Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro

Deze methode kan helpen bij het begrijpen van belangrijke vragen in het gebied van immuuncelmigratie, zoals hoe het cytoskelet schuifkrachten stuurt en hoe integrin liganden en chemokines de door stroom veroorzaakte migratie van leukocyten beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nieuw type migratietest is dat gemakkelijk is voor beginners om uit te voeren. Het maakt alleen gebruik van commercieel beschikbare apparatuur en reagentia, evenals vrije software.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in marginale zone B-cellen, kan deze ook worden toegepast op andere immuuncellen, zoals geactiveerde T-cellen. Ontdooi op de dag voor het experiment een aliquot ICAM-1 en verdun deze in PBS tot een uiteindelijke concentratie van vijf microgram per milliliter. Voeg vervolgens 30 microliter ICAM-1 toe aan de gewenste kamers van een stroomdia.

Plaats de glijbaan in een vochtige kamer, en zet het op vier graden Celsius om 's nachts uit te broeden. De volgende dag, was de kamer door het toevoegen van 100 microliter pbs aan een put en vervolgens trekken 100 microliters uit de andere put van de kamer. Voeg vervolgens 100 microliter blokkeerbuffer toe aan een kamer en broed de dia 90 minuten in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.

Vervolgens was de kamer door het toevoegen van 100 microliter pbs aan een put, trekken het uit de andere put, en voeg vervolgens 100 microliter migratie buffer aan de kamer. De dia is nu klaar voor gebruik. Bewaar het in een vochtige kamer op kamertemperatuur tot het experiment.

Sluit eerst een vloeistofpomp aan en bevestig de fluidics unit. Schakel vervolgens de pompsoftware in. Was vervolgens de slang een keer met vijf tot 10 milliliter migratiebuffer.

Dit duurt ongeveer een minuut. Voeg vervolgens 11,7 milliliter migratiebuffer gelijkmatig toe aan beide reservoirs en verwijder de luchtbellen. Klem nu de slang ongeveer 10 centimeter van het connectorstuk en plaats de vloeibare eenheid in de verwarmde incubatiekamer op de microscoop.

Stel in de software de diakeuze in op micro-slide VI 0.4 en de slangoptie op wit. Stel ook de gewenste afschuifspanning in op ongeveer vier dynes per vierkante centimeter en de beeldtijd op 30 minuten. Stel vervolgens de gewenste debiet en afschuifstress in door de waarden in de pompsoftware in te voeren.

Vervolgens, pre-warm de microscoop incubatiekamer, fluidics unit, en migratie buffer aliquots tot 37 graden Celsius. Test de vloeistofpomp, test de vloeistofpomp en zorg ervoor dat de migratiebuffer heen en weer stroomt in de reservoirs en dat er geen luchtbellen in het systeem zitten. Isoleer eerst leukocyten en zuiver de marginale zone B-cellen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Maak vervolgens de onderkant van de glijbaan schoon met een ethanol-gedempt weefsel. Voeg 30 microliter van de celsuspensie toe aan een put van de kamer en trek 30 microliter van de opgeslagen migratiebuffer uit de andere put. Dek de dia af en broed deze gedurende 30 minuten uit om de cellen te kunnen bevestigen.

Voeg vervolgens langzaam de voorverwarmde migratiebuffer toe aan elke put van de dia totdat er een positieve meniscus uit de put opkomt. Verwijder eventuele luchtbellen met de pipetpunt. Het is belangrijk om de consistentie met factoren die van invloed zijn op de celhechting te behouden, dus houd de buffers en de cellen op 37 graden, en vermijd het gebruik van overmatige kracht bij het pipetten van de buffer in de kamer.

Klem de schuif vast aan het microscoopstadium en verwijder de ongemarkeerde kant van de vloeistofbuizen uit het verbindingsstuk. Vul vervolgens het einde van de slang met migratiebuffer tot een positieve meniscus zonder luchtbellen uit het einde stijgt. Draai het uiteinde van de slang om en plaats deze in de bovenste put van de stroomkamer.

Herhaal de procedure voor het gemarkeerde uiteinde van de slang terwijl u de slang vastkleed houdt. Schakel nu het beeldsysteem in naar de modus Live en selecteer een gezichtsveld dat zich in het midden van de dia bevindt. Hier, stel de focus op de cellen, en vervolgens de-focus iets om de zwarte omtrek van de cellen te verbeteren en een wit interieur te produceren.

De zwarte achtergrond en het witte midden zullen gemakkelijker te gebruiken zijn in het geautomatiseerde trackingprogramma. Stel het programma voor beeldvormingsreeks in om gedurende 30 minuten gedurende 30 minuten één beeld op te nemen met behulp van een 10x droge doelstelling. Begin dan met opnemen.

Haal de klem uit de slang en zet de pomp aan. Hierdoor worden de niet-aanhangende cellen afgewassen en beginnen de cellen te migreren. Aan het einde van het beeldvormingsprogramma, label en sla de film op.

Als u een remmer of een modifier van celmigratie gebruikt, kan deze worden toegevoegd aan de cellen in de celsuspensie voordat u ze op de dia plaatst of aan de migratiebuffer in de fluidics-eenheid. Open het ImageJ-programma om te beginnen met de automatische analyse van het migratiespoor. Kopieer het MTrack2_kt Java-bestand naar de map ImageJ Plugins.

Selecteer Compile en Run onder het menu Plug-ins. Start vervolgens ImageJ opnieuw op en de plug-in moet worden weergegeven in het menu Plug-ins. Open de afbeeldingsstack van de celmigratiefilm in ImageJ en verwerk de afbeeldingen zoals hier weergegeven om de video om te zetten van kleurenframes naar afbeeldingen met een hoog contrast met de cellen als zwarte objecten op een witte achtergrond.

Verscherp vervolgens de beelden twee keer, despeckle de beelden, en zet de beelden naar acht bit. Ga in het menu Afbeelding naar het submenu Helderheid/contrast aanpassen en zet de schuifregelaar Contrast op maximaal contrast. Hierdoor worden de cellen weergegeven als witte objecten op een zwarte achtergrond.

Ga vervolgens terug naar het submenu Drempelwaarde aanpassen om ervoor te zorgen dat de cellen worden weergegeven als zwarte objecten op een witte achtergrond. Voer nu de automatische cel tracking plugin MTrack2 kt. Stel op het optiescherm de deeltjesgrootte in op minimaal één pixel en de deeltjesgrootte maximaal op maximaal 30 pixels.

Stel de snelheidswaarde in op 10 pixels, hoewel marginale zone B-cellen over het algemeen niet meer dan twee pixels hoger zijn dan opeenvolgende frames die vijf seconden uit elkaar liggen. De celsporen zijn nu klaar voor analyse met behulp van de ibidi Chemotaxis Tool. Deze twee velden tonen de migratiepaden van marginale zone B-cellen die zijn gezaaid op ICAM-1-gecoate dia's.

De cellen werden automatisch gevolgd met MTrack2 met behulp van de methoden beschreven in dit artikel. Aan de linkerkant werden cellen afgebeeld onder statische omstandigheden, en aan de rechterkant werden cellen blootgesteld aan een schuifstroom van vier dynes per vierkante centimeter. De afzonderlijke cel tracks kunnen worden geïmporteerd in de ibidi Chemotaxis Tool om track plots van elke film te genereren.

Hier zijn de afzonderlijke celsporen rood gekleurd om aan te geven dat ze stroomafwaarts van hun oorsprongspunt of zwart zijn geëindigd als ze stroomopwaarts terecht zijn gekomen. De analyse van celtracks van vier afzonderlijke films voor zowel stroom als geen stroomomstandigheden worden hier weergegeven. Dit omvat de gemiddelde directionele migratie-index, celsnelheid, padrechtheid en de laatste rechte lijnafstand voor beide omstandigheden.

Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe de directionele migratie van marginale zone B cellen beeld naar schuifstroom en hoe automatisch volgen van de cellen. Tijdens deze procedure kunnen andere methoden zoals TIRF-microscopie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe het cytoskelet en de integrins reageren op schuifstress?