Name: Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Leer een eenvoudige methode om fagocytose van peritoneale macrofagen te beoordelen met EGFP-expresserende Escherichia coli. Dit protocol vergelijkt jonge en oude muizen om immunologisch verouderen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31800046) en de Natural Science Foundation van Liaoning Province (nr. 20170540262). Dit werk werd gerealiseerd in de laboratoria van het Scientific Research Center aan de tweede ziekenhuis van Dalian medische universiteit. De auteurs bedank Xiao-Lin Sang voor haar hulp bij de stroom cytometry, en Bo Qu en Dong-Chuan Yang voor hun hulp bij het opstellen van de video.

Alle procedures werden uitgevoerd onder de nationale instituten van gezondheid richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren, en de protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Dalian medische universiteit. Zestien-maand-oude (met een lichaamsgewicht van 30-35 g) en acht weken oude (20-25 g) SPF (specific pathogen-vrij) mannelijke C57BL/6 muizen werden verkregen van de SPF dierlijke centrum van Dalian Medizinische Universität. Alle muizen werden bewaard in de huisvesting van de dieren met toegang tot voedsel en water ad libitum. De temperatuur werd gehouden op 20-24 ° C, luchtvochtigheid was 40% - 70%, en verlichting was 12 licht/12 uur donker. Dieren mochten acclimatiseren aan het milieu voor ten minste 7 dagen voor het experiment.
1. bouw van het huisdier-SUMO-EGFP plasmide en inductie van de expressie van EGFP
<ol><li>Synthetiseren van het fragment van de gene EGFP (een 717 bp reeks gesynthetiseerd door een aangepaste gene synthese dienst, Zie Tabel van materialen en aanvullende bestand 1 voor de reeks) en versterken van het fragment met de voorwaartse primer ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') en reverse primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3 "), met behulp van HiFi-polymerase van DNA Taq.</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat de polymerase-kettingreactie (PCR) producten enkele 3' adenine overhangen hebben voor het klonen van TA in de volgende stap, gebruikt u de extensie van een 30 min bij 72 ° C na de laatste cyclus (Zie aanvullende bestand 1 voor PCR voorwaarden). Controleer het PCR-product door agarose gelelektroforese.</li>
	<li>Klonen van de PCR-product in de vector van het huisdier-SUMO (Zie Tabel van materialen) met behulp van de methode5 met T4 DNA ligase klonen TA. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur (20-25 ° C) gedurende 30 minuten. De vector is gelineariseerde tussen nucleotiden 653 en 654 met een 1 bp 5 ' T-overstek op elk onderdeel.</li>
	<li>De afbinding product transformeren in de chemisch bevoegde BL21(DE) E. coli -stam als volgt: Voeg 5 µL (100 ng) van PCR product naar 100 µL BL21(DE) bevoegde cellen via warmte schok bij 42 ° C gedurende 90 s; Houd het mengsel op het ijs gedurende 3 minuten en voeg vervolgens 400 µL van lysogenie Bouillon (LB) medium voorverwarmd bij 37 ° C, gedurende 1 uur bij 37 ° C en 120 omw / schudden.</li>
	<li>Inoculeer 100 µL van de bacteriën op het oppervlak van een LB-kanamycine (100 µg/mL) plaat met de inductor lactose (0.5 mmol/L), opbrengst van de stam van de expressie EGFP. Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts. Opmerking: Indien de EGFP met succes wordt uitgedrukt, sommige kolonies kunnen worden waargenomen als gloeiende groen licht in het donker.<ol>
<li>Selecteer eventueel kolonies om te controleren of het ingevoegde fragment van EGFP door DNA sequentiebepaling. De inleidingen voor DNA rangschikkend zijn: forward, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; omgekeerde, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculeer een positieve kolonie in 5 mL LB medium met 100 µg/mL kanamycine. Incubeer in een 37 ° C incubator schudden bij 120 omw / m voor 2 h, en vervolgens de inductor lactose toevoegen om een eindconcentratie van 0.5 mmol/L en blijven schudden voor 6 h, inducerende expressie van EGFP. Empirisch, wanneer schudden voor 6 h, de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) oplopen tot 0,7 of hoger.</li>
	<li>10 µL van het bacteriële kweekmedium aan een dia toevoegen en bedek het met een dekglaasje aan de expressie van EGFP onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop onderzoeken. De uiting van EGFP bacteriën kunnen worden opgeslagen in het medium bij 2-8 ° C voor enkele weken.</li>
</ol>2. muis peritoneale macrofaag isolatie en primaire cultuur
<ol><li>Voeg 3,5 g thioglycolaat aan 100 mL gedestilleerd water en autoclaaf dit mengsel aan de steriliteit vóór gebruik. Pomp het thioglycolaat medium in de 1 mL steriele injectiespuit in de kap voor de muis peritoneale injectie. Gebruik één muis per spuit te voorkomen infectie. Het gebruik van thioglycolaat kan het verhogen van het aantal macrofagen. De resident peritoneale macrofagen kunnen worden geïsoleerd zonder thioglycolaat, maar met een lagere macrofaag oplevert.</li>
	<li>Anesthetize de muis met een methode goedgekeurd door de lokale dierenverzorgers en gebruik Comité. 1 mL van 3,5% thioglycolaat medium injecteren met peritoneale holte van de muis met de spuit van 1 mL, met behulp van een naald 23 G. Opmerking: Door inducerende anesthesie, de peritoneale injectie kan gemakkelijk worden uitgevoerd en vermindert het risico van verwondingen aan de inwendige organen veroorzaakt door injectie.</li>
	<li>De muis met water en voedsel ad libitum gedurende 3 dagen. Toezicht op het lichaam gewicht en voedsel inname van het dier elke dag. Als het gewichtsverlies van het lichaam groter dan 10% binnen 3 dagen is, sluit u het dier uit het experiment.</li>
	<li>Na 3 dagen, door de muis te euthanaseren door cervicale dislocatie na snel inducerende verdoving door Sevofluraan in een gesloten doos. U kunt ook een methode gebruiken die is goedgekeurd door het lokale dierlijke zorg en gebruik Comité om de muis euthanaseren.</li>
	<li>Zet de muis in een schotel (met een diameter van 10 cm) met 75% ethanol te steriliseren, en het snel overbrengen in de kap. Plaats de muis op een plaat en pin van de voorste poot aan het bestuur van de muis positie vast te stellen.</li>
	<li>Met een 5 mL injectiespuit gekoppeld aan een 20 G injecteren naald, de naald schuine kant omhoog te plaatsen in een hoek van 30° - 40°, 5 mL koud (4-10 ° C)-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor de onderbuik van de muis peritoneale Holte, het vermijden van de darm te prikken. Als de darm (of elk ander orgaan) is doorboord, kunnen de muis en de bijbehorende cellen niet langer worden gebruikt voor experimenten, zoals dit cellen die niet geschikt voor primaire celculturen zijn kan activeren.</li>
	<li>Het uitvoeren van een zachte massage aan beide zijden van de buik van de muis. Vervolgens gecombineerd de vloeistof voorzichtig en langzaam. Breng de peritoneale vloeistof in een centrifugebuis 50 mL. Herhaal deze stappen 2 x of 3 x.</li>
	<li>Centrifugeer de zwevende cellen gedurende 10 minuten bij 400 x g in een gekoelde centrifuge (4-8 ° C). Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in RPMI 1640 medium met 10% foetale runderserum (FBS). Cellen tellen. De celdichtheid is empirisch, ongeveer gelijk aan 5 x 106 cellen/mL wanneer de cellen zijn geresuspendeerde 10 ml van medium.</li>
	<li>5 x 106 cellen toevoegen in elk putje van de plaat van een 6-goed voor de stroom cytometry assay en 5 x 10,5 cellen per putje in een 24-well plaat voor een fluorescentie Microscoop. Cultuur de cellen bij 37 ° C in een broedstoof 5% CO2 's nachts. Het kweekmedium kan worden vernieuwd na 3 h nonadherent cellen verwijderen, omdat de meeste van deze zijn lymfocyten. De Adherente cellen zijn voornamelijk de macrofagen, en ze kunnen houden goed aan weefsel-cultuur-testgroep kunststof.</li>
</ol>3. macrophage fagocytose assay met behulp van de fluorescentie Microscoop
<ol><li>Observeer de cellen onder een heldere-veld Microscoop te beoordelen van de levensvatbaarheid van de cellen en de celdichtheid.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium uit de plaat 24-well. Voeg 100 µL cultuurmedium verse en 10 µL van bacteriële suspensie (ongeveer 2 x 107 cellen) in elk putje zoals beschreven in tabel 1. Incubeer gedurende 1 uur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
	<li>Voorzichtig wassen 3 x-5 x met koude PBS 500 µL per putje te wassen noninternalized bacteriën.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 4% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Wassen van de vaste cellen 3 x met PBS (500 µL per putje).</li>
	<li>Voeg toe 200 µL van phalloidin 633 fluorescentie kleurstof geconjugeerd werkoplossing (Zie Tabel van materialen) om de F-actine vlek. Winkel in een donkere, vochtige plaats (60% - 80%) bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten spoel de cellen 3 x met PBS (500 µL per putje) te verwijderen van de overtollige phalloidin. Door kleuring van de F-actine, het cytoplasma kan worden beschreven en kunnen onderscheiden van de verinnerlijkte bacteriën.</li>
	<li>Voeg 200 µL van de DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) werkoplossing (1 µg/mL), de celkern vlek en incubeer gedurende 5 minuten in een donkere, vochtige plaats bij kamertemperatuur. Spoel 1 x met PBS (500 µL per putje) en 1 x met dezelfde hoeveelheid gedestilleerd water. Vervolgens zal de cellen klaar zijn voor observatie onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop.</li>
</ol>4. macrophage fagocytose assay met behulp van stroom cytometry
<ol><li>De experimentele fouten te minimaliseren en maken van een juiste interpretatie van de resultaten, de groepen instellen en beheren van buizen voor het experiment, zoals vermeld in tabel 2.<ol>
<li>Voor de controlegroep, die zal worden gelegd op ijs (groep 4 in tabel 2), verwijder het medium van de 6-well-plaat en wassen het 1 x met PBS. Dan, voeg 1 mL koude EDTA 70 mM in het putje loskoppelen van de cellen en hen overbrengen naar de stroom cytometry buis. Voeg 50 µL van bacteriële suspensie in de buis en plaats deze op het ijs gedurende 1 uur.</li>
		<li>Voor de andere fracties, verwijdert u het kweekmedium. Voeg 1 mL verse voedingsbodem in elk putje. Voeg 50 µL van bacteriële suspensie in de putjes volgens de instelling van de groep, zoals beschreven in tabel 2. Dan de 6-well-plaat in de 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 1 h te plaatsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om het doven van de fluorescentie van noninternalized E. coli, voeg 200 µL van 0,8% (CV) water Kristalvioletoplossing in de put en zwaaien kort, dus het vermijden van een vals-positieve resultaat door de uiting van EGFP E. coli binding aan het oppervlak van de macrofagen maar niet geïnternaliseerd. Wassen van de cellen 3 x met PBS te verwijderen van alle resterende CV.</li>
	<li>Dan, voeg 1 mL koude EDTA 70 mM in het putje loskoppelen van de cellen en hen overbrengen naar de stroom cytometry buis.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Voeg 100 µL van PBS te resuspendeer de cellen. Voeg 5 µL van F4/80-PE-geconjugeerd antilichaam (een oppervlakte-antigeen uitgedrukt op muis macrofagen) in de buizen, of gebruik IgG2a-PE isotype, volgens de instelling van de groep. Vortex kort en de monsters op ijs gedurende 5-10 min. in het donker uit te broeden.</li>
	<li>Voeg 1 mL PBS in elke buis en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cel pellets met 200-300 µL van PBS voor stroom cytometry analyse. Elke buis uitgevoerd en het verwerven van gegevens voor ten minste 10.000 gebeurtenissen van F4/80+ cellen.</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
<li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+TA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De stappen in dit protocol zijn vrij eenvoudig en duidelijk. Een van de kritische stappen is voor het opwekken van de expressie van EGFP op E. coli. Meestal, wanneer een gen van eukaryoten, zoals EGFP, is gepland om uit te drukken in prokaryoten zoals E. coli, is er een risico dat het eiwit zal vormen inactief aggregaten (opneming lichamen), waardoor de oorspronkelijke structuur en de activiteit van het eiwit is gewijzigd. Met behulp van het huisdier-SUMO vector en bouw van het huisdier-SUMO-EGFP plasmi...

Macrophage fagocytose tests worden vaak gebruikt voor het bestuderen van het aangeboren immuunsysteem. De aangeboren immuunrespons kan duiden op gevoeligheid voor infectie. Macrophage cellijnen worden veel gebruikt in studies van de immunologie. Echter, de uitgebreide passage kan gene verlies en immuun functies in deze cellijnen in gevaar gebracht. De primaire peritoneale macrofagen zijn dus het ideale object in waarnaar u de cel functie1studie.
Hoewel de aangeboren immuunrespons gedacht intact in het jaar oud lichaam dat werd, kan de fagocytische vermogen afnemen in vergelijking met dat in de jongere lichaam2,3. Hier zullen we laten zien dat een methode voor de beoordeling van de fagocytose van peritoneale macrofagen van jonge (acht weken oude) en ouderen (16-maand-oude) muis met behulp van EGFP-uiten E. coli, die handig, snel en economisch haalbaar is is.
Het gebruik van een uiting van EGFP E. coli stam is een van de voordelen van deze test omdat deze bacteriën stabiel zijn en een sterke fluorescentie-signaal, zelfs nadat macrofagen worden opgelost door 4% (m/v) paraformaldehyde weergegeven. Bovendien, met behulp van de uiting van EGFP E. coli, onderzoekers hoeft niet verder kleuring na fagocytose, wat tijd bespaart. Bovendien zijn de macrofagen immunoresponsive voor E. coli oppervlakte-antigeen, meer geschikt voor de fagocytose assay dan het gebruik van het uiten van EGFP schimmels of fluoresceïne-geëtiketteerden kralen maken van E. coli .
Met uiten van EGFP E. coli, kan een fagocytose assay gemakkelijk worden bereikt in 2 h en gemeten door beide stroom cytometry en fluorescentie microscopie, afhankelijk van het doel van de onderzoeker. Aangezien deze methode direct de fagocytische mogelijkheid meet, zijn de resultaten meer reproduceerbare dan andere indirecte methoden.
Deze methode is ook gevalideerd in een cellijn van RAW264.7 en perifere bloed mononucleaire cellen4. Onderstaande tekst de gedetailleerde stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van deze test en benadrukt de essentiële stappen die de onderzoekers wijzigen kunnen om te voldoen aan de behoeften van hun experimenten.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET SUMO Protein Expression system</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>Custom Gene Synthesis Service</td><td>Takara Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B&nbsp; Inverted Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a, &kappa;-isotype control</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution</td><td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr><tr><td>Thioglycollate medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie escherichia coli te beoordelen muis peritoneale macrophage fagocytose

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van een fagocytose assay. Het eerste deel van deze methode gaat om het bouwen van een huisdier-SUMO-EGFP vector (SUMO = kleine ubiquitin-achtige modifier) en uiting geven aan verbeterde groene fluorescentie eiwit (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). Uitdrukken van EGFP E. coli is coincubated met macrofagen gedurende 1 uur bij 37 ° C; de negatieve controlegroep is ge¨ uncubeerd op ijs de dezelfde hoeveelheid tijd. De macrofagen zijn klaar voor beoordeling. De voordelen van deze techniek bevatten zijn eenvoudig en duidelijk stappen en fagocytose kan worden gemeten door beide stroom cytometer en fluorescentie Microscoop. De uiting van EGFP E. coli zijn stabiel en een sterke fluorescentie signaal weergeven, zelfs nadat de macrofagen worden bevestigd met paraformaldehyde. Deze methode is niet alleen geschikt voor de beoordeling van macrofaag cellijnen of primaire macrofagen in vitro maar ook geschikt voor de evaluatie van granulocyt en monocyt fagocytose in perifere bloed mononucleaire cellen. Uit de resultaten blijkt dat het fagocytische vermogen van peritoneale macrofagen van jonge (acht weken oude) muizen hoger dan die van macrofagen van leeftijd (16-maand-oude) muizen is. Kortom, deze methode meet macrofaag fagocytose en is geschikt voor de bestudering van het aangeboren immuunsysteem.

De vector van het huisdier-SUMO maakt gebruik van een kleine ubiquitin-achtige modifier zodat de uitdrukking van inheemse proteïnen in de E. coli. SUMO fusion kan aanzienlijk vergroten de EGFP oplosbaarheid, waardoor ze gemakkelijk worden gedetecteerd. Als de expressie van EGFP met succes door lactose veroorzaakt wordt, kunnen groene kolonies worden waargenomen in het donker (figuur 1A). Groene stippen, die de uiting van EGFP E. coli vertegenwoor...

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van muis peritoneale macrofaag fagocytose met behulp van verbeterde groene fluorescentie eiwit-uiting van Escherichia coli.

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Dit protocol toonde een eenvoudige en reproduceerbare methode aan om het fagocytosevermogen van macrofagen te beoordelen met behulp van EGFP-uitdrukkende Escherichia coli. Hallo, mijn naam is Jun-Yu van het tweede ziekenhuis van dalian Medical University. Vandaag gaan we u een gemakkelijke en visualiseren van de manier om macrofaag fagocytose die gemakkelijk kan worden gedaan binnen twee uur te beoordelen.Deze methode werd veel gebruikt in de studie van de aangeboren immuunfunctie. Er wordt aangenomen dat aangeboren immuunfunctie intact bleef bij ouderen. Vandaag gaan we dus de buikvliesmacrofagen isoleren van de oude en jonge muizen en het fagocytische vermogen van deze twee groepen zien.Laten we beginnen. Ten eerste, synthetiseren van de EGFP gen fragment en kloon het fragment met behulp van high-fidelity Taq DNA polymerase. Ligate het PCR-product vervolgens in de pET SUMO-vector.Ten derde, zet de ligatieproducten om in de E.coli-stam en induceer EGFP uitdrukken met lactose. Deze EGFP-uitdrukkende E.coli diende als marker voor de fagocytosetest. Vervolgens werd een muis peritoneum macrofagen geïsoleerd en gekweekt.Vervolgens werden EGFP-uitdrukkende E.coli een uur lang met de macrofagen gemunt op 37 graden centigrees. Na de blusstap waren de macrofagen klaar voor beoordeling door zowel fluorescentiemicroscoop als stroomcytometer. Synthetiseer het EGFP-genfragment en versterk het fragment met een voorwaartse en omgekeerde primers met behulp van high-fidelity Taq DNA polymerase.Om ervoor te zorgen dat de PCR-producten in de volgende stap enkele drie-end adenine-overhangen voor TA-klonen hadden, wordt een verlenging van 30 minuten bij 72 graden centigrees na de laatste cyclus aanbevolen. Controleer het PCR-product op agarose gel elektroforese. Als het fragment correct is versterkt, kan een 717 bp-band op de gel worden waargenomen.Kloon het PCR-product in de pET SUMO-vector met behulp van de TA-kloonmethode met T4 DNA-ligase. Broed de reactie 30 minuten bij kamertemperatuur uit. Voeg vijf microliter pcr-product toe aan 100 microliter bl21-competente cellen.Verwarm schok de cellen op 42 graden centigrees gedurende 90 seconden, dan houd het mengsel op ijs gedurende drie minuten. Voeg 400 microliter LB medium toe, voorverwarmd op 37 graden centigrees. Schudden een uur bij 37 graden centigrees en 120 rpm.Inenting van de bacteriën op het oppervlak van LB plaat met 100 microgram per milliliter kanamycine om de vector getransformeerde E.coli scherm. Incubeer de plaat in de 37 graden centigrees oven 's nachts. Op de volgende dag, inenting een positieve kolonie in vijf milliliter van LB media met 100 microgram per milliliter kanamycine.Incubeer in de 37 graden centigrees schudden incubator op 120 rpm voor twee uur. Voeg vervolgens de inductor lactose toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimole per liter en blijf zes uur schudden, waardoor EGFP-expressie wordt ingeleid. Empirisch, bij het schudden van zes uur, kan de OD600 bereiken 0,7 of hoger.Ten slotte, met behulp van fluorescentie microscoop om de omvang van EGFP uitdrukken te verifiëren. Voeg 10 microliter van het bacteriemedium toe aan een dia. Dek af met een cover slip.Bestudeer de expressie van EGFP onder de fluorescentiemicroscoop. Voeg 3,5 gram thioglycollate toe in 100 milliliter gedestilleerd water. Steriliseren in autoclave voor gebruik.Aspirate de thioglycollate medium in de een milliliter steriele spuit in de kap. Een muis per spuit om de infectie te voorkomen. Injecteer een milliliter van 3,5% thioglycollate medium in de buikholte van de muis met behulp van een 23-gauge naald en onderhoud de muis met water en voedsel ad libitum gedurende drie dagen.Na drie dagen, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie na snel induceren anesthesie door sevoflurane in een gesloten doos. Doe vervolgens de muis in een schaal met 75% ethanol te steriel en snel over te brengen in de kap. Plaats de muis op de plaat en speld de voorpoot op het bord om de muispositie te bevestigen.Met behulp van een vijf-milliliter spuit met een 20-gauge naald, injecteren vijf milliliter koude PBS op de onderbuik in de muis peritoneale holte, het vermijden van puncturing de darm. Voer een zachte massage uit aan twee zijden van de muisbuik. Dan aspirate de buikvloeistof zachtjes en langzaam.Doe de buikvloeistof in een centrifugebuis van 50 milliliter. Herhaal deze stappen twee of drie keer. Centrifugeren de zwevende cellen gedurende 10 minuten bij 400 g in vier tot acht centigrade.Gooi de supernatant weg en verhoog de celpellet opnieuw in RPMI 1640 medium met 10% foetale runderserum. Voeg vijf miljoen cellen in elke put van de zes-put plaat voor de stroom cytometrie test en 500, 000 cellen per goed in een 24-put plaat voor fluorescentie microscoop. Kweek de cellen op 37 graden centigrees in een 5%koolstofdioxide incubator 's nachts.Het kweekmedium kan na drie uur worden vernieuwd om niet-loodzware cellen te verwijderen omdat de meeste van deze lymfocyten waren. Observeer de cellen onder een heldere veldmicroscoop om de levensvatbaarheid van de cel en de celdichtheid te evalueren. De hier getoonde afbeelding was in normale staat van de primaire cel.Meestal was de macrofaagceldichtheid niet hoog, omdat een groot deel van de buikcellen lymfocyten was. Verwijder het kweekmedium van de 24-put plaat. Voeg 100 microliter vers kweekmedium en 10 microliter van bacterieel medium toe.Dan incubeer de plaat op 37 graden centigrees in een 5%koolstofdioxide incubator voor een uur. Was voorzichtig met 500 microliter koude PBS per put drie tot vijf keer uit te wassen niet-geïnternaliseerde bacteriën. Incubeer de cellen met 4% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Was de cellen drie keer met PBS. Voeg phalloïden 633 conjugaat werkoplossing toe aan vlek F-actin. Bewaar op een donkere, vochtige plaats bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.Voeg dapi-werkoplossing toe om de celkern te bevlekken en vijf minuten in te broeden op een donkere plaats bij kamertemperatuur. Spoel één keer met PBS en eenmaal met hetzelfde volume in gedestilleerd water. De EGFP-uitdrukkende E.coli in het groen diende als marker van fagocytose.Als u experimentele fouten wilt minimaliseren en de resultaten een goede interpretatie wilt geven, stelt u groepen en controlebuizen in voor het experiment zoals vermeld in tabel 2. Voor de controlegroep die op het ijs wordt geplaatst, verwijder het medium van de zes-put plaat en was met PBS een keer. Voeg vervolgens 70 millimole per liter koude EDTA een milliliter in de put om de cellen los te maken en over te dragen in de stroom cytometrie buis.Voeg 50 microliter bacteriële suspensie toe aan de buis en leg deze een uur lang op het ijs. Voor de andere groepen, verwijder de cultuur medium, voeg een milliliter vers medium in elke put. Voeg 50 microliter bacteriën suspensie toe aan de putten volgens de groepsinstelling zoals beschreven in tabel twee.Plaats vervolgens de zes-put plaat in de 37 graden centigrees 5%kooldioxide incubator voor een uur. Om de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde E.coli te doven, voeg 200 microliter van 0,8% kristal violet water oplossing in de put en zwaaien binnenkort. Deze stap was bedoeld om vals positief resultaat van de EFP E.coli binding aan het oppervlak van de macrofagen te voorkomen, maar niet geïnternaliseerd.Was de cellen met PBS drie keer om eventuele resterende kristal violet te verwijderen. Voeg vervolgens 70 millimole per liter koude EDTA een milliliter in de put om de cellen los te maken en over te dragen in de stroom cytometrie buis. Centrifuge de buizen 2.000 rpm vijf minuten en gooi de supernatant.Voeg 100 microliter PBS toe om de cellen opnieuw op te maken. Voeg vijf microliter van F4 ATP geconjugeerd antilichaam in de buizen of isotype volgens de groepsinstelling. Vortex kort en incubeer de monsters op ijs gedurende vijf tot 10 minuten in het donker.Voeg een milliliter PBS in elke buis en centrifuge 2, 000 rpm vijf minuten. Gooi de supernatant weg. Resuspend de celpellets met 200 tot 300 microliter PBS voor flow cytometrie analyse.Voer elke buis uit en verwerf gegevens voor ten minste 10.000 gebeurtenissen van F4/80-positieve cellen. Hier zijn de fluorescentie beelden van buikvliesmacrofagen van de jonge en oudere groepen. De rode fluorescentie vertegenwoordigt F-actine.Het groen staat voor EGFP-uitdrukkende E.coli, en de blauwe vertegenwoordigt kern gekleurd door DAPI. Deze beelden suggereren dat macrofagen van de jonge muis een sterker fagocytisch vermogen hadden dan die van de oude muis. De F4/80-positieve en EGFP-positieve cellen wezen op het fagocytische vermogen van de macrofagen.Deze resultaten komen overeen met de trend van fluorescentie microscoop resultaten. Hoewel het aantal aangeboren immuuncellen kan behouden blijven in de oude muis, is het fagocytische vermogen aanzienlijk afgenomen in vergelijking met de jonge muis. Veel methoden zijn gebruikt om macrofaagfencytose te beoordelen.Hier tonen we een verbeterde methode die handig, snel en economisch haalbaar is. Met EGFP-uitdrukkende E.coli kan een fagocytosetest gemakkelijk worden uitgevoerd en gemeten door zowel flow cytometer als fluorescerende microscoop volgens de voorkeur van de onderzoeker. Ook meet deze methode direct de fagocytische capaciteit.De resultaten zijn reproduceerbaarder dan andere indirecte methoden.

using-enhanced-green-fluorescence-protein-expressing-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door...

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Electroporatie werd gebruikt om gezuiverde bacteriële virulentie-effectoreiwitten direct in levende eukaryote cellen te insereeren. De lokalisatie van eiwitten werd bewaakt door confocale immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt studies mogelijk over transport, functie en eiwit-eiwit-interacties met behulp van actieve exogene eiwitten, waardoor de noodzaak voor heterologe expressie in eukaryote cellen wordt vermeden.

Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Een gedetailleerd protocol voor een muismodel voor enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolonisatie met behulp van bacteriën bioluminescentie-label wordt gepresenteerd. Het opsporen van deze bioluminescente bacterie door een niet-invasieve in vivo imaging systeem in levende dieren kan verder ons huidige begrip van EHEC kolonisatie.

Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Wij rapporteren hier gemeenschappelijke methoden voor het analyseren van de fagocytische functie van lymfkliertest alveolaire macrofagen en bacteriële klaring van de Long. Deze methoden bestuderen in vitro fagocytose van fluoresceïne isothiocyanaat kralen en in vivo fagocytose van Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Ook beschrijven we een methode voor het ontruimen van P. aeruginosa bij muizen.

Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

Macrofagen, vooral primaire macrofagen, zijn uitdagend om te transfect als ze gespecialiseerd zijn in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. We beschrijven een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt met mRNA gegenereerd uit DNA-templates zoals plasmiden.

Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.

Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen

Leer een eenvoudige methode om fagocytose van peritoneale macrofagen te beoordelen met EGFP-expresserende Escherichia coli. Dit protocol vergelijkt jonge en oude muizen om immunologisch verouderen te bestuderen.

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose (Video) | JoVE Journal

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

Meer video's verkennen