant morfogene genen kunnen worden gebruikt om de genetische transformatie van recalcitrante genotypes te verbeteren. Hier beschreven is een Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie (QuickCorn) protocol voor drie belangrijke openbare maïs inteelt lijnen.

Agrobacterium-Gemedeerde onrijpe embryotransformatie van recalcitrante maïsinteeltlijnen met behulp van morfogene genen

Een agrobacterium-based injection (agroinjectie) protocol wordt gepresenteerd voor de inenting van vossenstaart mozaïek virus en suikerriet mozaïek virusclones in maïs zaailingen. Inenting op deze manier leidt tot virale infectie, virus-geïnduceerde gen-uitschakeling van markergenen en virale overexpressie van GFP.

Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Hier presenteren we een high-throughput protocol om miljoenen maïsprotoplasten tijdelijk te transfecteren voor het testen van grote bibliotheken van plasmiden in maïsmesofylcellen.

Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten

Enkele cel sequencing is een steeds populairder en toegankelijk instrument voor de aanpak van genomische veranderingen op hoge resolutie. Wij bieden een protocol dat enkele cel sequencing gebruikt om het aantal kopieën veranderingen te identificeren in enkele cellen.

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Een strategie voor het genereren van mutaties in histongenen op hun endogene locatie in Saccharomyces cerevisiae wordt gepresenteerd.

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

Hier beschrijven we de levering van microRNA met behulp van een recombinant adeno-associated virus serotype 9 in een muismodel van een neuromusculaire ziekte. Eenmalige perifere toediening in muizen geleid tot aanhoudende miRNA overexpressie in spieren en motorische neuronen, bieden een kans om studie miRNA functie en therapeutisch potentieel in vivo.

Systemische levering van MicroRNA met behulp van Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 voor de behandeling van neuromusculaire ziekten bij knaagdieren

Leer de Trojan Horse-methode voor in situ levering van eiwitten in maïsweefsels met Ustilago maydis. Deze aanpak vereenvoudigt onderzoek naar geheime eiwitten en plant-pathogeen interacties.

Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

Meer video's verkennen