Name: Licht gestuurde moleculaire motoren op oppervlakken voor één moleculaire beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer de synthese en beeldvorming van lichtgestuurde moleculaire motoren op oppervlakken voor moleculaire beeldvorming. Deze methode maakt visualisatie van rotatie op enkelmoleculair niveau mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijkonderzoek (NWO-CW), de European Research Council (ERC; geavanceerde subsidie no. 694345 B.L.F.), en het ministerie van onderwijs, cultuur en wetenschap (Gravitation programma neen. 024.001.035).

Opmerking: Organische synthese is de belangrijke kern van dit project. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen en het verkrijgen van de doelmolecule.
1. bereiding van 1b
Opmerking: Oplosmiddelen in p.a. hebt gekocht.
<ol><li>
Synthese van aldehyde (3) Opmerking: Op het eerste, een vijf-lid ring keton 2 met een Jood-groep is matiemaatschappij omdat het reactiever. Deze reactie wordt uitgevoerd onder argon sfeer.<ol>
<li>In een verzegelde buis (100 mL) met 2 (640 mg, 2,3 mmol), CuI (219 mg, 1.1 mmol) en NaI (3,44 g, 23 mmol) toe te voegen 1,4-dioxaan (50 mL) en N, N'-dimethyl ethyleendiamine (202 mg, 2,3 mmol).</li>
		<li>Instellen van de reactie temperatuur tot 140 ° C en roer gedurende 24 uur.</li>
		<li>Koel het mengsel tot kamertemperatuur (RT), verwijder het oplosmiddel in vacuüm en het zuiveren van het resterende materiaal door flash chromatografie: SiO2 (40 g); Eluens: pentaan: EtOAc 10:1 = (totaal = 550 mL). Het product moet worden verkregen als een gele, kleverige olie (642 mg, 91%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synthese van motor 5 Opmerking: Gebruik de Barton-Kellogg-reactie om de centrale dubbele binding te vormen. Deze reactie wordt uitgevoerd onder argon.<ol>
<li>In een rondbodemkolf 50 mL toevoegen Lawessons reagens (415 mg, 1.1 mmol), keton 3 (219 mg, 0.68 mmol) en tolueen (10 mL).</li>
		<li>Verwarm het mengsel op de Terugvloeiing voor 2 h en daarna het oplosmiddel te verdampen.</li>
		<li>Zuiveren van het residu op flash kolom: SiO2 (24 g), eluens: pentaan: ethylacetaat = 30: 1 uit (totaal = 155 mL) voor het overeenkomstige thioketon, die vervolgens in 20 mL THF opleveren van een blauwe oplossing is redissolved.</li>
		<li>Voeg een THF-oplossing (20 mL) van diazo samengestelde 4 (476 mg, 1.37 mmol) toe aan de blauwe oplossing, en roer de nieuwe gemengde oplossing bij 50 ° C's nachts. Opmerking: Dit is de meest cruciale stap voor de gehele synthese. De diazo compound en thioketon oplossing moet vers zijn en moet worden gemaakt vóór de reactie.</li>
		<li>Het oplosmiddel te verdampen en het residu zuiveren door chromatografie: SiO2 (24 g), eluens: pentaan: CH2Cl2 = 10:1 (totaal = 220 mL) aan het rendement van de motor 5 (250 mg, 50%) Als een rode vaste stof.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synthese van motor 6 Opmerking: Als de centrale dubbele binding is gevormd, vervangen de Jood-groep door een acetyleen-groep.<ol>
<li>Voeg een 20 ml Schlenk buis, 3 (165 mg, 0,26 mmol), Pd (PPh3)2Cl2 (2,5 mol %), CuI (5 mol %). Voeg vervolgens THF (10 mL) en (Ik-Pr)2NH (2 mL) die moet worden borrelen met argon voor 10 minuten vóór.</li>
		<li>Roer het mengsel op RT gedurende 10 minuten. Dan, voeg triisopropylsilyl acetyleen (42 mg, 0,27 mmol).</li>
		<li>Roer het mengsel voor 15u en giet het in een waterige verzadigde NH4Cl oplossing (25 mL).</li>
		<li>Pak het mengsel met CH2Cl2 (3 x 20 mL). Verder was de gecombineerde organische lagen met verzadigde pekel en droog (nb2SO4).</li>
		<li>Verwijder het oplosmiddel en het residu zuiveren door flash chromatografie: SiO2 (12 g), eluens: pentaan: CH2Cl2 = 10:1 (220 mL) om het rendement van 8 als een bruine olie (171 mg, 99%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synthese van motor 8 Opmerking: Deze reactie is uitgevoerd onder argon.<ol>
<li>Roer een mengsel van 6 (161 mg, 0,24 mmol), pinacol ester 7 (240 mg, 0.71 mmol), K3PO4 (300 mg, 1,44 mmol) en Pd (PPh3)4 (98 mg, 0.096 mmol) in 1, 4dioxane (20 mL) bij 90 ° C in een 50 mL Schlenk buis voor 16 h.</li>
		<li>Koel het mengsel aan RT, Verdun het met ethylacetaat (30 mL), en de filtratie uit te voeren met een glas, filter.</li>
		<li>Verwijder het oplosmiddel. Het residu zuiveren door flash kolom-chromatografie: SiO2 (12 g), eluens: pentaan: CH2Cl2= 1:6 (totaal = 122 mL) opbrengst van ester 8 als een bruine olie (156 mg, 56%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synthese van motor 9
	<ol>
<li>TBAF (0,1 mL) toevoegen aan een oplossing van 8 (120 mg, 0.13 mmol) in THF (10 mL) in een 20 mL Schlenk buis bij 0 ° C.</li>
		<li>Roer het mengsel bij 0 ° C gedurende 1 uur, vervolgens giet het in een waterige verzadigde NH4Cl oplossing (20 mL).</li>
		<li>Na extractie met CHCl3 (3 x 10 mL), het wassen van de gecombineerde organische lagen met verzadigde pekel en droog (nb2SO4).</li>
		<li>Verwijder het oplosmiddel en het residu zuiveren door flash chromatografie: SiO2 (12 g), eluens: pentaan: ethylacetaat = 1:3 (124 mL) om opbrengst 9 als een donker rode olie (116 mg, 95%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synthese van motor 12 Opmerking: Deze reactie is uitgevoerd onder argon.<ol>
<li>Toevoegen aan een 20 mL Schlenk buis, motor 9 (75 mg, 0.10 mmol) PBI 11 (68 mg, 0.10 mmol) Pd (PPh3)2Cl2 (2,5 mol %), CuI (5 mol %). Voeg vervolgens THF (10 mL) en (Ik-Pr)2NH (2 mL) die moet worden borrelen met argon voor 10 minuten vóór.</li>
		<li>Roer het mengsel 's nachts en giet het in een waterige verzadigde NH4Cl oplossing.</li>
		<li>Na extractie met CHCl3 (3 x 20 mL), het wassen van de gecombineerde organische lagen met verzadigde pekel en droog (nb2SO4).</li>
		<li>Verwijder het oplosmiddel en het residu zuiveren door flash chromatografie: SiO2 (12 g), eluens: CHCl3 (100 mL) motor 12 opleveren als een solide donkerrood (66 mg, 57%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synthese van motor 1b Opmerking: Wanneer de ester compound is verkregen, gehydrolyseerd om het einddoel-molecuul.<ol>
<li>Los van de ester 12 (90 mg, 0.038 mmol) in THF (5 mL), MeOH (5 mL) en NaOH(aq.) (1 M, 5 mL) in een maatkolf van 50 mL en verwarm het mengsel tot 75 ° C voor 16 h.</li>
		<li>Koel het mengsel aan RT en voeg 5 mL water toe. Verwijder de THF en MeOH roterende verdamping.</li>
		<li>Titreer het mengsel met HCl(aq.) (1 M) tot het bereiken van een pH van 1 tot en met een bruin neerslag vormen. Het mengsel filtraat en was de bruine vaste stof met koud water (10 mL) en droog onder vacuüm. Deze bruine vaste stof is de doelgroep molecuul 1b (55 mg, 85%).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van de motor matiemaatschappij enkelgelaagde MS-1b
<ol><li>Kwarts dia's schoon door ze onder te dompelen in een piranha-oplossing (3:7 verhouding 30% H2O2 in H2SO4) bij 90 ° C gedurende 1 h. Rinse aangenomen met dubbel gedestilleerd water 3 x, dan spoelen met MeOH. Droog de dia's onder een stroom van N2 voordat oppervlakte modificatie.</li>
	<li>Silanize de piranha-gereinigd quartz glijdt door het onder te dompelen in een oplossing van 1 mM van 3-aminopropyl (diethoxy) methylsilaan in vers gedestilleerd tolueen op RT voor 12 h. Rinse aangenomen met tolueen en MeOH.</li>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de quartz eerst in tolueen, en vervolgens in MeOH en droog ze onder een stroom van argon.</li>
	<li>Dompel de amine beklede dia's in DMF oplossing 1b (10-4 M) op RT tot 12u.</li>
	<li>Wassen van de dia's met DMF, water en MeOH, dan drogen ze onder een stroom van argon. Na het drogen zijn de dia's klaar voor gebruik.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, J. M., Tynoczko, J. L., Styer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+JM+%22Biochemistry+5th+ed%22">Biochemistry 5th ed</a>. , W.H. Freeman. New York. (2006).</li>
<li>Erbas-Cakmak, S., Leigh, D. A., McTernan, C. T., Nussbaumer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Machines.</a> Chemical Reviews. 115, 10081-10206 (2015).</li>
<li>Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Art+of+Building+Small%3A+From+Molecular+Switches+to+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%3A+International+Edition%22%5BJournal%5D)">The Art of Building Small: From Molecular Switches to Motors.</a> Angewandte Chemie: International Edition. 56, 11059-11078 (2017).</li>
<li>Stoddart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular Machines.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 410-411 (2001).</li>
<li>Kinbara, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Intelligent+Molecular+Machines%3A+Directed+Motions+of+Biological+and+Artificial+Molecules+and+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Toward Intelligent Molecular Machines: Directed Motions of Biological and Artificial Molecules and Assemblies.</a> Chemical Reviews. 105, 1377-1400 (2005).</li>
<li>Kay, E. R., Leigh, D. A., Zerbetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Molecular+Motors+and+Mechanical+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%3A+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Synthetic Molecular Motors and Mechanical Machines.</a> Angewandte Chemie: International Edition. 46, 72-191 (2007).</li>
<li>Kottas, G. S., Clarke, I. L., Horinek, D., Michl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Rotors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Rotors.</a> Chemical Reviews. 105, 1281-1376 (2005).</li>
<li>Watson, M. A., Cockroft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+Molecular+Machines%3A+Membrane+Bound%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Man-made Molecular Machines: Membrane Bound.</a> Chemical Society Reviews. 45, 6118-6129 (2016).</li>
<li>Kassem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Motors.</a> Chemical Society Reviews. 46, 2592-2621 (2017).</li>
<li>Sauvage, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSauvage%2C+JP+%22Molecular+Machines+and+Motors%22">Molecular Machines and Motors</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>van Delden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+molecular+motor+on+a+gold+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unidirectional molecular motor on a gold surface.</a> Nature. 437, 1337-1340 (2005).</li>
<li>Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M., Kinosita, K. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+rotation+of+F1-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the rotation of F1-ATPase.</a> Nature. 386, 299-302 (1997).</li>
<li>Hutchison, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-bound+molecule+that+undergoes+optically+biased+Brownian+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A surface-bound molecule that undergoes optically biased Brownian rotation.</a> Nature Nanotechnology. 9, 131-136 (2014).</li>
<li>Krajnik, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocused+Imaging+of+UV-Driven+Surface-Bound+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Defocused Imaging of UV-Driven Surface-Bound Molecular Motors.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 7156-7159 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit project omvat een aanzienlijke hoeveelheid synthetische werk; Daarom is de meest kritische stap organische synthese op weg naar de definitieve molecule. Onder de totale synthese is de Barton-Kellogg-reactie de belangrijkste stap, want het is de reactie die de centrale dubbele binding van de moleculaire motor wordt gevormd. Op dit moment zijn verschillende methoden gebruikt om deze soorten structuren vormen. Hier, diazo-thioketon koppeling wordt gebruikt, en de bovenste en onderste helften zijn opgesteld als de diazo en thioketon verbindingen, respectievelijk. Thioketon en diazoverbindingen zijn meestal niet stabiel onder lucht; de reactie vereist daarom snel onder de werking van een strikt inerte atmosfeer.
Bestaande methoden beperken van moleculaire motoren op de oppervlakken zijn meestal gebaseerd op bipodal systemen. De processen van de isomerisatie van eerder ontworpen bipodal motoren waren echter belemmerd door Intermoleculaire interacties. Bovendien, sommige van de bipodal voorbeelden vereist verdere activering voorafgaand aan bijlage. De huidige methode maakt dit mogelijk op een tetrapodal manier, die voorziet in robuuste bijlage van de motor over oppervlakken met voldoende geïsoleerde ruimte.
Een beperking van deze methode is de keuze van TL-tag. Alleen de kleurstoffen met specifieke golflengten zijn toegestaan, zoals de rotatie van de motor wordt geactiveerd door de 365 nm golflengte en dus moet niet overlappen. Bovendien vereist de synthetische route werkzaam in de beschreven protocol naar de doelmolecule enkele stappen in die barre omstandigheden zijn nodig voor de voltooiing van de reactie. In de toekomst een meer facile synthetische ontwerp is waarschijnlijk nodig zijn als een meer geavanceerde molecule voor één moleculaire beeldvorming vereist is.
Kortom, wordt het ontwerp en de synthese van een zeer functionalized licht gestuurde moleculaire motor beschreven voor de eerste keer. Sommige details van de synthetische inspanning worden besproken, evenals. Bovendien, methoden voor het enten van de motor op een kwarts dia oppervlak worden gedemonstreerd en het monster kan verder te worden getest voor visualisatie van één moleculaire beweging14.

In levende organismen zijn er overvloedige moleculaire motoren functioneren om het dagelijkse leven. Zij kunnen verschillende taken uitvoeren zoals brandstof productie, vervoer, mobiliteit, etc.1. Tekening uit de inspiratie van deze fascinerende voorbeelden in de natuur, hebben wetenschappers ontwikkeld, een reeks van kunstmatige moleculaire motoren in de afgelopen decennia verschillende soorten energie omzetten in gecontroleerde beweging op het moleculaire niveau2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. the Nobel Prize in Chemistry in 2016 werd toegekend aan drie Pioniers op dit gebied. Ben Feringa, een van de laureaten, heeft de licht gestuurde moleculaire motor welk vermag ondergaan continue unidirectionele roterende beweging ontwikkeld.
Echter, op een moleculair niveau, Brownse beweging, ook bekend als de willekeurige beweging als gevolg van moleculaire botsingen en trillingen, is meestal het belangrijkste obstakel voor verdere toepassing van deze moleculaire motoren. Brownse beweging kan een gerichte beweging verstoren. De moleculaire motoren op oppervlakken te beperken, mag een van de opties om dit probleem te overwinnen. Door dit te doen, wordt de relatieve rotatie van een deel van het molecuul met betrekking tot de andere geconverteerd naar de absolute rotatie van de rotor ten opzichte van de oppervlakte11. Daarnaast kan gebruik van de interne moleculaire beeldvorming techniek helpen visualiseren van de ontwerpresolutie. Dus, de resultaten van dit werk zal helpen meer inzicht in de synthetische moleculaire motor.
Het pionierswerk van Jansen en Kinosita (Figuur 2a)12,13 heeft gediend als inspiratie voor het ontwerp in het huidige werk, getoond in Figuur 2b. De onderste helft van een licht gestuurde moleculaire motor is gekoppeld aan een oppervlak om te dienen als de stator. Het deel van de rotor is matiemaatschappij met een stijve arm en fluorescerende label. Wanneer twee verschillende bestraling golflengten op het systeem toepassen, zal een de rotatie van de motor, trigger terwijl anderzijds de fluorescerende tag zal prikkelen. In principe leidt de roterende beweging van de rotor deel de rotatie van de fluorescerende groep. Dus, de rotatie van de TL-tag kan worden gevolgd door intreepupil breed-gebied fluorescentie microscopie. Deze methode biedt, voor de eerste keer, een methode voor het omzetten van de relatieve rotatie van een moleculaire motor in absolute draaihoek, en dus een manier om te visualiseren van de rotatie van een synthetische motor.
Dit artikel bevat details over het ontwerp, totale synthese en oplossing isomerisatie studies van een moleculaire motor die wordt gebruikt voor één moleculaire beeldvorming. De moleculaire structuur is afgebeeld in Figuur 3. Bovendien, wordt de methode voor het koppelen van moleculaire motoren op quartz oppervlak beschreven.

<table><tbody><tr><td>NMR spectrometer</td><td>Varian</td><td>AMX400</td><td>voor proton nmr studie</td></tr><tr><td>Reagens voor organische reacties</td><td>Sigma</td><td>analtische kwaliteit</td><td>reagens voor organische reacties</td></tr><tr><td>Silica gel&nbsp;</td><td>Merck</td><td>230-400 mesh ASTM</td><td>Flash chromatografie&nbsp;</td></tr><tr><td>Solvent</td><td>Acros</td><td>spectrofotometrische kwaliteit&nbsp;</td><td>Flash chromatografie&nbsp;</td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>ENB</td><td>280C</td><td>voor UV-vis bestraling</td></tr><tr><td>UV-vis absorptiespectrofotometer</td><td>JASCO</td><td>V-630&nbsp;</td><td>UV-vis meting</td></tr></tbody></table>

licht gestuurde moleculaire motoren op oppervlakken voor één moleculaire beeldvorming

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Het ontwerp en de synthese van een synthetische systeem dat tot doel voor de directe visualisatie van een synthetische roterende motor op het niveau van één molecuul op oppervlakken heeft worden gedemonstreerd. Dit werk vereist zorgvuldige ontwerp, synthetische inspanning en juiste analyse. De roterende beweging van de moleculaire motor in oplossing blijkt uit 1H NMR en UV-vis Absorptie spectroscopie technieken. Bovendien, wordt de methode voor het enten van de motor op een amine beklede kwarts beschreven. Deze methode helpt meer inzicht in de moleculaire machines.

Bestraling van de moleculaire motor wordt uitgevoerd met UV-licht (λmax = 365 nm). Na bestraling, een foto-geïnduceerde E-Z isomerisatie rond de centrale dubbele binding treedt op. Tijdens dit proces is de molecule uit een stal omgezet naar een unstable isomeer. Een thermisch geactiveerd helix inversie stap volgt dan om de spanning van het hele molecuul vrij te geven. Dit resulteert in de originele stabiel staat. 1 H NMR spectroscopie wordt vervolgens gebruikt om de roterende proces (figuur 4a) te evalueren. Een oplossing van het monster wordt bereid in een NMR-buis, dan een lamp van UV-licht (λmax = 365 nm) wordt naast de buis geplaatst. Na 2 uur van bestraling, verschillende wijzigingen vindt u in het spectrum van 1H NMR. Deze wijzigingen geven aan het genereren van een nieuwe isomeer die wordt beschouwd als unstable-1b (figuur 4b). Het wordt gezien in de 1H NMR spectroscopie dat Heen van 2,9 ppm (doublet) tot 3,3 ppm (dubbele doublet verschuift). Het signaal met 1,4 ppm kan worden toegewezen als de absorptie van de methylgroep en downfield verschuift dus van 1,4 ppm tot 1.6 ppm. Het monster is's nachts bewaard bij kamertemperatuur in het donker, de oorspronkelijke spectrum kan worden hersteld (figuur 4a). Het geeft aan het proces van de thermische helix-inversie dat unstable-1b naar testing-1b converteert.
Om te bestuderen van de roterende beweging van de motor 1b op oppervlakken, de oppervlak-ingeschrevenen motor assembly's MS-1b (MS = motor op oppervlakken) zijn bereid. De quartz-dia's zijn eerste matiemaatschappij met amine. Na deze stap, is de kwarts ondergedompeld in een oplossing van de DMF (10-4 M) van 1b op RT's nachts. De resulterende quartz is gespoeld met DMF, water en MeOH. De voorbereide kwarts dia's zijn vervolgens voorgelegd voor UV/vis studies. Een UV/vis-absorptiespectrum van MS-1b (vaste lijn) wordt getoond in Figuur 5b. Zoals gezien in het spectrum, zijn de grote absorptie band en het profiel van de absorptie vergelijkbaar met die is waargenomen in de oplossing (figuur 5a). Het toont ook de karakteristieke absorptie voor motor (420 nm) en PBI (456 nm, 490 nm, 524 nm). Deze pieken suggereren de succesvolle gehechtheid van motor 1b aan de amine-gecoate oppervlakken. Bovendien, de kwarts dia wordt bestraald gedurende 15 minuten, en spectrale veranderingen die vergelijkbaar is met die van de oplossing, met vermelding van de generatie van de unstable MS-1b worden waargenomen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig1.jpg"> Figuur 1 : Synthetische regeling tot de voorbereiding van doel molecuul 1b. De regeling bevat de reagentia, oplosmiddelen en reactie voorwaarden die worden gebruikt in elke stap.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig2.jpg"> Figuur 2 : (een) Schematische illustratie van de structuur van F0F1-ATPase geënt op een oppervlak voor visualisatie van unidirectionele rotatie (gereproduceerd met toestemming12). (b) conceptontwerp van een synthetische oppervlakte-gebonden licht gestuurde moleculaire motor voor enkel molecuul imaging.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig3.jpg"> Figuur 3 : Structuur van een oppervlak-gebonden moleculaire motor 1b, rekening houdend met een stijve lange arm tussen de motor kern en de PBI etiket. 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig4.jpg"> Figuur 4 : Alifatische regio van de 1 H-NMR spectra van motor 1b (CD2Cl2, -20 ° C, c = 10-3 M) (een) testing-1b, voordat de bestraling (365 nm). (b) foto stationaire toestand mengsel na bestraling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58750/58750fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig5v2.jpg"> Figuur 5 : UV/vis absorptiespectra. UV/vis absorptiespectra van (een) motor 1b (CH2Cl2, 0 ° C), stabiele isomeer (vaste lijn) en unstable isomeer (gestippelde lijn) op de PSS. (b) MS-1b (quartz, 4 ° C) voordat (vaste lijn) en na (gestippelde lijn) bestraling.

Het manuscript wordt beschreven hoe synthetiseren en enten van een moleculaire motor op oppervlakken voor één moleculaire beeldvorming.

Licht gestuurde moleculaire motoren op oppervlakken voor één moleculaire beeldvorming

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Dit protocol geeft een eerste voorbeeld van het visualiseren van de rotatie van een door de mens gemaakte lichtaangedreven moleculaire motor op enkel moleculair niveau. De synthetische techniek die hier wordt gebruikt is ontworpen om de synthese van een complexe moleculaire machine met verschillende functionele groepen mogelijk te maken. Ten eerste, onder een argon atmosfeer, plaats 640 milligram van de rotor precursor verbinding twee, 219 milligram koperjodide, en 3,44 gram natriumjodide in een 100-milliliter Schlenk buis uitgerust met een roerbar.Sluit de verzegelde buis aan op een Schlenk-lijn en voeg 50 milliliter 1, 4-dioxaan en 263 milligram trans-1, 2-Diaminocyclohexaan toe. Roer het mengsel op 140 graden Celsius gedurende 24 uur om de broom substituent te ruilen voor jodium. Laat het mengsel vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur en verdampen het oplosmiddel onder vacuüm.Zuiveren van de verbinding door silica gel flash chromatografie en verwijder de vluchtige stoffen om de jodium-vervangende verbinding drie te verkrijgen als een kleverige, gele olie. Plaats vervolgens 415 milligram reagens reagens van Lawesson en 219 milligram verbinding drie in een Schlenk-kolf uitgerust met een roerstaaf. Sluit de kolf via een condensor aan op een Schlenk-lijn en zuiver deze drie keer met argon.Voeg 10 milliliter tolueen toe en reflux het mengsel gedurende twee uur om verbinding drie om te zetten in een thioketoon. Verdamp het oplosmiddel en zuiver de thioketon door flashchromatografie. Verwijder vluchtige stoffen uit de zuivere fractie en los de geïsoleerde thioketon op in 20 milliliter tetrahydrofuran.Los vervolgens 476 milligram vers bereide verbinding 4 op, de stator diazo-voorloper, in nog eens 20 milliliter THF. Voeg de oplossing van compound 4 toe aan de thioketonoplossing en laat het mengsel gedurende 16 uur onder argon opnieuw onder het roeren om de dubbele binding tussen de rotor en de stator te vormen. Verdamp overtollig oplosmiddel, zuiver het ruwe product door flashchromatografie en verwijder de vluchtige stoffen om motorcompound 5 als rode vaste stof te verkrijgen.Voeg vervolgens 165 milligram motor 5, 4,56 milligram bis (triphenylfosfine)palladiumchloride en 2,48 milligram koperjodide toe aan een 20-milliliter Schlenk-buis uitgerust met een roerbar. Sluit de buis af en sluit deze aan op een Schlenk-lijn. Combineer 10 milliliter THF en twee milliliter diisopropylamine en bubble argon door het mengsel gedurende 10 minuten.Breng het mengsel vervolgens naar de Schlenk-buis en roer het reactiemengsel onder argon gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Voeg 42 milligram triisopropylsilyl acetyleen toe en blijf 15 tot 16 uur roeren om het jodium te vervangen door TIPS acetyleen. Giet vervolgens het productmengsel in 25 milliliter verzadigde waterige ammoniumchloride.Haal het product in drie porties dichloormethaan van 20 milliliter en was de gecombineerde organische lagen eenmaal met 50 milliliter verzadigde pekel. Droog de gewassen organische lagen over natriumsulfaat. Filtreer de droogmiddel eruit en verwijder overtollig oplosmiddel.Zuiver het residu door middel van flash chromatografie en verwijder de vluchtige stoffen onder vacuüm om motor zes te verkrijgen als een bruine olie. In een kolf van 50 milliliter uitgerust met een roerstaaf, combineer 90 milligram van de PBI-gelabelde motor 12, vijf milliliter THF, vijf milliliter methanol en vijf milliliter een-molaire waterstofhydroxide. Roer het mengsel op 70 graden Celsius gedurende zes uur te hydrolyseren de esters op de stator.Vervolgens koelt u het mengsel af op kamertemperatuur tijdens het roeren. Voeg vijf milliliter dubbel gedestilleerd water toe en verwijder de vluchtige oplosmiddelen door roterende verdamping. Voeg waterig eenkievel hydraulisch zuur toe tot het mengsel pH bereikt, waarna motor 1b als bruine vaste stof uit de oplossing zal neerslaan.Herstel de vaste stof door filtratie, was het met 10 milliliter koud water en droog het onder vacuüm. Vervolgens weken kwarts dia's in piranha oplossing op 90 graden Celsius gedurende een uur. Spoel de glijbanen drie keer af met vijf milliliter dubbel gedestilleerd water en één keer met methanol.Droog de glijbanen met stikstofgas. Bereid vervolgens een oplossing van één millimolar van 3-aminopropyl (diethoxy)methylsilane in vers gedistilleerd tolueen. Week de glijbanen in deze oplossing gedurende 12 uur op kamertemperatuur en spoel de geslibiseerde glijbanen met vijf milliliter elk van tolueen en methanol.Dompel de dia's in tolueen en methanol in volgorde gedurende twee minuten elk, en droog ze vervolgens onder een stroom van argon gas. Bereid vervolgens vijf milliliter van een 0,1-millimolar oplossing van motor 1b in dimethylformamide voor elke dia. Week de glijbanen in de 1b-oplossing op kamertemperatuur gedurende 12 uur om de kwartsoppervlakken te functionaliseren met een monolaag van 1b.Was de gefunctionaliseerde glijbanen met DMF, water en methanol in volgorde. Droog de glijbanen met argongas en bewaar ze in een verzegelde container onder argon. Moleculaire motor 1b werd gesynthetiseerd in matige opbrengst, met een stijve, fenyl-ethynieleen tetramerarm die de kern van de rotor verbindt met de fluorescerende tag.Het proton NMR-spectrum vertoonde geen significante vicinale koppeling tussen Ha en Hc, wat overeenkomt met Ha en Hc die beide in pseudoequatoriale oriëntaties zijn. Axiale equatoriale vicinale koppeling werd waargenomen tussen Hb en Hc.Irradiation met 365 nanometer licht geïnduceerde isomerisatie rond de centrale dubbele binding met deze onstabiele isomer. De downfield verschuiving van het methylsignaal en de ontwikkeling van vicinale koppeling tussen Ha en Hc gaven beiden aan dat de methylgroep pseudoequatoriaal was.Toen de verbinding bij kamertemperatuur in het donker werd gehouden, gaf thermische helixinversie de spanning op het molecuul vrij met de naphthalene die langs de fluorene glijdt. Dit keerde het molecuul terug naar zijn oorspronkelijke configuratie vanwege de symmetrische fluorene stator. UV/vis spectroscopie van de stabiele en onstabiele isomeren vertoonde bescheiden verschillen in de karakteristieke absorptiegebieden voor de stijve arm en de fluorescerende tag.De succesvolle montage van een monolaag van motor 1b op kwarts werd bevestigd door UV/vis spectroscopie. De monolaag had slechts 15 minuten bestraling nodig om de instabiele isomer in de foto stationaire toestand te bereiken. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de diazo en thioketon verbindingen vers zijn gemaakt om de succesvolle synthese van de motor 5 te garanderen.Het onderzoeksveld van moleculaire machines kan profiteren van deze methode, omdat het een belangrijke richtlijn is voor het ontwerpen, synthetiseren en visualiseren van complexe moleculaire machines. Piranha oplossing wordt gebruikt om de glijbanen schoon te maken. Deze oplossing is zeer zuur, en moet met de nodige voorzichtigheid worden gebruikt.

light-driven-molecular-motors-on-surfaces-for-single-molecular-imaging

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Single fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met nanometer precisie met behulp van FIONA. Hier een overzicht van de FIONA techniek is gemeld, en hoe FIONA experimenten uit te voeren wordt beschreven.

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

We presenteren een protocol voor het creëren van een realtime film van een moleculair rotatiegolfpakket met behulp van een hoogwaardige Coulomb-explosie-beeldvormingsopstelling.

Direct Imaging van Laser-driven Ultrasnelle Moleculaire Rotation

We presenteren een protocol om te bouwen van moleculaire/naar vliegveld, waar kinesin oppervlak-in acht genomen motor eiwitten voortbewegen kleurstof-gelabelde microtubuli. Zwakke interacties van de kinesins met het oppervlak kunnen hun omkeerbare gehechtheid aan het. Dit creëert een nanoschaal-systeem dat dynamische montage en demontage van de onderdelen met behoud van zijn functionaliteit vertoont.

Monteren van moleculaire Shuttles Powered by omkeerbaar aangesloten Kinesins

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Leer de synthese en beeldvorming van lichtgestuurde moleculaire motoren op oppervlakken voor moleculaire beeldvorming. Deze methode maakt visualisatie van rotatie op enkelmoleculair niveau mogelijk.

Licht gestuurde moleculaire motoren op oppervlakken voor één moleculaire beeldvorming

Meer video's verkennen