Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Dit protocol stelde ons in staat om de structuur van de menselijke TRPC3 op te lossen, een lid van een belangrijke, maar onderbestudiede familie van ionenkanalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge efficiëntie waarmee het kan worden toegepast om een verscheidenheid aan eiwitten uit te drukken en te zuiveren, voor zowel structurele als functionele studies. Deze methode kan zorgen voor een efficiënt eiwitexpressie- en zuiveringssysteem, voor gebruik bij het bestuderen van eiwitbiochemie en biofysica en kan worden toegepast op een breed scala aan ionenkanalen en andere membraaneiwitten.

Controleer eerst de relatieve virusexpressie door de GFP-fluorescentie van het virus te bekijken in een monster van de virusproducerende cultuur. Bereid in een verbijsterde bodem Erlenmeyer-kweekkolf van voldoende grootte een gewenst volume van een HEK293 zoogdiercelsuspensiecultuur voor, bij een concentratie van 3,5 tot 3,8 miljoen cellen per milliliter in het expressiemedium, aangevuld met 1%steriele FBS. Voeg 8% in volume van voorbereide P2 virus voorraad oplossing en incubaal in een Orbital Shaker op 37 graden Celsius en 135 RPM.

Voeg bij 12 tot 18 uur na infectie 10 millimolar natrium butyraat toe, incubeer bij 30 graden Celsius voor de hoeveelheid tijd die nodig is voor een optimale eiwitexpressie. Daarna, centrifugeren op 2, 880 keer zwaartekracht gedurende 20 minuten om de cellen te oogsten. Was en resuspend de cellen in ongeveer 100 milliliter tbs per liter cellen geoogst.

Centrifuge opnieuw op 2, 880 keer zwaartekracht gedurende 20 minuten en het verzamelen van de cel pellet. Verzamel ook kleine, een milliliter cel pellet oogsten op verschillende tijdstippen en oplos gedurende twee uur op vier graden Celsius met agitatie in aanwezigheid van verschillende detergenten en / of additieven. Verhelder deze kleine hele cel oplosmonsters door ultracentrifugatie bij 235,000 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Voer ze vervolgens uit als 30 microlitermonsters op een SEC Chromatografiekolom, om de beste tijd voor expressie en de beste oplosomstandigheden te bepalen. Ontdooi de pellet in 100 milliliter buffer per liter geoogste cellen. Zodra de cellen ontdooid zijn, pipet of roer ze om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is.

Laat de cellen oplosen op vier graden Celsius in een beker ondergedompeld in ijs voor twee uur, terwijl wordt geroerd door een roerstaaf. Verwijder vervolgens elk celpuin door ultracentrifugatie bij 235,000 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius gedurende een uur. Voer een monster van 30 microliter van het supernatant uit op een SCC-kolom van HPLC om de eiwithoeveelheid te verifiëren en het doeleiwit te visualiseren door GFB-signaaloutput.

Breng de kobaltaffiniteit hars gebonden supernatant met het oplosbare eiwit aan op een zwaartekrachtkolom en verzamel de flow-through. Voer een monster van 30 microliter van de doorstroom uit op een SCC-kolom om te controleren of het eiwit aan de hars bindt. Was vervolgens de hars met 10 kolomvolumes buffer.

Voer een monster van 30 microliter van de was op een SCC-kolom om te controleren op eiwitverlies. Met behulp van buffer, elute de hars gebonden menselijke TRPC3. Voer een monster van 90 microliter uit van het eluant dat één tot 100 op een SSC-kolom is verdund om te controleren of het eiwit is geëuterd en om de aanwezigheid van een GFP-signaal te verifiëren op de positie die overeenkomt met de beoogde eiwitgrootte.

Voeg Trombin toe bij een verhouding van één tot 20 molar en voeg 10 millimolars EDTA toe aan het geëuterde monster. Incubeer op vier graden Celsius gedurende drie uur. Breng hierna de eluant over naar een 15 milliliter centrifugaalfilterbuis.

Draai de buis op 2,800 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius in stappen van vijf minuten om de eluant te concentreren op 500 microliters of minder. Pipette de eiwitoplossing op en neer tussen spins om het eiwit opnieuw op te zetten en te voorkomen dat u zich concentreert. Laad het concentraat in buffer op een SSC-kolom.

Run snelle eiwit vloeibare chromatografie en het verzamelen van 300 microliter fracties. Combineer vervolgens de piekfracties die de TRPC3-tetramer bevatten, zoals gevisualiseerd door het UV-absorptiesignaal. En concentreer je opnieuw tot een laatste concentratie van minstens vijf milligram per milliliter.

De menselijke TRPC3 is hele cel oplosbaar in een verscheidenheid van detergenten met een kritische micelle concentratie van 0,01 tot 20 micromolars, en werd uitgevoerd in een DDM / CHS met buffer. Hoewel DDM/CHS de hoogste oplosbaarheid van menselijke TRPC3 laat zien, lijkt de piekpositie te groot om de tetrameric human TRPC3 te zijn. Na de oplosing van hele cellen wordt het cellysepuin verwijderd en wordt het oplosbare eiwit op een SSC-kolom geladen en uitgevoerd op HPLC in DDM/CHS-wasmiddel dat buffer bevat, om de absolute oplosbaarheid en piekvolume van menselijke TRPC3 onder verschillende omstandigheden te vergelijken ten opzichte van een TRPM4-controle.

Alle verschillende wasmiddel oplosbaar TRPC3 monsters tonen piekposities rond 11,9 milliliter die waarschijnlijk te groot is omdat de tetramerische vorm van de menselijke TRPC3 heeft een kleiner moleculair gewicht dan de positieve menselijke controle TRPM4. Vervolgens worden twee verschillende oplosbare en lopende buffers met DDM/CHS en digitonin getest. Het eiwit loopt in buffer met digitonin levert de hoogste piek op in een redelijke positie ten opzichte van de positieve controle.

Terwijl een kleinschalige zuivering met behulp van 25 milliliter cellen verschillende brede pieken toont, vertoont het eiwit kenmerken van een enkel tetramerisch menselijk TRPC3-kanaal in 2D-classificatie door negatieve vlek. Additieven worden vervolgens gescreend op basis van het fysiologische karakter van menselijke TRPC3. EDTA toont een opmerkelijke invloed op het stabiliseren van menselijke TRPC3 in een intacte tetrameric piekpositie en aanzienlijk verhoogd het aantal deeltjes in de cryo-EM micrograaf en verminderde het lawaai op de achtergrond.

De kwaliteit van de uiteindelijke resultaten hangt af van een goede probleemoplossing van de FSCC profielen op HPLC. En bij het voltooien van alle zuiveringsstappen snel, idealiter in een enkele dag. Structurele bepaling, het genereren van antilichamen en functionele studies zoals bindende tests of elektrofysiologie kunnen na deze procedure worden uitgevoerd.

Deze techniek kan en is aangepast om andere ionenkanalen en eiwitfamilies te bestuderen en gezuiverde eiwitten te produceren voor toepassingen die verder gaan dan structurele bepaling. De juiste voorzorgsmaatregelen voor het beheer van de celcultuur biohazards zoals het werken in een laminaire stroom kap, het dragen van beschermende kleding, en goed verwijderen van afval, moet worden genomen.