Name: Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Leer de expressie en zuivering van het menselijke TRPC3-ionkanaal voor structurele analyse met cryo-elektronenmicroscopie. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor eiwitbiochemie en biofysica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken G. Zhao en X. Meng voor de ondersteuning bij het verzamelen van de gegevens op de David Van Andel geavanceerde Cryo-Elektron microscopie Suite. Wij waarderen de VARI High-Performance Computing team voor computationele steun. Wij geven onze dankbaarheid aan N. Clemente, D. contributie, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth en Z. Ruan voor opmerkingen die sterk verbeterd dit manuscript. Wij danken D. Nadziejka voor redactionele ondersteuning voor dit manuscript. Dit werk werd gesteund door interne VARI financiering.

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li>
<li>Kumar, R., Thompson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+parathyroid+hormone+secretion+and+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+control+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium control of neurotransmitter release.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353(2012).</li>
<li>Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TRPC+Channels+in+Store-Operated+Calcium+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).</li>
<li>Smyth, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+regulation+of+store-operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation and regulation of store-operated calcium entry.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-Operated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Store-Operated Calcium Channels.</a> Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).</li>
<li>Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC1+is+required+for+functional+store-operated+Ca2%2B+channels.+Role+of+acidic+amino+acid+residues+in+the+S5-S6+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).</li>
<li>Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-activated+Ca2%2B+influx+via+human+Trp3+stably+expressed+in+human+embryonic+kidney+%28HEK%29293+cells.+Evidence+for+a+non-capacitative+Ca2%2B+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trp%2C+a+novel+mammalian+gene+family+essential+for+agonist-activated+capacitative+Ca2%2B+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry.</a> Cell. 85 (5), 661-671 (1996).</li>
<li>Itsuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensing+phosphatase+reveals+temporal+regulation+of+TRPC3%2FC6%2FC7+channels+by+membrane+phosphoinositides%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides.</a> Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+binding+sites+for+calmodulin+and+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+on+the+carboxyl+termini+of+trp+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).</li>
<li>Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC+channels+in+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">TRPC channels in smooth muscle cells.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).</li>
<li>Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+TRPC3-dependent+cation+current+through+the+neurotrophin+BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF).</a> Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).</li>
<li>Becker, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+screening+of+the+TRPC3+gene+in+cerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia.</a> Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).</li>
<li>Kitajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC3+positively+regulates+reactive+oxygen+species+driving+maladaptive+cardiac+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling.</a> Scientific Reports. 6, 37001(2016).</li>
<li>Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+channel+C3+contributes+to+the+progression+of+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer.</a> Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+cation+3+channel+regulates+melanoma+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration.</a> Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).</li>
<li>Xia, M., Liu, D., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC3%3A+A+New+Target+for+Therapeutic+Strategies+in+Chronic+Pain-DAG-mediated+Activation+of+Non-selective+Cation+Currents+and+Chronic+Pain+%28Mol+Pain+2014%3B10%3A43%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogastroenterology+and+Motility%22%5BJournal%5D)">TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43).</a> Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).</li>
<li>Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+lipid-gated+cation+channel+TRPC3%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3.</a> Elife. 7, e36852(2018).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+to+identify+membrane+protein+expression+and+crystallization+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions.</a> Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gctf%3A+Real-time+CTF+determination+and+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Gctf: Real-time CTF determination and correction.</a> Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frealign%3A+An+Exploratory+Tool+for+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
<li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frealign%3A+An+Exploratory+Tool+for+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Green, E. M., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilization%2C+Expression%2C+Purification%2C+and+Crystallization+of+the+Human+Serotonin+Transporter+Bound+to+S-citalopram%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54792(2016).</li>
<li>Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+from+the+source%3A+endogenous+preparations+of+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).</li>
<li>Bayburt, T. H., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Protein+Assembly+into+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Membrane Protein Assembly into Nanodiscs.</a> FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).</li>
<li>Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-microscopy+structure+of+a+human+TRPM4+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel.</a> Nature. 552, 200-204 (2017).</li>
<li>Autzen, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359 (6372), 228-232 (2017).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).</li>
<li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).</li>
<li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-free+purification+of+ABC+%28ATP-binding-cassette%29+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters.</a> Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Structurele bepaling van eiwitten door cryo-EM heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van structurele biologie in de afgelopen jaren, dankzij de ontwikkeling van nieuwe camera's en algoritmen waarmee u aanzienlijk sneller kunt de structuurbepaling van proteïnen toe die niet gemakkelijk crystalize, met name membraaneiwitten. Ondanks al de recente vooruitgang in de cryo-EM-techniek blijft de voorbereiding van gezuiverde eiwitten voldoende kwaliteit en kwantiteit te vergemakkelijken van hoogwaardige imaging vaak u...

Calcium is betrokken bij de meest cellulaire processen, waaronder signalering cascades, transcriptie controle, neurotransmitter release en hormoon molecuul synthese1,2,3. De homeostatische onderhoud van cytosolische vrij calcium is essentieel voor de gezondheid en functie van cellen. Een van de belangrijkste mechanismen van intracellulair calcium-homeostase is calcium winkel bediende ingang (SOCE), een proces waarin uitputting van calcium in het endoplasmatisch reticulum (ER) triggers de opening van de ionenkanalen op het plasma-membraan opgeslagen te vergemakkelijken de aanvulling ER calcium, die vervolgens kunnen worden gebruikt in de verdere signalering4,5,6. Voorbijgaande receptor mogelijke kanalen (TRPCs), die calcium-permeabele kanalen die behoren tot de superfamilie TRP, hebben geïdentificeerd als een belangrijke deelnemer in SOCE7,8,9 .
Onder de zeven leden in de familie van de TRPC, TRPC3, TRPC6 en TRPC7 vormen een deelgroep van de homologe en ze zijn uniek in de mogelijkheid om te worden geactiveerd door de lipide secundaire messenger diacylglycerol (DAG), een afbraakproduct van de Lipide signalering phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2)10,11. TRPC3 is sterk uitgedrukt in gladde spieren en in de cerebrale en cerebellaire gebieden van de hersenen, waar het essentiële rol in het calcium signalering die van invloed zijn transmissie en neurogenese12,13speelt. Dysfunctie van TRPC3 is gekoppeld aan het centrale zenuwstelsel-stoornissen, cardiovasculaire aandoeningen en bepaalde kankers zoals ovariële adenocarcinoom14,15,16. Daarom, TRPC3 houdt belofte als farmaceutische doel voor de behandeling van deze ziekten. De ontwikkeling van gerichte geneesmiddelen op TRPC3 heeft is beperkt door een gebrek aan begrip van de activering van de moleculaire mechanismen, met inbegrip van lipide bindende sites17,18. Biedt belangrijke inzichten in deze mechanismen19, hebben we de eerste atomaire resolutie structuur van het menselijke TRPC3 kanaal (hTRPC3) en haar twee lipide bandplaatsen in een gesloten toestand, gemeld.
De belangrijkste factor voor het bepalen van de structuur van een membraan eiwit op hoge resolutie is voor eiwitten van hoge kwaliteit. De overeenkomstige screening van expressie en zuivering voorwaarden tot het verkrijgen van hoge kwaliteit proteïne kan een tijdrovende en dure inspanning. Hier presenteren we een protocol beschrijft in detail hoe wij de optimale omstandigheden voor de expressie en de zuivering van hTRPC3, die zich slecht in onze eerste screening gedragen te identificeren. Wij presenteren verschillende belangrijke punten over het oplossen en optimaliseren van het gedrag van de eiwitten, die een solide basis voor onze cryo-Elektron microscopie (cryo-EM) studies leggen. We gebruiken een gemodificeerde baculoviral vector (pEG), ontwikkeld door Gouaux en collega's, dat is geoptimaliseerd voor screening tests en efficiënte generatie baculovirus in zoogdiercellen20genereren. Deze expressie-methode is geschikt voor snelle en kostenefficiënte overexpressie van eiwitten in de celmembraan van zoogdieren. Wij combineren het gebruik van deze vector met een fluorescentie-detectie grootte-uitsluiting chromatografie-gebaseerde (FSEC) methode21prescreening. Deze methode maakt gebruik van een tag van de groen fluorescente proteïne (GFP) gefuseerd tot de constructie van belang en verbetert de visualisatie van de doel-proteïne in kleine, hele-cel ontbindend monsters. Dit zorgt voor screening van eiwitstabiliteit in aanwezigheid van verschillende detergentia en additieven, met thermostabilizing mutaties, en maakt het gebruik van een klein aantal cellen uit kleinschalige voorbijgaande transfectie. Op deze manier kan een veelheid van voorwaarden snel worden gescreend alvorens tot een grootschalige eiwitreiniging. Naar aanleiding van meningsuiting, screening en zuivering presenteren we een protocol voor het verkrijgen en verwerken van beelden uit cryo-EM voor het genereren van een DOVO structurele bepaling van het eiwit. Wij zijn van mening dat de hier beschreven aanpak als een gegeneraliseerd protocol voor structurele studies van TRP kanaal receptoren en andere membraaneiwitten dienen zal.

<table><tbody><tr><td>pEG BacMam vector (pFastBacI)</td><td>addgene</td><td>31488</td><td></td></tr><tr><td>DH10&alpha; cellen</td><td>Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. media</td><td>Corning</td><td>46003CR</td><td>voor transformatie van DH10&alpha; cellen voor Bacmid</td></tr><tr><td>Bacmam kweekplaten</td><td>Teknova</td><td>L5919</td><td>voor kweek van getransformeerde DH10&alpha; cellen</td></tr><tr><td>Incubatieschuddel voor bacteriële cellen</td><td>Infors HT</td><td>Multitron standard</td><td></td></tr><tr><td>Incubeerbare orbitale schuddel voor insectencellen</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>CO2 tafelincubator voor zoogdiercellen</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3951</td><td></td></tr><tr><td>Orbische tafelschuddel</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SHKE416HP</td><td>gebruikt in CO2 tafelincubator voor zoogdiercellen</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>1535</td><td>voor bacteriële platen</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>voor plasmida extractie en zuivering</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Isoamyl alcohol</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td><td>voor DNA extractie</td></tr><tr><td>Sf9 cellen</td><td>Life Technologies</td><td>12659017</td><td>insectencellen voor virusproductie</td></tr><tr><td>Sf-900 media</td><td>Gibco</td><td>12658-027</td><td>insectencel media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Gibco</td><td>10362100</td><td>voor het transfecteren van insectencellen</td></tr><tr><td>lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>voor het transfecteren van zoogdiercellen</td></tr><tr><td>0,2 mm spuitfilter</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>voor het filteren van P1 virus</td></tr><tr><td>0,2 mm filterkolven 500ml reservoir</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>voor het filteren van P2 virus</td></tr><tr><td>erlenmeyer kweekkolf (platte bodem 2L)</td><td>Gene Mate</td><td>F-5909-2000</td><td>voor het kweken van insectencellen</td></tr><tr><td>erlenmeyer kweekkolf (met roerwerk 2L)</td><td>Gene Mate</td><td>F-5909-2000B</td><td>voor het kweken van zoogdiercellen</td></tr><tr><td>nanodrop 2000 spectrofotometer</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>voor het bepalen van DNA- en eiwitconcentraties</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td>zoogdiercellen voor het produceren van eiwitten</td></tr><tr><td>Freestyle 293 expressie Medium</td><td>Gibco</td><td>1238-018</td><td>zoogdiercel media voor eiwitexpressie</td></tr><tr><td>Butyric Acid Sodium Salt</td><td>Acros</td><td>263195000</td><td>om eiwitexpressie te versterken</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Acros</td><td>215740500</td><td>proteaseremmer</td></tr><tr><td>Aprotinin uit runderlong</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-100MG</td><td>proteaseremmer</td></tr><tr><td>Leupeptin hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24125-16-4</td><td>proteaseremmer</td></tr><tr><td>pepstatine A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2671-250</td><td>proteaseremmer</td></tr><tr><td>digitonine</td><td>EMD Millipore</td><td>300410</td><td>detergens - om eiwitten uit membranen op te lossen</td></tr><tr><td>imidazool</td><td>Sigma</td><td>792527</td><td>om eiwitten uit resin kolom te elueren</td></tr><tr><td>TALON resin</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>voor affiniteitszuivering door His-tag</td></tr><tr><td>superose6 incease kolommen</td><td>GE</td><td>29091596; 29091597</td><td>voor HPLC en FPLC</td></tr><tr><td>Prominence Modular HPLC Systeem</td><td>Shimadzu</td><td>Zie hieronder</td><td></td></tr><tr><td>Controller Module</td><td>"</td><td>CBM20A</td><td></td></tr><tr><td>Solvent Delivery System</td><td>"</td><td>LC30AD</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie Detector</td><td>"</td><td>RF20AXS</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler met Koelsysteem</td><td>"</td><td>SIL20ACHT</td><td></td></tr><tr><td>Pure FPLC Systeem met Fractiecollector</td><td>Akta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>thrombine (alfa)</td><td>Haematologic Technologies Incorporated</td><td>HCT-0020 Human alfa</td><td>voor het afsnijden van GFP tag</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugale filterbuis</td><td>Millipore</td><td>UFC910008</td><td>voor het concentreren van eiwitten</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>E478500</td><td>voor het stabiliseren van eiwitten</td></tr><tr><td>400 mesh koolstof gecoate koperroosters</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>01754-F</td><td>roosters voor negatieve kleuring</td></tr><tr><td>Quantifoil gaatjeskoolstof rooster (goud, 1,2/1,3&thinsp;&mu;m grootte/gat afstand, 300 mesh)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q3100AR1.3</td><td>roosters voor Cryo-EM</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI</td><td></td><td>voor het voorbereiden van roosters door vloeibare ethaan bevriezing</td></tr><tr><td>vloeibare stikstof</td><td>Dura-Cyl</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>ethaan gas</td><td>Airgas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Solarus Plasma Systeem</td><td>Gatan</td><td>Model 950</td><td>voor het schoonmaken van roosters voordat monsters worden bevroren</td></tr><tr><td>Tecnai Spirit elektronenmicroscoop</td><td>FEI</td><td></td><td>voor negatieve kleuring EM beeldvorming</td></tr><tr><td>Talos Arctica elektronenmicroscoop</td><td>FEI</td><td></td><td>voor screening en laag resolutie beeldvorming van Cryo-EM roosters</td></tr><tr><td>Titan Krios elektronenmicroscoop</td><td>FEI</td><td></td><td>voor hoge resolutie Cryo-EM beeldvorming</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gautomatch software</td><td>http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/</td><td></td><td>om deeltjes uit micrografieën te selecteren</td></tr><tr><td>Relion 2.1 software</td><td>https://github.com/3dem/relion</td><td></td><td>om 2D en 3D classificatie te construeren</td></tr><tr><td>CryoSPARC software</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td><td>om een ​​initieel structuurmodel te genereren</td></tr><tr><td>Frealign software</td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td><td></td><td>om deeltjes te verfijnen</td></tr><tr><td>Coot software</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td><td></td><td>om een ​​model te bouwen</td></tr><tr><td>MolProbity software</td><td>http://molprobity.biochem.duke.edu/</td><td></td><td>om de geometrie

meningsuiting en zuivering van de trpc3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door single-deeltje cryo-elektronenmicroscopie

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Voorbijgaande receptor mogelijke kanalen (TRPCs) van de canonieke TRP onderfamilie zijn opvangfaciliteiten catie kanalen die een essentiële rol bij de calcium-homeostase, met name op de winkel bediende calcium ingang, die is van cruciaal belang spelen voor het behoud van de goede werking van Synaptic vesikel release en intracellulaire signaalroutes. Dienovereenkomstig, TRPC kanalen zijn betrokken in een verscheidenheid van ziekten bij de mens met inbegrip van cardiovasculaire aandoeningen zoals hypertrofie van het hart, neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson en neurologische aandoeningen zoals spinocerebellar ataxie. Daarom, TRPC kanalen vertegenwoordigen een potentieel farmacologische doelwit in ziekten bij de mens. De moleculaire mechanismen van het gating in deze kanalen zijn echter nog onduidelijk. De moeilijkheid in het verkrijgen van grote hoeveelheden van stabiele, homogene en gezuiverde proteïne is een beperkende factor in structuur vastberadenheid studies, met name voor zoogdieren membraaneiwitten zoals de ionenkanalen TRPC geweest. Hier presenteren we een protocol voor de grootschalige uitdrukking van zoogdieren ion kanaal membraaneiwitten met behulp van een gemodificeerde baculovirus systeem voor de overdracht van de genen en de zuivering van deze proteïnen door affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie. Verder presenteren we een protocol voor het verzamelen van single-deeltje cryo-Elektron microscopie beelden van gezuiverde eiwit en deze om beelden te gebruiken om te bepalen van de eiwitstructuur. Structuurbepaling is een krachtige methode voor het begrijpen van de mechanismen van gating en functie in ionenkanalen.

Een schematisch overzicht van het protocol voor expressie en reiniging van hTRPC3 wordt getoond in figuur 1A. Een afbeelding van de hTRPC3 bacmid plaat met ideale witte kolonies, vergelijkbaar met degene geselecteerd voor de zuivering van de DNA van de bacmid, wordt getoond in figuur 1B. We vonden dat 48u is ideaal voor duidelijke Bluo-gal kleuring met behoud van de aanwezigheid van geïsoleerde kolonies. Piek productie van P2 vir...

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Dit protocol stelde ons in staat om de structuur van de menselijke TRPC3 op te lossen, een lid van een belangrijke, maar onderbestudiede familie van ionenkanalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge efficiëntie waarmee het kan worden toegepast om een verscheidenheid aan eiwitten uit te drukken en te zuiveren, voor zowel structurele als functionele studies. Deze methode kan zorgen voor een efficiënt eiwitexpressie- en zuiveringssysteem, voor gebruik bij het bestuderen van eiwitbiochemie en biofysica en kan worden toegepast op een breed scala aan ionenkanalen en andere membraaneiwitten.Controleer eerst de relatieve virusexpressie door de GFP-fluorescentie van het virus te bekijken in een monster van de virusproducerende cultuur. Bereid in een verbijsterde bodem Erlenmeyer-kweekkolf van voldoende grootte een gewenst volume van een HEK293 zoogdiercelsuspensiecultuur voor, bij een concentratie van 3,5 tot 3,8 miljoen cellen per milliliter in het expressiemedium, aangevuld met 1%steriele FBS. Voeg 8% in volume van voorbereide P2 virus voorraad oplossing en incubaal in een Orbital Shaker op 37 graden Celsius en 135 RPM.Voeg bij 12 tot 18 uur na infectie 10 millimolar natrium butyraat toe, incubeer bij 30 graden Celsius voor de hoeveelheid tijd die nodig is voor een optimale eiwitexpressie. Daarna, centrifugeren op 2, 880 keer zwaartekracht gedurende 20 minuten om de cellen te oogsten. Was en resuspend de cellen in ongeveer 100 milliliter tbs per liter cellen geoogst.Centrifuge opnieuw op 2, 880 keer zwaartekracht gedurende 20 minuten en het verzamelen van de cel pellet. Verzamel ook kleine, een milliliter cel pellet oogsten op verschillende tijdstippen en oplos gedurende twee uur op vier graden Celsius met agitatie in aanwezigheid van verschillende detergenten en / of additieven. Verhelder deze kleine hele cel oplosmonsters door ultracentrifugatie bij 235,000 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Voer ze vervolgens uit als 30 microlitermonsters op een SEC Chromatografiekolom, om de beste tijd voor expressie en de beste oplosomstandigheden te bepalen. Ontdooi de pellet in 100 milliliter buffer per liter geoogste cellen. Zodra de cellen ontdooid zijn, pipet of roer ze om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is.Laat de cellen oplosen op vier graden Celsius in een beker ondergedompeld in ijs voor twee uur, terwijl wordt geroerd door een roerstaaf. Verwijder vervolgens elk celpuin door ultracentrifugatie bij 235,000 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius gedurende een uur. Voer een monster van 30 microliter van het supernatant uit op een SCC-kolom van HPLC om de eiwithoeveelheid te verifiëren en het doeleiwit te visualiseren door GFB-signaaloutput.Breng de kobaltaffiniteit hars gebonden supernatant met het oplosbare eiwit aan op een zwaartekrachtkolom en verzamel de flow-through. Voer een monster van 30 microliter van de doorstroom uit op een SCC-kolom om te controleren of het eiwit aan de hars bindt. Was vervolgens de hars met 10 kolomvolumes buffer.Voer een monster van 30 microliter van de was op een SCC-kolom om te controleren op eiwitverlies. Met behulp van buffer, elute de hars gebonden menselijke TRPC3. Voer een monster van 90 microliter uit van het eluant dat één tot 100 op een SSC-kolom is verdund om te controleren of het eiwit is geëuterd en om de aanwezigheid van een GFP-signaal te verifiëren op de positie die overeenkomt met de beoogde eiwitgrootte.Voeg Trombin toe bij een verhouding van één tot 20 molar en voeg 10 millimolars EDTA toe aan het geëuterde monster. Incubeer op vier graden Celsius gedurende drie uur. Breng hierna de eluant over naar een 15 milliliter centrifugaalfilterbuis.Draai de buis op 2,800 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius in stappen van vijf minuten om de eluant te concentreren op 500 microliters of minder. Pipette de eiwitoplossing op en neer tussen spins om het eiwit opnieuw op te zetten en te voorkomen dat u zich concentreert. Laad het concentraat in buffer op een SSC-kolom.Run snelle eiwit vloeibare chromatografie en het verzamelen van 300 microliter fracties. Combineer vervolgens de piekfracties die de TRPC3-tetramer bevatten, zoals gevisualiseerd door het UV-absorptiesignaal. En concentreer je opnieuw tot een laatste concentratie van minstens vijf milligram per milliliter.De menselijke TRPC3 is hele cel oplosbaar in een verscheidenheid van detergenten met een kritische micelle concentratie van 0,01 tot 20 micromolars, en werd uitgevoerd in een DDM / CHS met buffer. Hoewel DDM/CHS de hoogste oplosbaarheid van menselijke TRPC3 laat zien, lijkt de piekpositie te groot om de tetrameric human TRPC3 te zijn. Na de oplosing van hele cellen wordt het cellysepuin verwijderd en wordt het oplosbare eiwit op een SSC-kolom geladen en uitgevoerd op HPLC in DDM/CHS-wasmiddel dat buffer bevat, om de absolute oplosbaarheid en piekvolume van menselijke TRPC3 onder verschillende omstandigheden te vergelijken ten opzichte van een TRPM4-controle.Alle verschillende wasmiddel oplosbaar TRPC3 monsters tonen piekposities rond 11,9 milliliter die waarschijnlijk te groot is omdat de tetramerische vorm van de menselijke TRPC3 heeft een kleiner moleculair gewicht dan de positieve menselijke controle TRPM4. Vervolgens worden twee verschillende oplosbare en lopende buffers met DDM/CHS en digitonin getest. Het eiwit loopt in buffer met digitonin levert de hoogste piek op in een redelijke positie ten opzichte van de positieve controle.Terwijl een kleinschalige zuivering met behulp van 25 milliliter cellen verschillende brede pieken toont, vertoont het eiwit kenmerken van een enkel tetramerisch menselijk TRPC3-kanaal in 2D-classificatie door negatieve vlek. Additieven worden vervolgens gescreend op basis van het fysiologische karakter van menselijke TRPC3. EDTA toont een opmerkelijke invloed op het stabiliseren van menselijke TRPC3 in een intacte tetrameric piekpositie en aanzienlijk verhoogd het aantal deeltjes in de cryo-EM micrograaf en verminderde het lawaai op de achtergrond.De kwaliteit van de uiteindelijke resultaten hangt af van een goede probleemoplossing van de FSCC profielen op HPLC. En bij het voltooien van alle zuiveringsstappen snel, idealiter in een enkele dag. Structurele bepaling, het genereren van antilichamen en functionele studies zoals bindende tests of elektrofysiologie kunnen na deze procedure worden uitgevoerd.Deze techniek kan en is aangepast om andere ionenkanalen en eiwitfamilies te bestuderen en gezuiverde eiwitten te produceren voor toepassingen die verder gaan dan structurele bepaling. De juiste voorzorgsmaatregelen voor het beheer van de celcultuur biohazards zoals het werken in een laminaire stroom kap, het dragen van beschermende kleding, en goed verwijderen van afval, moet worden genomen.

expression-purification-human-lipid-sensitive-cation-channel-trpc3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

Heterologe expressie en zuivering van het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) zijn belangrijke uitdagingen en beperkende factoren in de ontwikkeling van geneesmiddelen therapieën voor cystic fibrosis. Dit protocol beschrijft twee werkwijzen voor de isolatie van milligram hoeveelheden CFTR voor functionele en structurele studies.

Zuivering van het Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator eiwit dat tot expressie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Dit manuscript beschrijft hoe om te screenen op thermostabilizing mutaties, zuiveren de menselijke serotonine transporter, het genereren van antilichamen met hoge affiniteit, en kristalliseren de serotonine transporter antilichaam-complex gebonden aan het antidepressivum citalopram S. Dit protocol kan worden aangepast aan de studie van andere uitdagende membraantransporteiwitten, receptoren en kanalen.

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

Leer de expressie en zuivering van het menselijke TRPC3-ionkanaal voor structurele analyse met cryo-elektronenmicroscopie. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor eiwitbiochemie en biofysica.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Meer video's verkennen