Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Dit protocol richt zich op twee chemische droogmethoden, Hexamethyldisilazane en T-butylalcohol en hun toepassing beeldvorming zowel prokaryotische als eukaryotische organismen met behulp van SEM. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het niet het gebruik van gespecialiseerde droogapparatuur, zoals een kritische puntdroger, nodig heeft om monsters voor te bereiden op analyse. Dit protocol beschrijft de methoden voor het gebruik van chemische uitdroging en SEM-analyse van drie soorten organismen, maar zou in grote lijnen van toepassing zijn op het onderzoeken van vele organismale en weefselsoorten.

Het aantonen van de procedure zal Madison Koon zijn, een studente van mijn laboratorium. Om te beginnen, bereiden cyanobacteriën door 's nachts fixatie. Breng ze vervolgens over in een filtratie-installatie van 10 mL met een polycarbonaat van 25 mL.

Verzegel de zijarm en trechter van de filtratie-installatie met rubberen stoppers om de cultuur in de trechter te bevatten. Na het verwijderen van beide stoppers, verwijder het fixatief door zacht stofzuigen op de filtratiekolf. Om eencellige algen euglenoïden voor te bereiden, bevestig ze door 3 druppels van 4% osmiumtetroxide direct toe te voegen aan de cultuur die eerder is overgebracht naar een filtratie-installatie van 10 mL.

Na een incubatie van 30 minuten verwijdert u beide stoppers en verwijdert u het fixatief door zacht stofzuigen op de filtratiekolf. Was de vaste euglenoïden drie maal met 5 ml fosfaatbuffer pH 7.0 bij kamertemperatuur gedurende tien minuten en houd de kolf en trechter gesloten met de stoppers om de was te houden. Na het verwijderen van beide stoppers, verwijder elke wasbeurt door zacht vacuüm op de filtratiekolf.

Gebruik een gesorteerde ethanolserie gedurende tien minuten in een volume van 5 mL in de trechter om het monster te dehydrateren met behoud van continue onderdompeling, gedurende tien minuten in een volume van 5 mL in de trechter, terwijl de kolf en trechter gesloten blijven met de stoppers om de ethanol in de trechter te bevatten. Na het verwijderen van beide stoppers zachtjes vacuüm op de filtratie kolf om ethanol te verwijderen. Breng het monster naar een wegwerp aluminium weegschaal met net genoeg 100% ethanol om het monster te dekken.

Voor het chemisch drogen van de euglenoïden met TBA, eerst de 100% ethanol oplossing in de aluminium schotel te vervangen door een 1 tot 1 oplossing van TBA en 100% ethanol gedurende twintig minuten. Vervang vervolgens de 1-1-oplossing gedurende twintig minuten door 100% TBA en herhaal het proces twee keer. Verwijder TBA en vervang met net genoeg verse 100% TBA om het monster te dekken.

Plaats de schotel op vier graden celsius gedurende tien minuten om de TBA te bevriezen. Breng het monster over naar een vacuümdesiccator met bevroren gelverpakkingen om TBA bevroren te houden. Gebruik een roterende pomp om vacuüm te evacueren en te onderhouden om het monster te laten drogen door vacuüm sublimatie van de bevroren TBA gedurende ten minste drie uur.

Om cyanobacteriën in euglenoïden te monteren, labelt u de onderkant van een 25 mm aluminium montagestub om aan te geven wat er bovenop wordt geplaatst. Plaats vervolgens elk filter op een carbon lijm tab bevestigd aan de bovenkant van de stomp. Om Drosophila melanogaster voor te bereiden, dompel je verdoofde vliegen onder in 1 mL fixatiemiddel gedurende twee uur bij vier graden Celsius, om ervoor te zorgen dat ze volledig onder water staan.

Gebruik een glazen pipet om het fixatieve te verwijderen. Was het vaste Drosophila monster drie maal in een 1,5 mL microcentrifugebuis met 1 mL fosfaatbuffer van 0,1 M, pH 7,2 bij kamertemperatuur gedurende tien minuten. Gebruik een glazen pipet om elke was te verwijderen, voorzichtig is om het monster niet te verwijderen.

Vervolgens, dehydrateren het monster in een microfuge buis in een volume van 1 mL met behulp van een gesorteerde ethanol serie gedurende tien minuten per stuk. Gebruik een glazen pipet om elke was te verwijderen, voorzichtig is om het monster niet te verwijderen. Bewaar het monster in de 1,5 mL microcentrifuge buis met net genoeg 100% ethanol om het te bedekken.

Voor het chemisch drogen van de vliegen met HMDS, eerst de 100% ethanol oplossing te vervangen door een 1 tot 2 oplossing van HMDS en 100% ethanol gedurende twintig minuten. Vervang de oplossing vervolgens gedurende twintig minuten door een 2-1 oplossing van HMDS en 100% ethanol. Tot slot, vervang deze oplossing met 100% HMDS gedurende twintig minuten en herhaal het proces vervolgens een keer.

Breng het monster in een 1,5 mL micro centrifuge buis en HMDS in een wegwerp aluminium weegschaal. Vervang de 100%HMDS door net genoeg verse 100%HMDS om het monster te dekken. Plaats het monster in de aluminium schotel direct in een chemische rookkap te drogen met een losse deksel, zoals een doos om te voorkomen dat vuil valt op het monster en laat het drogen voor 12 tot 24 uur.

Om Drosophila te monteren, label de onderkant van een aluminium montage stomp. Gebruik precisie pincet om de gedroogde vliegen in de gewenste positie op een koolstoflijm tab bevestigd aan de bovenkant van een stomp onder een ontleden microscoop. Breng zilver geleidende lijm rond de buitenste randen van de stompen.

Gebruik een tandenstoker om de zilveren verf aan te sluiten op de vliegen, zorgen voor geleidbaarheid, ervoor te zorgen dat de verf niet het gewenste beeldvormingsgebied raakt. Plaats de stompen in een stomphouderdoos, en plaats dan de open stomphouderdoos in een desiccator en laat de zilveren verf minstens drie uren drogen. Voer 4 tot 5 spoelingen argongas uit om het sputtercoatingapparaat voor te bereiden.

Afhankelijk van de te coaten monsters stelt u de timer in op verschillende instellingen zoals beschreven in het manuscript. Sputter coat de stompen volgens de instructies van de fabrikant. Tot slot, beeldmonsters met behulp van een scanning elektronenmicroscoop die een secundaire elektronendetector met instellingen die afhankelijk zijn van het gebruikte monster omvat.

Succesvolle voorbereiding van cyanobacteriën voor SEM met behulp van dit protocol leverde beelden op waarbij details van de cel, inclusief vorm en textuur van het oppervlak zichtbaar zijn, evenals een schede van mucilage en projecties uit de cellen. SEM beeld van een filamenteuze zoetwatersoort uit Colorado toont een zichtbare schede van mucilage. SEM beeld van een zoetwaterbacteriën uit Ohio onthult individuele cellen die soms kolonies samengehouden door een dunne laag mucilage vormen.

Filament-achtige uitsteeksels strekken zich uit van de individuele cellen. Beelden van onbekende filamenteuze soorten uit een hoog zoutgehalte estuarium in de kustwateren van Texas tonen individuele en delende cellen. SEM werd gebruikt om de pellicle strips van twee verschillende Euglenoid soorten te visualiseren.

Bij het vergelijken van Monomorphina en Aenigmatica met Monomorphina pseudo pyrum, de zichtbare spiraalvormige opstelling van de pellicle strips die ontstaan aan het achterste uiteinde om een staart te vormen, steun in fylogenie tot beëindiging. SEM beelden van normale drosophila ogen tonen een geordende reeks van haren en lenzen, maar expressie van eiwitten geassocieerd met de ziekte van Alzheimer maken de ruwe oog fenotype. Genen die het ruwe oogfenotype onderdrukken of verbeteren, kunnen een fysiologische rol spelen bij de progressie van de ziekte.

Hier zijn voorbeelden van potentiële putvallen te vermijden, met inbegrip van een voorbeeld van de ingestorte structuur van het oog van onjuiste droogtechniek en elektronenladen van onvoldoende sputtercoding die tijdens beeldverwerving verschijnt. De hier beschreven protocollen gebruikten organismen die zeer sterk met gerespecteerde medeplichtigheid, maar alle zijn vatbaar voor SEM analyse om nuttige, morfologische informatie die van cruciaal belang is voor wetenschappelijke ontdekkingen verspreid over vele subdisciplines van de biologie te verzamelen. Vergeet niet dat het werken met T-Butylalcohol, Hexamethyldisilazane en osmiumtergoxide gevaarlijk kan zijn en dat de juiste veiligheidsmaatregelen altijd moeten worden nageleefd om gebruikers te beschermen, met name studenten die met deze chemicaliën zullen omgaan.