Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

Dit protocol toonde een eenvoudige en reproduceerbare methode aan om het fagocytosevermogen van macrofagen te beoordelen met behulp van EGFP-uitdrukkende Escherichia coli. Hallo, mijn naam is Jun-Yu van het tweede ziekenhuis van dalian Medical University. Vandaag gaan we u een gemakkelijke en visualiseren van de manier om macrofaag fagocytose die gemakkelijk kan worden gedaan binnen twee uur te beoordelen.

Deze methode werd veel gebruikt in de studie van de aangeboren immuunfunctie. Er wordt aangenomen dat aangeboren immuunfunctie intact bleef bij ouderen. Vandaag gaan we dus de buikvliesmacrofagen isoleren van de oude en jonge muizen en het fagocytische vermogen van deze twee groepen zien.

Laten we beginnen. Ten eerste, synthetiseren van de EGFP gen fragment en kloon het fragment met behulp van high-fidelity Taq DNA polymerase. Ligate het PCR-product vervolgens in de pET SUMO-vector.

Ten derde, zet de ligatieproducten om in de E.coli-stam en induceer EGFP uitdrukken met lactose. Deze EGFP-uitdrukkende E.coli diende als marker voor de fagocytosetest. Vervolgens werd een muis peritoneum macrofagen geïsoleerd en gekweekt.

Vervolgens werden EGFP-uitdrukkende E.coli een uur lang met de macrofagen gemunt op 37 graden centigrees. Na de blusstap waren de macrofagen klaar voor beoordeling door zowel fluorescentiemicroscoop als stroomcytometer. Synthetiseer het EGFP-genfragment en versterk het fragment met een voorwaartse en omgekeerde primers met behulp van high-fidelity Taq DNA polymerase.

Om ervoor te zorgen dat de PCR-producten in de volgende stap enkele drie-end adenine-overhangen voor TA-klonen hadden, wordt een verlenging van 30 minuten bij 72 graden centigrees na de laatste cyclus aanbevolen. Controleer het PCR-product op agarose gel elektroforese. Als het fragment correct is versterkt, kan een 717 bp-band op de gel worden waargenomen.

Kloon het PCR-product in de pET SUMO-vector met behulp van de TA-kloonmethode met T4 DNA-ligase. Broed de reactie 30 minuten bij kamertemperatuur uit. Voeg vijf microliter pcr-product toe aan 100 microliter bl21-competente cellen.

Verwarm schok de cellen op 42 graden centigrees gedurende 90 seconden, dan houd het mengsel op ijs gedurende drie minuten. Voeg 400 microliter LB medium toe, voorverwarmd op 37 graden centigrees. Schudden een uur bij 37 graden centigrees en 120 rpm.

Inenting van de bacteriën op het oppervlak van LB plaat met 100 microgram per milliliter kanamycine om de vector getransformeerde E.coli scherm. Incubeer de plaat in de 37 graden centigrees oven 's nachts. Op de volgende dag, inenting een positieve kolonie in vijf milliliter van LB media met 100 microgram per milliliter kanamycine.

Incubeer in de 37 graden centigrees schudden incubator op 120 rpm voor twee uur. Voeg vervolgens de inductor lactose toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimole per liter en blijf zes uur schudden, waardoor EGFP-expressie wordt ingeleid. Empirisch, bij het schudden van zes uur, kan de OD600 bereiken 0,7 of hoger.

Ten slotte, met behulp van fluorescentie microscoop om de omvang van EGFP uitdrukken te verifiëren. Voeg 10 microliter van het bacteriemedium toe aan een dia. Dek af met een cover slip.

Bestudeer de expressie van EGFP onder de fluorescentiemicroscoop. Voeg 3,5 gram thioglycollate toe in 100 milliliter gedestilleerd water. Steriliseren in autoclave voor gebruik.

Aspirate de thioglycollate medium in de een milliliter steriele spuit in de kap. Een muis per spuit om de infectie te voorkomen. Injecteer een milliliter van 3,5% thioglycollate medium in de buikholte van de muis met behulp van een 23-gauge naald en onderhoud de muis met water en voedsel ad libitum gedurende drie dagen.

Na drie dagen, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie na snel induceren anesthesie door sevoflurane in een gesloten doos. Doe vervolgens de muis in een schaal met 75% ethanol te steriel en snel over te brengen in de kap. Plaats de muis op de plaat en speld de voorpoot op het bord om de muispositie te bevestigen.

Met behulp van een vijf-milliliter spuit met een 20-gauge naald, injecteren vijf milliliter koude PBS op de onderbuik in de muis peritoneale holte, het vermijden van puncturing de darm. Voer een zachte massage uit aan twee zijden van de muisbuik. Dan aspirate de buikvloeistof zachtjes en langzaam.

Doe de buikvloeistof in een centrifugebuis van 50 milliliter. Herhaal deze stappen twee of drie keer. Centrifugeren de zwevende cellen gedurende 10 minuten bij 400 g in vier tot acht centigrade.

Gooi de supernatant weg en verhoog de celpellet opnieuw in RPMI 1640 medium met 10% foetale runderserum. Voeg vijf miljoen cellen in elke put van de zes-put plaat voor de stroom cytometrie test en 500, 000 cellen per goed in een 24-put plaat voor fluorescentie microscoop. Kweek de cellen op 37 graden centigrees in een 5%koolstofdioxide incubator 's nachts.

Het kweekmedium kan na drie uur worden vernieuwd om niet-loodzware cellen te verwijderen omdat de meeste van deze lymfocyten waren. Observeer de cellen onder een heldere veldmicroscoop om de levensvatbaarheid van de cel en de celdichtheid te evalueren. De hier getoonde afbeelding was in normale staat van de primaire cel.

Meestal was de macrofaagceldichtheid niet hoog, omdat een groot deel van de buikcellen lymfocyten was. Verwijder het kweekmedium van de 24-put plaat. Voeg 100 microliter vers kweekmedium en 10 microliter van bacterieel medium toe.

Dan incubeer de plaat op 37 graden centigrees in een 5%koolstofdioxide incubator voor een uur. Was voorzichtig met 500 microliter koude PBS per put drie tot vijf keer uit te wassen niet-geïnternaliseerde bacteriën. Incubeer de cellen met 4% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Was de cellen drie keer met PBS. Voeg phalloïden 633 conjugaat werkoplossing toe aan vlek F-actin. Bewaar op een donkere, vochtige plaats bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.

Voeg dapi-werkoplossing toe om de celkern te bevlekken en vijf minuten in te broeden op een donkere plaats bij kamertemperatuur. Spoel één keer met PBS en eenmaal met hetzelfde volume in gedestilleerd water. De EGFP-uitdrukkende E.coli in het groen diende als marker van fagocytose.

Als u experimentele fouten wilt minimaliseren en de resultaten een goede interpretatie wilt geven, stelt u groepen en controlebuizen in voor het experiment zoals vermeld in tabel 2. Voor de controlegroep die op het ijs wordt geplaatst, verwijder het medium van de zes-put plaat en was met PBS een keer. Voeg vervolgens 70 millimole per liter koude EDTA een milliliter in de put om de cellen los te maken en over te dragen in de stroom cytometrie buis.

Voeg 50 microliter bacteriële suspensie toe aan de buis en leg deze een uur lang op het ijs. Voor de andere groepen, verwijder de cultuur medium, voeg een milliliter vers medium in elke put. Voeg 50 microliter bacteriën suspensie toe aan de putten volgens de groepsinstelling zoals beschreven in tabel twee.

Plaats vervolgens de zes-put plaat in de 37 graden centigrees 5%kooldioxide incubator voor een uur. Om de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde E.coli te doven, voeg 200 microliter van 0,8% kristal violet water oplossing in de put en zwaaien binnenkort. Deze stap was bedoeld om vals positief resultaat van de EFP E.coli binding aan het oppervlak van de macrofagen te voorkomen, maar niet geïnternaliseerd.

Was de cellen met PBS drie keer om eventuele resterende kristal violet te verwijderen. Voeg vervolgens 70 millimole per liter koude EDTA een milliliter in de put om de cellen los te maken en over te dragen in de stroom cytometrie buis. Centrifuge de buizen 2.000 rpm vijf minuten en gooi de supernatant.

Voeg 100 microliter PBS toe om de cellen opnieuw op te maken. Voeg vijf microliter van F4 ATP geconjugeerd antilichaam in de buizen of isotype volgens de groepsinstelling. Vortex kort en incubeer de monsters op ijs gedurende vijf tot 10 minuten in het donker.

Voeg een milliliter PBS in elke buis en centrifuge 2, 000 rpm vijf minuten. Gooi de supernatant weg. Resuspend de celpellets met 200 tot 300 microliter PBS voor flow cytometrie analyse.

Voer elke buis uit en verwerf gegevens voor ten minste 10.000 gebeurtenissen van F4/80-positieve cellen. Hier zijn de fluorescentie beelden van buikvliesmacrofagen van de jonge en oudere groepen. De rode fluorescentie vertegenwoordigt F-actine.

Het groen staat voor EGFP-uitdrukkende E.coli, en de blauwe vertegenwoordigt kern gekleurd door DAPI. Deze beelden suggereren dat macrofagen van de jonge muis een sterker fagocytisch vermogen hadden dan die van de oude muis. De F4/80-positieve en EGFP-positieve cellen wezen op het fagocytische vermogen van de macrofagen.

Deze resultaten komen overeen met de trend van fluorescentie microscoop resultaten. Hoewel het aantal aangeboren immuuncellen kan behouden blijven in de oude muis, is het fagocytische vermogen aanzienlijk afgenomen in vergelijking met de jonge muis. Veel methoden zijn gebruikt om macrofaagfencytose te beoordelen.

Hier tonen we een verbeterde methode die handig, snel en economisch haalbaar is. Met EGFP-uitdrukkende E.coli kan een fagocytosetest gemakkelijk worden uitgevoerd en gemeten door zowel flow cytometer als fluorescerende microscoop volgens de voorkeur van de onderzoeker. Ook meet deze methode direct de fagocytische capaciteit.

De resultaten zijn reproduceerbaarder dan andere indirecte methoden.