Name: High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Leer een high-throughput methode om latentie-omkerende agentia te evalueren op HIV-transcriptie en splicing. Deze techniek helpt onderzoekers virusreactivering en latent reservoir opheffing te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door projectsubsidie APP1129320 en program grant, APP1052979 van de NHMRC van Australië. Wij danken Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson en Michelle Y. Lee voor het verstrekken van essentiële constructies en advies voor de succesvolle voltooiing van dit werk. Wij danken het personeel van de DMI Flow faciliteit voor hun advies en genereuze bijstand bij het handhaven van de cytometer van de stroom gebruikt in deze studie.

Opmerking: Procedures voor het klonen, transformatie en sequencing zijn elders besproken18,19. Hierin de protocollen beginnen van de transfectie van de zoogdieren expressievectoren (Figuur 3).
1. de transfectie van HEK293T cellen met Dual Color verslaggever bouwen
<ol><li>Cultiveren van HEK293T cellen in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS), penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 μg/mL) in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Na het ontdooien, passage HEK293T cellen 2 - 3 keer voordat u ze gebruikt in Transfectie experimenten. Hierdoor zou de cellen-tijd om te herstellen van de dooiende procedure. Let op: Mycoplasma verontreiniging van celculturen blijft een ernstig probleem. Goede laboratoriumpraktijken en routinetests van celculturen zijn essentieel voor het risico van mycoplasma verontreiniging verminderen en voorkomen van verspreiding20.</li>
	<li>1:2 één dag vóór het zaaien van de cellen splitsen en ze vervolgens overbrengen naar verse DMEM medium. Cultiveren van de cellen gedurende 24 uur in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.</li>
	<li>De dag voor transfectie, verwijder het medium van de kolf door aspiratie en wassen van de cellen met Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) oplossing gratis calcium (Ca2 +) en magnesium (Mg2 +) om de sporen van het serum te verwijderen.</li>
	<li>Afzien van 5 mL trypsine-EDTA-oplossing (0,05% - 10 mM in PBS) in het schip van de cultuur en plaats deze bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 2 tot en met 5 min.</li>
	<li>Wanneer de cellen zijn vrijstaand, voeg 5 mL van DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS aan de trypsine-activiteit die de cellen beschadigen kan verder te remmen.</li>
	<li>Resuspendeer zachtjes door pipetteren de celsuspensie omhoog en omlaag te breken van de bosjes.</li>
	<li>De cellen 1:10 verdunnen in trypan blauwe vlek (0,4%).</li>
	<li>Tellen de levende cellen die doen niet innemen trypan blauw met behulp van een microscoop (10 x doelstelling) en een haemocytometer.</li>
	<li>Het aantal levensvatbare cellen per milliliter te berekenen door het nemen van het gemiddelde van het aantal cellen en vermenigvuldiging met 10.000 en door de verdunningsfactor (1:10) van de trypan blauwe vlekken.</li>
	<li>Plaat met 2 x 104 cellen in 100 μl van DMEM medium aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica in een 96-Wells flat-bodemplaat gedurende 24 uur.</li>
	<li>Voor elk putje, Verdun 400 ng van pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng van pCMV-RevNL4.3 en 100 ng van pCMV-Tat101AD8-vlag DNA in 50 μl van serum gratis medium. Meng voorzichtig. Voor experimenten zonder Tat, gebruikt u een overeenkomende lege Tat vector pcDNA3.1 (-). Opmerking: Het gebruik van endotoxinen-gratis DNA wordt sterk aanbevolen. Daarvoor, bereiden endotoxine-gratis DNA met behulp van een midi- of maxiprep nucleïnezuur zuivering kit. Bepalen de zuiverheid van DNA door het meten van de 260/280 OD ratio, die tussen de 1,7 en 1,9 moet.</li>
	<li>Meng het lipide-reagens zachtjes vóór gebruik, vervolgens verdund 0,65 μL in 50 μl van serum gratis medium. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De verdunde DNA te combineren met de verdunde lipide-reagens.</li>
	<li>Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De oplossing lijkt bewolkt. Opmerking: Ga verder met stap 1.15. binnen 30 min.</li>
	<li>Breng 100 μl per putje van de lipide reagens-DNA complexen drop-wise boven aan de cellen.</li>
	<li>Meng voorzichtig door de plaat heen en weer schommelen.</li>
	<li>
Incubeer de plaat voor 5 h in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
	<ol>
<li>Elke reactie mix is voldoende voor een transfectie één goed (96-Wells). Pas het bedrag en hoeveelheid componenten volgens het aantal drug en combinatie die zou worden getest en rekeningen voor pipetting variaties. Alle voorwaarden zijn meestal getest in triplicates.</li>
		<li>Extra putjes met 100 transfect ng van CMV-gedreven EGFP en DsRed-Express DNA plasmide ter compensatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. behandeling van Transfected HEK293T cellen met latentie omkering van agenten
Opmerking: Voorafgaand aan elke assay, de fysiologische toestand van elke LRA te bepalen door het meten van de levensvatbaarheid van de cellen na blootstelling aan hoge en lage dosis van het geneesmiddel met cel proliferatie test.
<ol><li>Verdun elk LRA om de juiste concentratie van het werken met groeimedium (b.v., 1 μM voor JQ1(+)). Let op: Reconstrueren de gelyofiliseerd drugs met de geschikt oplosmiddel tot een concentratie van 10 mM. Winkel al het materieel lokale en regionale overheden bij-80 ° C in één aliquot (elk 5 μl) gebruiken om te vermijden herhaalde cycli bevriezen-ontdooien.</li>
	<li>Zorgvuldig gecombineerd transfectie medium met een multichannel en vervangen met 100 μl medium dat passende LRA (tabel 1). Toevoegen van middellange zeer voorzichtig langs de muur van de waterput om te voorkomen dat het loskoppelen van de transfected cellen van de HEK293T, waarvan bekend is dat het eenvoudig loskoppelen van het oppervlak van de plaat cultuur.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.</li>
</ol>3. kleuring van Transfected cellen met corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof Stroom Cytometry p.a.
Let op: Het verwijderen van dode cellen en puin is essentieel om valse positieven te elimineren en te verkrijgen van de resultaten van de hoogste kwaliteit.
<ol><li>Loskoppelen van de cellen in de media met behulp van 100 μl-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per putje en door zachtjes pipetteren en neergaande (~ 5 keer) met een meerkanaals, terwijl het vermijden van schuimen van de media. Indien nodig, loskoppelen van de cellen van de plaat met behulp van 35 µL per putje trypsine-EDTA-oplossing (0,05% - 10 mM in PBS) en 5 minuten bij 37 ° C, het broeden voordat neutraliseren met medium dat serum.</li>
	<li>De cellen overbrengen in een 96-Wells-V-bodemplaat.</li>
	<li>Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 ° C, dan zorgvuldig de middellange/PBS gecombineerd zonder het aanraken van de cellen.</li>
	<li>Wassen van de cellen ten minste 1 keer met 200 μL van eiwit/serum gratis PBS.</li>
	<li>Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, dan Verwijder het supernatant door het kantelen van de plaat en het verwijderen van de was-buffer zonder het aanraken van de cellen.</li>
	<li>Een werkoplossing van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof bereid door verdunning van de levensvatbaarheid kleurstof 1:1000 in eiwit/serum gratis PBS. De verdunde vlek per putje 50 µL voor te bereiden. Opmerking: Levensvatbaarheid kleurstoffen zijn verkrijgbaar in een waaier van kleuren geschikt voor gebruik met blauw, rood en violet lasers. Bereid een stamoplossing van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof door de resuspending van één ampul van het gelyofiliseerd kleurstof (component A) met 50 μl watervrij DMSO (onderdeel B). Opslag bij-20 ° C in een éénpersoons gebruik aliquoot (1 μL elk), beschermd tegen het licht.</li>
	<li>Voeg 50 μl van de verdunde levensvatbaarheid kleurstof aan elk putje en meng de cellen door pipetteren op en neer met een multichannel.</li>
	<li>Vlek voor 10-15 min bij 4 ° C, beschermd tegen het licht.</li>
	<li>1 - 2 keer wassen met 150 μl van was buffer (PBS met 1% boviene serum albumine en 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Het herstellen van de cellen met de 100 μl van vers bereide 1% formaldehyde in was buffer voor 10-15 min bij 4 ° C in het donker. Let op: Formaldehyde is zeer giftig. Bereiden 1% formaldehyde-oplossing in een zuurkast te voorkomen van inademing terwijl het dragen van handschoenen en veiligheidsbril voor bescherming.</li>
	<li>Wassen van de cellen 1 - 2 keer met 100 μl van was buffer.</li>
	<li>Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 70 μL van was buffer. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Vaste cellen, kon de volgende dag op de stroom cytometer bij 4 ° C in het donker voor analyse worden opgeslagen.</li>
</ol>4. EGFP en DsRed metingen door Stroom Cytometry en Data-analyse
Opmerking: Analyseren HIV transcriptie (% EGFP) en DsRed splicing (%) op een cytometer van de stroom. Filteren van het monster vóór de vlucht met een 70 μm cel-zeef of 100 μm nylon gaas om te voorkomen dat verstopt raakt het mondstuk.
<ol><li>Opstarten van de cytometer en de computer ten minste 10 minuten vóór gebruik om lasers opwarmen.</li>
	<li>Voorafgaand aan de voorbeelden uitvoeren en data-acquisitie te beginnen, de schede tank vullen met zoutoplossing 0,9% en ervoor zorgen dat een tablet natriumhypochloriet is toegevoegd aan de afval tank.</li>
	<li>Controleer de stroom cel voor luchtbellen.</li>
	<li>Controleer of de detectoren en filters geschikt voor het experiment zijn. Opmerking: Voor EGFP, gebruik van de blauwe laser (488 nm) en 530/30 bandpass, terwijl DsRed Express optimaal wordt gedetecteerd met behulp van de gele laser (561 nm) en 610/20 bandpass. Een blauwe laser (488 nm) en 610/20 bandpass kan ook worden gebruikt om op te sporen van DsRed expressie.</li>
	<li>De prestaties van de cytometer en de gevoeligheid in detectoren controleren door kalibratie kralen uit te voeren.</li>
	<li>Aanpassen van de forward (FSC-A) en zijde (WS-A) scatter spanningen met onbevlekt monster zodat de grootste bevolking op het scherm is en duidelijk waarneembaar. Opmerking: FSC (Forward-strooilicht) is een meting van licht diffractie in een platte hoek, die afhangt van het volume van de cel (cel-oppervlakte of grootte), terwijl de wetenschappelijke stuurgroep (kant-verstrooid licht) is een meting van lichte diffractie in een rechte hoek, die evenredig is met granulariteit van de cel en interne complexiteit.</li>
	<li>Uitvoeren van handmatige of automatische compensatie met behulp van de single gebeitste monsters zorgen voor minimale spill-over van EGFP + bevolking in de DsRed detector en vice-versa. Let op: Gebruik een steekproef van de cellen, uiting geven aan elk van de enkele kleur TL proteïne evenals cellen afzonderlijk gekleurd met de kleurstof corrigeerbare levensvatbaarheid ter compensatie. Gebruik geen FITC en PE compensatie kralen voor EGFP en DsRed fluorescerende eiwitten compensaties door verschillende spectrale eigenschappen. Compensatie besturingselementen moet helder genoeg om op te lossen van positieve en negatieve bevolking.</li>
	<li>Maakt van de percelen en stelt de poorten met behulp van fluorescentie minus één (FMO) controles.</li>
	<li>Verwerven en minimaal 10.000 levensvatbare cellen evenementen per monster opnemen. Voorbeelden uitvoeren op medium of lage snelheid om te voorkomen dat paren passeren door het snijpunt van de laser. Gebruik pulse geometrie gating zoals WS-A versus SSC-H te elimineren paren. Controleer de stabiliteit van de run door het uitzetten van tijd versus SSC-A om te zien hoe zelfs de stroom is tijdens de run.</li>
	<li>Aan het einde van de termijn, de stroom cytometry fluidics met geconcentreerde reinigingsmiddelen schoon dan water voor elke 5 min.</li>
	<li>Afsluiten van het systeem, verwijderen de afvalstoffen en opnieuw vullen de tank van de schede na de overname.</li>
	<li>Het analyseren van de gegevens met behulp van een stroom cytometry data-analysesoftware. Cel puin en klomp (paren) op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter uitsluiten en elimineren van de dode cellen met behulp van de levensvatbaarheid kleurstof vlek (negatieve bevolking = levende cellen). Identificeren van de cellen, uiting van EGFP en DsRed (Figuur 4), alsmede het percentage van afgesplitste product DsRed /(DsRed + EGFP) (Figuur 5).</li>
	<li>Vaststellen van het effect van de LRA op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren door het vergelijken van onbehandelde cellen en de cellen die blootgesteld aan individu of een combinatie van lokale en regionale overheden (Figuur 5).</li>
</ol>

<ol><li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li>
<li>Khoury, G., et al. Ch. 8. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhoury%2C+G+%22HIV+vaccine+and+cure+-+The+Path+Towards+Finding+an+Effective+Cure+and+Vaccine%22">HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine</a>. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).</li>
<li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transcription+and+latency%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67(2013).</li>
<li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4%2B+T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li>
<li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li>
<li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+Vacc-4x%2C+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination%2C+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+%28REDUC%29%3A+a+single-arm%2C+phase+1B%2F2A+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panobinostat%2C+a+histone+deacetylase+inhibitor%2C+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy%3A+a+phase+1%2F2%2C+single+group%2C+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li>
<li>Søgaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li>
<li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodomain+and+extra-terminal+%28BET%29+bromodomain+inhibition+activate+transcription+via+transient+release+of+Positive+Transcription+Elongation+Factor+b+%28P-TEFb%29+from+7SK+small+nuclear+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).</li>
<li>Boehm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+bromodomain-targeting+compounds+reactivate+HIV+from+latency+via+a+Tat-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism.</a> Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).</li>
<li>Contreras, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+reactivates+HIV+from+latently+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development%3A+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li>
<li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071(2014).</li>
<li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected%2C+resting+CD4%28%2B%29+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li>
<li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li>
<li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+in+isolated+patient+CD4%2BT+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation%2C+completion%2C+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4%2BT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li>
<li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li>
<li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Linear+and+Discontinuous+Ribosome+Scanning+Are+Used+for+Translation+Initiation+from+Bicistronic+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+env+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs.</a> Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).</li>
<li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+detection+of+Mycoplasma+contamination+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).</li>
<li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+reversing+agents+act+through+Tat+post+translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications.</a> Retrovirology. 15 (1), 36(2018).</li>
<li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency%3A+experimental+systems+and+molecular+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li>
<li>Dahabieh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17(2014).</li>
<li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li>
<li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955(2015).</li>
<li>Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter-regulatory+region+of+the+major+immediate-early+gene+of+human+cytomegalovirus+responds+to+T-lymphocyte+stimulation+and+contains+functional+cyclic+AMP-response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements.</a> Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).</li>
<li>Reeves, M., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+human+cytomegalovirus+latency+and+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).</li>
<li>Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li>
<li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60(2011).</li>
<li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li>
<li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li>
<li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li>
<li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4%28%2B%29+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li>
<li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li>
<li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gezien de moeilijkheid in het meten van virus reactivering ex vivo, een breed scala van in vitro modellen werden ontwikkeld in de tijd om te bestuderen van HIV latentie met inbegrip van latent geïnfecteerd T-cellijnen (J-Lats, ACH2, U1), primaire modellen van latente infectie van de rust) O'Doherty, Lewin, Greene en Spina modellen) of pre-geactiveerde CD4 + T cellen (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modellen) met één ronde of replicatie bevoegde verslaggever virussen22. Om het model van de...

Ondanks op lange termijn effectieve antiretrovirale therapie aanhoudt HIV in een latente staat als een geïntegreerde provirus in geheugen CD4 + T cellen1. De structuur van de chromatine van de HIV-1-5' lang terminal herhalen (LTR) promotor en epigenetische aanpassingen zoals Histon methylation en deacetylation door DNA methyltransferases (DNMT) en Histon deacetylases (HDAC) zijn belangrijke mechanismen die leiden tot transcriptionele repressie en dus na integratie latency2,3. Een grote verscheidenheid van latency achteruitrijlicht agenten (lokale en regionale overheden) heeft onderzocht voor hun doeltreffendheid voor het opwekken van de virus productie in vitro en in vivo van latent geïnfecteerde rust CD4 + T cellen4,5,6,7 ,8. Onder de lokale en regionale overheden getest, HDACi (HDAC-remmers) en BET bromodomain remmers (BETis) veroorzaken chromatine-decondensation en de introductie van de positieve transcriptie rek factor b (P-TEFb) respectievelijk, wat leidt tot latere verlichten van de transcriptionele onderdrukking op de 5' LTR en activering van HIV expressie9,10,11,12,13. De omvang van reactivering bereikt door deze lokale en regionale overheden werd echter beperkt omdat slechts een bescheiden toename van cel-geassocieerde unspliced HIV mRNA (ons RNA), indicatieve van virale transcriptie, ex vivo14,15werd waargenomen. Belangrijk is dat deze lokale en regionale overheden ook niet voor het opwekken van een vermindering van de frequentie van latent geïnfecteerde cellen.
HIV expressie kan verder worden beperkt door inefficiënte splicing16 , alsmede gebreken in nucleaire export van vermenigvuldigen afgesplitste HIV RNA (MS RNA)17. Aldus, identificerende nieuwe klassen van lokale en regionale overheden die krachtiger en kunnen invloed hebben op verschillende aspecten van de virus productie na integratie nodig zijn. Daarnaast is de ontwikkeling van nieuwe tests die helpen met het bepalen van de optimale verbindingen om om te keren efficiënt latency is vereist.
Hier, wordt een protocol gepresenteerd, die gebruik maakt van een benadering van de hoge gegevensdoorvoer voor functionele beoordeling van het effect van interventies op HIV LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren. Kortom, een nieuwe LTR-gedreven dual color verslaggever systeem pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figuur 1) wordt gebruikt om te beoordelen van HIV reactivering stroom cytometry. In deze TL verslaggever leidt de uitdrukking van mRNA van unspliced HIV (4 kb) tot verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) expressie, terwijl de expressie van afgesplitste mRNA (2 kb) tot de fluorescerende eiwituitdrukking Discosoma sp. rood (DsRed leiden zou). Kort, gebruikten we een fluorescerende Env-EGFP fusieproteïne, gp140unc. EGFP, waar de codering opeenvolging van EGFP werd geplaatst in frame met een VN-gekloofd en afgekapte vorm van de envelop (Env). Wijzigingen aangebracht aan de breukzijde voorkomen de dissociatie van Env in gp120 en gp41-EGFP lasertherapie en afkappen van het eiwit gp160 voorafgaand aan de transmembrane domein maakt een oplosbare Env analoog, dat de juiste vouwen vergemakkelijkt en expressie van EGFP. Op de expressie in een cel, Rev lokaliseert aan de kern waar het bemiddelt de nucleaire-cytoplasmatische export van de 4 kb env mRNA via de interactie met het rev responsief element (RRE). Het afkappen van Env doet geen afbreuk aan de RRE, die tussen gp120 gp41 en de A7 3' splice site ligt. In dit systeem, splicing bij HIV-1 splice donor 4 (SD4) en splice acceptor 7 (SA7) resulteert in de productie van een 2 kb mRNA codering van een niet-functionele Rev eiwit afgebroken op aminozuur 38 gesmolten aan DsRed TL proteïne, RevΔ38-DsRed. Kort, DsRed werd ingevoegd in de 2nd exon van Rev op aminozuur 38 overlapping extensie18. Om te vergemakkelijken de nucleaire export van unspliced mRNA, was mede een vector van de zoogdieren expressie codering Rev (pCMV-RevNL4.3) transfected met de fluorescerende verslaggever construct (Figuur 2). Deze unieke verslaggever constructie hier beschreven is nuttig in high-throughput beoordeling van HIV transcriptie, egaliseren en lamineren, zonder de noodzaak om het gebruik van virale vectoren.

<table><tbody><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellen (Human Embryonic Kidney cellen)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Repliceert vectoren die het SV40 replicatiegebied dragen.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>+ 4,5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Natrium Pyruvaat</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>Herkomst Australië</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS), zonder calcium, zonder magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw Kleurmiddel, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%), fenol rood</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipide transfectiereagens</td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x) medium met verminderd serum</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Serumvrij medium</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Marcherey-Nagel</td><td>740414.50</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 plasmid</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>6085-1</td><td>Expressie van EGFP in zoogdiercellen, CMVIE promotor.</td></tr><tr><td>pDsRed-Express-N1</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>632429</td><td>Expressie van DsRed-Express in zoogdiercellen, CMVIE promotor.</td></tr><tr><td>pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed</td><td>Addgene</td><td>115775</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-RevNL4.3</td><td>Addgene</td><td>115776</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td><td>Addgene</td><td>115777</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Millipore</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>JQ1(+)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11187</td><td>Voorraad bij 10 mM in DMSO; werkconcentratie 1 &mu;M</td></tr><tr><td>JQ1(-)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11232</td><td>Voorraad bij 10 mM in DMSO; werkconcentratie 1 &mu;M</td></tr><tr><td>Phorbol Myristaat Acetaat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td>Voorraad bij 100 &mu;g/mL in DMSO; werkconcentratie 10 nM</td></tr><tr><td>Phytohemagglutinine (PHA)</td><td>Remel</td><td>HA15/R30852701</td><td>Voorraad bij 1 &mu;g/ &mu;L in PBS; werkconcentratie 10 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Vorinostat (VOR)</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009929</td><td>Voorraad bij 10 mM in DMSO; werkconcentratie 0,5 &mu;M</td></tr><tr><td>Panobinostat (PAN)</td><td>TRC</td><td>P180500</td><td>Voorraad bij 10 mM in DMSO; werkconcentratie 30 nM</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Celproliferatie Assay</td><td>Promega</td><td>63581</td><td></td></tr><tr><td>Venor GeM Classic</td><td>Minerva Biolabs</td><td>11-1100</td><td>Mycoplasma Detectie Kit, PCR-gebaseerd</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia voor stromocytometrie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer (4 lasers-blauw, rood, violet en geel)</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer (3 lasers-blauw, rood en violet)</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34976</td><td>Viabiliteitskleurstof: voor 633 of 635 nm excitatie, 400 assays. Component A en B worden beide in de kit geleverd.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5M pH8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Oplossing 37/10 (37%)</td><td>Chem-Supply</td><td>FA010</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva CS&amp;T Research Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>Calibratiekleurballen</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow Calibratie Deeltjes (8 pieken)</td><td>BD Biosciences</td><td>559123</td><td>3,0 - 3,4 mm</td></tr><tr><td>Omhullingsoplossing</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>90 g NaCl in 10 L water</td></tr><tr><td>HAZ-Tabs</td><td>Guest Medical</td><td>H8801</td><td>Chloor vrijgevende tabletten voor desinfectie</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td>N/A</td><td>Geconcentreerde reinigingsmiddelen voor flow cytometer. Werkoplossing Decon 90 5%.</td></tr><tr><td>Natriumhypochloriet (12-13% Oplossing)</td><td>Labco</td><td>SODHYPO-5L</td><td>Geconcentreerde reinigingsmiddelen voor flow cytometer. Werkoplossing bleekmiddel 1%.</td></tr><tr><td>7x</td><td>MPBio</td><td>IM76670</td><td>Geconcentreerde reinigingsmiddelen voor flow cytometer. Werkoplossing 7x 1%.</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefselcultuurkolven (75 cm2, schuin hals, geventileerde dop)</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Weefselcultuur platen (96 wel plat bodem met deksel)</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Weefselcultuur platen (96 wel V-bodem zonder deksel)</td><td>Costar</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (10 mL)</td><td>SARSTEDT</td><td>62.9924.284</td><td>100x16 mm</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (50 mL)</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>30x115 mm</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen (1,5 mL)</td><td>Corning Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr>

high throughput in vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op hiv transcriptie, egaliseren en lamineren

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV blijft ongeneeslijke als gevolg van het bestaan van een reservoir van cellen die havens stabiel en latente vorm van het virus, dat blijft onzichtbaar voor het immuunsysteem en is niet gericht door de huidige antiretrovirale therapie (cART). Transcriptie, egaliseren en lamineren is aangetoond dat de versterking van de latentie van de HIV-1 bij rust CD4 + T cellen. Omkering van latentie door het gebruik van latency omkering agenten (lokale en regionale overheden) bij de aanpak van "schok en kill" uitvoerig is onderzocht in een poging om te zuiveren van dit reservoir maar heeft tot nu toe niet aangetoond met enig succes in klinische proeven als gevolg van het gebrek aan ontwikkeling van voldoende kleine moleculen die efficiënt dit reservoir kunnen erover. Het hier gepresenteerde protocol biedt een methode voor betrouwbaar en efficiënt beoordeling van latency omkering agenten (lokale en regionale overheden) op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van een LTR-gedreven dual kleur verslaggever die het effect van een LRA op transcriptie, egaliseren en lamineren gelijktijdig kunt meten van stroom cytometry. Het protocol hier beschreven is geschikt voor zowel Adherente cellen als de cellen in suspensie. Het is handig voor het testen van een groot aantal drugs in een hoge doorvoer systeem. De methode is technisch eenvoudig te implementeren en rendabel. Bovendien is het gebruik van stroom cytometry zodat kan worden nagegaan van de levensvatbaarheid van de cellen en dus drug toxiciteit op hetzelfde moment.

Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 5 voor de expressie van HIV-1 unspliced (EGFP) en verbinding aan de randen (DsRed) producten na behandeling met bromodomain-remmer JQ1. Zowel JQ1(+) als Tat aanzienlijk verhoogd het percentage cellen uiten van EGFP (2.18 en 4.13 FC over DMSO respectievelijk; n = 3) indicatieve van unspliced afschriften. Bovendien JQ1(+) aanzienlijk verhoogd het percentage cellen uiten van DsRed (46.6 FC over DMSO) evenal...

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Het algemene doel van deze procedure is het beoordelen van in vitro, de impact van latentie omkeringsmiddelen op HIV mRNA-verwerking. Het protocol biedt een eenvoudige efficiënte en betrouwbare methode voor het beoordelen, tegelijkertijd het effect van LRA op HIV-transcriptie en splicing. Deze techniek gaf inzicht in het vermogen van LRA's om virusreactivering en klaring van het latente reservoir te induceren.Na het kweken van cellen, plaats 20,000 van hen in 100 microliters van DMEM medium, aangevuld met 10%FBS, en zonder antibiotica in de putten van een 96-goed platte bodemplaat voor 24 uur. De volgende dag verdunnen de dubbele kleur verslaggever constructie. Tat en Rev DNA in 50 microliters van serum vrij medium, en meng zachtjes.Meng het lipidereagens voorzichtig en verdun er vervolgens 0,65 microliter van per reactie in 50 microliter serumvrij medium. Meng zachtjes, en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Combineer het verdunde lipidereagens met het verdunde DNA en meng voorzichtig.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Dan, afzien van 100 microliters van deze lipide reagens DNA-complex daling verstandig, op de top van de cellen in elke put. Rock de plaat zachtjes heen en weer om te mengen.En de plaat in een bevochtigde couveuse uitbroeden, bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende vijf uur. Daarna transfect extra putten met 100 nanogram van CMV gedreven EGFP en DsRed express DNA plasmid voor compensatie doeleinden. Om te beginnen verdunt u elk latentieomkeversmiddel naar de juiste werkvoorwaarde met groeimedium.Met behulp van een multi-channel pijpkop, zorgvuldig aspirate de transfectie medium, en vervang het door 100 microliter van medium met de juiste latentie omkeringsmiddel. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37%celsius met 5% kooldioxide gedurende 48 uur. Om te beginnen vlekken op de cellen, gebruik maken van een multi-channel pijp kop om 100 microliters van PBS toe te voegen aan elke put.Voorzichtig pijp hoofd op en neer ongeveer vijf keer. Terwijl ervoor te zorgen om te voorkomen dat schuimen om de cellen los te maken in de media. Breng vervolgens de cellen over in de putten van een 96-put V-bodemplaat.Centrifuge bij 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Het medium en pbs aanzuigen zonder de cellen aan te raken. Was de cellen ten minste eenmaal met 200 microliter eiwit- en serumvrije PBS.Centrifuge bij 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Kantel de plaat om de supernatant weg te gooien en verwijder de wasbuffer zonder de cellen aan te raken. Daarna verdunnen de vaste levensvatbaarheid kleurstof in eiwit en serum vrije PBS bij een verhouding van 1 tot 1000, om een werkende oplossing voor te bereiden.Voeg 50 microliter van de verdunde kleurstof aan elke put, en pijp hoofd op en neer te mengen. Incubeer bij vier graden Celsius. Terwijl beschermd tegen licht met behulp van folie gedurende 10 tot 15 minuten.Was vervolgens de cellen een of twee keer met 150 microliter wasbuffer. Na deze, centrifuge op 500 keer zwaartekracht, en vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Om de cellen te repareren, voeg 100 microliters van vers bereide 1%formaldehyde en was buffer.En uitbroeden op vier graden Celsius, terwijl beschermd tegen licht voor 10 tot 15 minuten. Daarna was je de cellen een of twee keer met 100 microliters wasbuffer. Centrifuge bij 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en spoel de celpellet opnieuw op in 70 microliter wasbuffers. Na het controleren van de cytometer instellingen prestaties en gevoeligheid door het uitvoeren van kalibratie kralen, pas de voorwaartse en zijverstrooiing spanningen met onbevlekt monster, zodat de belangrijkste populatie is op het scherm en duidelijk waarneembaar. Voer handmatige of automatische compensatie uit met behulp van de enkel gekleurde monsters, zodat de EGFP-positieve populatie minimaal wordt overgemorst in de DsRed-detector en vice versa.Met behulp van de fluorescentie minus een controles, maak percelen en stel de poorten. Pas vervolgens de voorwaartse en zijverstrooiingsspanningen aan met niet-vastgehouden monster, zodat de hoofdpopulatie op het scherm en duidelijk waarneembaar is. Verwerf en nota van minimaal 10.000 levensvatbare celgebeurtenissen per monster.Gebruik hierna flow cytometrie gegevensanalysesoftware om de gegevens te analyseren zoals beschreven in het tekstprotocol. Representatieve resultaten voor de expressie van HIV-1, niet-gespreste en gespleten producten, na behandeling met de bromodomain-remmer JQ1, tonen aan dat zowel JQ1-positief als Tat het percentage cellen dat EGFP uitdrukt, aanzienlijk verhogen. Wat wijst op niet-gespreede transcripties.JQ1 positief wordt ook gezien om het percentage cellen uitdrukken DsRed aanzienlijk te verhogen. En verhoog het aandeel van het gespleten product tot vergelijkbare niveaus als Tat. Dit bevestigt het vermogen van JQ1 positief om hiv-transcriptie en splicing in te schakelen.Echter, behandeling met een stereoisomer controle JQ1 negatief, schaft de JQ1 positief effect op HIV transcriptie en splicing. Eenmaal onder de knie, deze methode kan worden uitgevoerd met behulp van geneesmiddelen individueel of in combinatie. Testen op hun vermogen om efficiënt te synergiseren.Wat zou leiden tot een lagere dosis van het medicijn en toxiciteit. Na elke ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor het testen van efficiënte medicijncombinaties in primaire modellen van latentie in ex vivo patiëntmonsters.

high-throughput-vitro-assessment-latency-reversing-agents-on-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Uncoating is een essentiële stap in de vroege fase van de HIV-1 levenscyclus en wordt gedefinieerd als de demontage van het capside shell en de vrijlating van de virale ribonucleoproteïne complex (vRNP). Hier tonen we technieken voor het isoleren van intacte kernen van HIV-1 virionen en voor de kwantificering van hun...

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

HIV-1-pathogenese wordt bepaald door zowel virale kenmerken als genetische factoren van de gastheer. Hier beschrijven we een robuuste methode die reproduceerbare metingen mogelijk maakt om de impact van de gag gensequentieverschil op de in vitro replicatiecapaciteit van het virus te beoordelen.

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em&gt; In vitro</em&gt; Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Dit rapport beschrijft een in vitro test voor het meten van de human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegratiecomplex (PIC)-geassocieerde integratie-activiteit in de cytoplasmatische extracten van acuut geïnfecteerde cellen. De integratie van PIC-geassocieerd HIV-1 DNA in heteroloog doel-DNA wordt gekwantificeerd door middel van een geneste real-time polymerasekettingreactiestrategie.

Meting van In Vitro Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Dit protocol biedt een methode om vast te stellen gehumaniseerd muizen (hu-NSG) via Intrahepatische injectie van menselijke hematopoietische stamcellen in straling-geconditioneerd neonatale NSG muizen. De hu-NSG muis is gevoelig voor HIV-infectie en combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en dient als een geschikt pathofysiologisch model voor HIV-replicatie en latentie onderzoeken.

Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Hier beschrijven we enkele gevestigde methoden om endoplasmatisch reticulum (ER) stress en activering van ongevouwen eiwitrespons (UPR) te bepalen, met bijzondere nadruk op HIV-1-infectie. Dit artikel beschrijft ook een reeks protocollen om het effect van ER-stress/UPR op HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken.

Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie

Leer een high-throughput methode om latentie-omkerende agentia te evalueren op HIV-transcriptie en splicing. Deze techniek helpt onderzoekers virusreactivering en latent reservoir opheffing te bestuderen.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

Meer video's verkennen