Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

Spinnende schijf TIRF-microscopie kan een nuttig hulpmiddel zijn voor het bestuderen van de rol van eiwit tijdens cytoskeletale netwerkvorming. Deze techniek toegestaan driedimensionale beeldvorming van snelle cellulaire benaderingen die zich voordoen in de cel en op hetzelfde de precieze lokalisatie van fluorescentie molecuul die worden geplaatst op het plasmamembraan. Deze methode kan inzicht geven in onderzoeksgebieden zoals microbiologie, celbiologie en al die takken waar het belangrijk is om de interactie tussen het plasmamembraan en de cellulaire omgeving te bestuderen.

Deze methode kan worden uitgebreid tot die live imaging experimenten waar het belangrijk is om de structuren in het plasmamembraan te lokaliseren en waar u ook een hoge resolutie van het resterende cellulaire volume wilt behouden. De cruciale dingen die men moet overwegen zijn de keuze van de juiste cellijn om de TIRF-verlichting en de andere beeldvormingsparameters in te stellen en de focus van de transfected cellen te vinden. De visuele demonstratie van dit protocol zou zeker helpen om problemen met de behandeling van de cellen tijdens beeldverwerving te voorkomen.

Twee dagen voorafgaand aan het experiment, zaad 3,000 HELA of NIH 3T3 cellen in twee milliliter van volledige groei medium in elk goed van een zes-goed cel kweekplaat. De volgende dag, bereid de transfectie reagentia. Verdun eerst een microgram RFP Livact en één microgram YFP Vinculin in een totaal van 200 microliter met verlaagd serummedium.

Vortex de transfectie reagens kort. Voeg vervolgens vier microliter van het mengsel toe aan 200 microliter DNA. Vortex de reagentia weer en vervolgens inculbateren van de transfectie mix voor 15 tot 20 minuten op kamertemperatuur.

Voeg na incubatie de gehele transfectiemix drop-wise direct toe aan de cellen. Meng de putten door het schudden van de plaat en plaats terug in de couveuse. Op de dag van het experiment, bereid het monster voor live beeldvorming door eerst coating een 35 millimeter glazen bodem schotel met een 10 microgram per milliliter oplossing van Fibronectin in PBS.

Laat de oplossing 30 minuten op kamertemperatuur staan en laat de schotel drogen. Vervolgens verdun een 0,1 micron diameter multi-fluorescerende kraal oplossing om een dichtheid van 1,8 miljard deeltjes per milliliter in gedestilleerd water. Voeg de oplossing gedurende 30 tot 60 seconden toe aan het glasoppervlak met Fibronectin-gecoate laag.

Verwijder vervolgens de oplossing en laat de schotel de lucht drogen. Precoating van de gerechten met fluorescerende kralen is slechts nodig om twee redenen, eerst als u wilt het TIRF-vlak te vinden voordat het zaaien van de cellen of om een tweekleurige kraal afbeelding te verwerven voor beeldregistratie. Bereid nu een anti-oxiderend groeimedium voor door 0,1 molaire ascorbinezuuroplossing toe te voegen bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 millimolar in groeimedium.

Verwarm de media voor door het in een waterbad van 37 graden Celsius te plaatsen. Was vervolgens de cellen met twee milliliter PBS en voeg 250 microliter trypsin EDTA toe aan elke put van de plaat. Broed de cellen bij 37 graden Celsius in en wacht twee tot drie minuten tot de cellen volledig zijn losgemaakt.

Resuspend de cellen zorgvuldig in een milliliter van voorverwarmde anti-oxiderende groeimedium en voeg ze toe aan een extra vier milliliter van het medium in een 15 milliliter celkweekbuis. Plaats de celsuspensie met een licht geopend deksel in een couveuse op 37 graden Celsius gebufferd met 5%kooldioxide. Om te beginnen, start de milieucontrole van de microscoop om stabiele celcultuurvoorwaarden te bereiken.

Plaats vervolgens de glazen bodemschotel met een milliliter voorverwarmd antioxiderend groeimedium in de monsterhouder van de voorverwarmde microscoop. Vervolgens, in de imaging software, het opzetten van de acquisitie-instellingen op de microscoop. Stel het aankooptijdinterval in op 30 seconden en de duur op 60 tot 90 minuten.

Activeer ook de autofocusfunctie van de op hardware gebaseerde autofocus voor elk tijdpunt door de waarde op één in te stellen. Pas nu de camerabelichting aan op 200 milliseconden, het versterkingsniveau tot 500 en de laserkracht tot 20% voor elk kanaal. Hoge versterkingsniveaus, lage belichtingstijd en een laag laservermogen worden aanbevolen om de fototoxiciteit te verminderen.

Stel vervolgens de Z-stack voor de draaiende schijfkanalen in op 10 micron met een afstand van 0,4 micron en stel vervolgens de onderste offset in op nul, zodat het laagste vlak de focuspositie van de hardwareautofocus is en de Z-stacks voor de TIRF-kanalen deactiveert. Activeer ten slotte de posities in de functiefase van meerdere punten. Hierdoor kunnen maximaal drie posities worden geregistreerd over een interval van 30 seconden.

Zoek nu de fluorescerende kralen met epifluorescente verlichting, activeer één TIRF-kanaal en stel de verlichtingshoek in op een waarde die TIRF-verlichting aanduidt. Activeer vervolgens de autofocus door op de knop in het microscooppaneel te drukken en de focus aan te passen met het offsetwiel. Eenmaal in focus, het verwerven van een twee-gekleurde data set met behulp van TIRF 488 en TIRF 561 voor latere kraal-gebaseerde beeldregistratie.

Verwijder de cellen uit de couveuse en meng de celsuspensie door de gesloten buis twee tot drie keer om te keren. Breng vervolgens een milliliter van de cellen aan op de beeldvormingsschotel. Vind snel dubbele doorgeïnfecteerde cellen met lage epifluorescente verlichting.

Eenmaal gevonden, centreer de cellen in de live camera preview met behulp van heldere-veld verlichting en markeer de positie. Zoek dan een extra een tot twee punten van belang, sla ze op de posities lijst en beginnen met het verwerven van gegevens door te klikken op de volgorde knop. In het begin kunnen de cellen gemakkelijk losmaken als gevolg van de fasebeweging, dus het is beter om vier tot vijf posities in te stellen en later een of twee te verwijderen.

Om een registratievrije hyperstack in Fiji te genereren, u eerst het meegeleverde bestand SD-TIRF_helper_jove downloaden en opslaan. ijm in de Fiji submap macro's. Voer de macro uit door op de menuopdracht te klikken die met plugins begint dan macro's en definitief wordt uitgevoerd.

Als de kleurkanalen registratiecorrectie nodig hebben, selecteert u de optie en maakt u een nieuwe verwijzing naar registratie op basis van kralen, een oriëntatiepuntbestand genoemd. Importeer vervolgens de gegevens met de importeur van bioformaten en kies hyperstack als weergaveoptie. Laad de afbeeldingsgegevensset, selecteer de draaiende schijfreeks in de eerste stap en de TIRF-serie in de tweede stap.

Op dit punt zal Fiji de gegevens weergeven die zijn gesorteerd op kanaal- en podiumpositie. Pas de registratiecorrectie toe op de respectieve kanalen door het vooraf bepaalde oriëntatiepuntbestand te laden. Selecteer vervolgens de gewenste kleuropzoektabel voor elke draaiende schijf en TIRF-kanaal en voeg ze samen tot één multidimensionale hyperstack.

Tijdens de verwerking van de TIRF-afbeeldingen worden een aantal zed-vlakken aan het onderste vlak toegevoegd en dit nummer komt overeen met het aantal vlakken in de draaiende schijfgegevenssets. Dat is erg belangrijk voor de visuele weergave van de uiteindelijke hyperstack. Met behulp van de setup beschreven in deze video, YFP en RFP-uitdrukkende cellen werden geselecteerd en hun hechtingsproces waargenomen tijdens een 60-minuten timelapse.

Zoals verwacht, cellen waren ronde gevormd en slechts zwak aanhangend aan het begin met membraan uitsteeksels sensing de omgeving en het maken van contact met het substraat. Het contact van de celmatrix versterkte snel bij vorming van zogenaamde ontluikende verklevingen. In de loop van de tijd, hechting complexen vergroot en gerijpt tot focale verklevingen.

Deze langwerpige structuren waren hoofdzakelijk duidelijk bij de periferie van de cel. Dit was het gevolg van krachten die werden uitgeoefend door actomyosinevezels die de versterking van celmatrixverklevingen en de bundeling van actinevezels veroorzaakten. De cel ook afgevlakt als gevolg van de actin netwerkvorming.

De aanschafsnelheid is afhankelijk van de volgende parameters, het tijdsinterval, de belichtingstijd, het aantal zed-vlakken en het aantal posities. Het is dus erg belangrijk om deze parameters te optimaliseren voor hoge acquisitiepercentages. De implementatie van de nieuwste draaiende schijf technologie zal draaien draaien schijf TIRF microscopie in nieuwe super resolutie microscopie techniek die het mogelijk maakt beeldvorming bij hoge temporele snelheden.

Spinnen schijf microscopie is een zeer krachtige techniek voor het bestuderen van processen die zich voordoen tussen de cel interieur en het celmembraan. We hebben aangetoond dat we de dynamiek van vesicle kunnen volgen door het verwerven van zeer grote beeldstapels binnen enkele seconden. Collimated laserlicht is gevaarlijk voor de ogen.

Kijk nooit rechtstreeks in de straal en gebruik de veiligheidsmaatregelen van het instrument om directe blootstelling aan licht te voorkomen.