Name: Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer chemisch drogen met Hexamethyldisilazane en T-butyl alcohol voor SEM-analyse van prokaryote en eukaryote organismen zoals cyanobacteriën, euglenoïden en Drosophila melanogaster. Deze methode maakt gedetailleerde morfologische beeldvorming mogelijk zonder gespecialiseerde apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie voor MLS en een zomer Scholar Award te MAK van de Office of Research en Graduate studie aan Central Michigan University. Cyanobacteriën werden geleverd door de Zimba en plankton lab, een deel van het centrum voor kust Studies, Texas A & M University in Corpus Christi. Euglenoids werden geleverd door de Triemer lab, Michigan State University.

1. voorbereiding en fixatie
<ol><li>Bereiden van cyanobacteriën.<ol>
<li>Grow eensoortige culturen in F/2 media24,25 bij een temperatuur van 28 ° C op een 14:10 h licht donker cyclus. Overbrengen in voldoende cultuur een 1,5 mL microcentrifuge buis zodanig dat na het toestaan van 15 min te regelen, de bacteriële pellet ongeveer 0,05 mL in grootte. Verwijder het medium en vervangen met 1,5 mL fixeer (1,25% Glutaaraldehyde, 0,1 M fosfaatbuffer pH 7.0), voorzichtig omkeren van meerdere keren en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
		<li>Overdracht van de vaste cellen met een glazen pipet in een 10 mL filtratie tuig (Figuur 1) die met een filter 25 mm polycarbonaat met 0.8 of 0,2 µm poriën, afhankelijk van de grootte van de cellen. Verzegel de zijarm en trechter met rubber stoppen te bevatten van de cultuur in de trechter. Het fixeer door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen. Opmerking: Als de celdichtheid op het polycarbonaat-filter niet optimaal is, de hoeveelheid van het starten van cultuur gebruikt aanpassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eencellige algen (euglenoids) voor te bereiden.<ol>
<li>Grow eensoortige culturen in AF-6 media26 met 150 mL L-1 van verkrijgbare bodem-water medium toegevoegd aan de media, bij een temperatuur van 22 ° C op een 14:10 h licht donker cyclus. Pipetteer 2 mL van lage dichtheid (OD600 < 0,5) cultuur met een glazen pipet in een 10 mL filtratie tuig (Figuur 1) die met een filter 25 mm polycarbonaat met 8 µm poriën. Verzegel de zijarm en trechter met rubber stoppen te bevatten van de cultuur in de trechter. Opmerking: Als de celdichtheid op het polycarbonaat-filter niet optimaal is, de hoeveelheid van het starten van cultuur gebruikt aanpassen.</li>
		<li>Voeg drie druppels van 4% osmium tetroxide (OsO4) rechtstreeks naar de cultuur en laat Incubeer voor 30 min. het fixeer door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen. Opmerking: OsO4 is een acute toxine (dermaal, orale en inhalatie routes), corrosief voor de huid, schadelijk voor de ogen, en een respiratoire sensibiliserende. OsO4 moeten worden behandeld in een chemische zuurkast met behulp van passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, laboratoriumjas en oogbescherming.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van Drosophila melanogaster (fruitvlieg)23.<ol>
<li>Anesthetize volwassen vliegen met behulp van 100% kooldioxide. Plaats verdoofd volwassenen (ongeveer 10 tot 30 vliegen) in een kleine plastic schroefdop ampul of 1,5 mL centrifugebuis.</li>
		<li>Dompel onder narcose vliegen in 1 mL fixeer (1,25% Glutaaraldehyde, 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,2) voor 2 h (of 's nachts) bij 4 ° C. Als de vliegen op het oppervlak van de fixeer drijven, voeg een paar druppels van 2,5% polyethyleenglycol tert-octylphenyl ether te verzwakken de oppervlaktespanning van de fixeerspray waardoor totale onderdompeling van het weefsel. Verwijder de fixeer die met behulp van een glazen pipet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. wassen en uitdroging
<ol><li>Wassen en uitdrogen van cyanobacteriën.<ol>
<li>Wassen van de vaste monster driemaal met 5 mL 0,1 M fosfaatbuffer pH 7.0 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk. Houd de kolf en de trechter kolven voor het wassen. Elke wassen door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen.</li>
		<li>Het uitdrogen van het monster met behoud van continue onderdompeling met behulp van een getrapte ethanol-serie, gedurende 10 minuten in een volume van 5 mL in de trechter. De graded ethanol concentraties zijn: 25%, 50%, 75%, 95% en 2 wijzigingen van 100% ethanol. De kolf en de trechter kolven bevatten de ethanol in de trechter, gegevensverlies voorkomen houden beide via verdamping en passieve stroom door het filter.</li>
		<li>Ethanol door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen. Het filter/monster overbrengen in een wegwerp aluminium met een gewicht van schotel met net genoeg 100% ethanol ter dekking van het monster vóór het drogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen en uitdrogen eencellige algen (euglenoids).<ol>
<li>Wassen het vaste monster driemaal met 5 mL gedeïoniseerd water op kamertemperatuur voor elke 10 min. Houd de kolf en de trechter kolven om te bevatten het wassen in de trechter. Elke wassen door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen.</li>
		<li>Het uitdrogen van het monster met behoud van continue onderdompeling met behulp van een reeks graded ethanol gedurende 10 minuten in een volume van 5 mL in de trechter. De graded ethanol concentraties zijn: 25%, 50%, 75%, 95% en 2 wijzigingen van 100% ethanol. De kolf en de trechter kolven bevatten de ethanol in de trechter, gegevensverlies voorkomen houden beide via verdamping en passieve stroom door het filter.</li>
		<li>De ethanol door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen. Het filter/monster overbrengen in een wegwerp aluminium met een gewicht van schotel met net genoeg 100% ethanol ter dekking van het monster vóór het drogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen en uitdrogen Drosophila melanogaster (fruitvlieg).<ol>
<li>Wassen het vaste monster driemaal met 1 mL 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,2 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Verwijder elke wassen met een glazen pipet, voorzichtig niet te verwijderen van de vliegen.</li>
		<li>Uitdrogen van het monster met behulp van een getrapte ethanol-serie, gedurende 10 minuten in een volume van 1 mL in een microfuge buis. De concentraties van ethanol: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Verwijder de ethanol met een glazen pipet, voorzichtig niet te verwijderen van de vliegen.</li>
		<li>Behouden van het monster in de buis 1,5 mL microcentrifuge met net genoeg 100% ethanol ter dekking van het monster vóór het drogen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. het drogen
<ol><li>Chemische drogen met behulp van de t-butyl alcohol (TBA)27uitvoeren<ol>
<li>De 100% ethanol oplossing vervangen door een oplossing van 1:1 van TBA en 100% ethanol voor 20 min. vervangen de oplossing van 1:1 met 100% TBA voor 20 min. tweemaal herhalen. Bewaar deze oplossing bij 37 ° C, zodat TBA niet bevriest. Opmerking: 100% TBA heeft een vriespunt van 25,5 ° C; de 1:1 oplossing zal niet bevriezen bij kamertemperatuur. TBA ontvlambaar is, veroorzaakt ernstige oogirritatie is schadelijk bij inademing en irritatie van de luchtwegen, slaperigheid of duizeligheid kan veroorzaken. TBA moet worden behandeld in een chemische zuurkast met behulp van passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, laboratoriumjas en oogbescherming.</li>
		<li>Breng het monster in TBA, als in een 1,5 mL microcentrifuge buis, in een wegwerp aluminium met een gewicht van schotel. Eenmaal in de aluminium wegende schotel, TBA verwijderen en vervangen door net genoeg verse 100% TBA ter dekking van het monster. Het bevriezen van de TBA bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Overbrengen naar een vacuüm exsiccator (Stolp) bevroren gel packs te houden TBA bevroren. Evacueren en onderhouden vacuüm met een roterende pomp om het monster aan droog door vacuüm sublimatie van de bevroren TBA voor ten minste 3 uur of 's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uitvoeren van chemisch drogen met behulp van hexamethyldisilazane (HMDS)20.<ol>
<li>Vervang de 100% ethanol oplossing met een oplossing van 1:2 van HMDS en 100% ethanol voor 20 min. vervangt de 1:2-oplossing met een 2:1-oplossing van HMDS en 100% ethanol voor 20 min. vervangen de 2:1 oplossing met 100% HMDS voor 20 min. eenmaal herhaald. Opmerking: HMDS is brandbaar en een acute toxine (dermale route). HMDS moeten worden behandeld in een chemische zuurkast met behulp van passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, laboratoriumjas en oogbescherming.</li>
		<li>Breng het monster in HMDS, als in een 1,5 mL microcentrifuge buis, in een wegwerp aluminium met een gewicht van schotel. Zodra in het aluminium met een gewicht van schotel, het vervangen van de 100% HMDS met net genoeg verse 100% HMDS ter dekking van het monster.</li>
		<li>Het monster overbrengen in een plastic of glas niet-vacuüm exsiccator met verse droogmiddel (5-6 cm diep) en leg in in een chemische zuurkast. Leg het monster ook rechtstreeks in een chemische zuurkast te drogen met een losse deksel, zoals een vak om te voorkomen dat vuil op het monster valt. Toestaan dat de steekproef te drogen voor 12 tot 24 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. montage
<ol><li>Mount cyanobacteriën en euglenoids.<ol>
<li>Label de onderkant van beide een 12 - of 25-mm aluminium montage van stub om aan te geven wat wordt geplaatst op de top. Snijd het polycarbonaat filter met de gedroogde cellen in wijken met een schone scheermesje of scalpel als met behulp van een beginnetje van 12 mm, of schakel het gehele filter als met behulp van een beginnetje van 25 mm.</li>
		<li>Plaats elk filter op lijm of een koolstof zelfklevende tab bevestigd aan de bovenkant van een beginnetje.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mount Drosophila melanogaster (fruitvlieg).<ol>
<li>Label onderin de aluminium montage stub om aan te geven wat wordt geplaatst op de top. Plaats de droge vliegen in de gewenste positie op lijm of koolstof zelfklevende tabblad beveiligd naar de top van een stub onder een ontleden Microscoop met precisie pincet.</li>
		<li>Toepassing zilveren geleidende lijm, dat wil zeggen, zilver verf, rond de buitenranden van de deelnemer. De zilveren verf verbinden met het vliegen met behulp van een tandenstoker te waarborgen van de geleidendheid. De verf te raken het gewenste opnamegebied niet toegestaan.</li>
		<li>De categorie: plaats in een beginnetje houder doos en plaats van het vak van de houder open stub in een exsiccator. Toestaan dat de zilveren verf droog ten minste 3 uur of 's nachts voor het beste resultaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. sputter Coating
<ol><li>Het apparaat sputter coating voor te bereiden door het uitvoeren van vier tot vijf flushes van argon gas. Als de luchtvochtigheid hoog is (dat wil zeggen, de kamer lucht vochtig, meestal ongeveer voelt 50% relatieve vochtigheid), uitvoeren van zes tot zeven flushes. Sputter coat de categorie: volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Jas steekproeven gebaseerd op specimen gebruikt:<ol>
<li>Voor filters met cyanobacteriën, stelt u de timer sputter jas voor 180 s straight op.</li>
		<li>Voor filters met eukaryote algen, dat wil zeggen, euglenoids, stelt u de timer sputter jas voor 120 s rechtdoor, dan 20 s aan drie zijden onder een hoek van 45 °.</li>
		<li>Voor grote monsters, dat wil zeggen, vliegen hoofden, stelt u de timer sputter jas voor 60 s rechtdoor, dan 30 s aan elke kant in een hoek van 45 °. Opmerking: Nadat de coating is voltooid, categorie: moet lichtgrijs van kleur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. imaging
<ol><li>Foto's met behulp van een Scannende Elektronen Microscoop waarin een detector secundaire elektron (SE).<ol>
<li>Voor cyanobacteriën, gelden de volgende instellingen: 3-5 kV versneller spanning (AC), 20-30 sonde huidige (PC) en 5 mm afstand (WD). Gebruik voor euglenoids, 3 kV AC, 30 PC en 5 mm WD. Voor vliegen, gebruik maken van 5 kV AC, 30 PC en 5 tot 10 mm WD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aanpassen vergroting afhankelijk van de grootte van het detail of object dat u wilt worden gevisualiseerd. Pas de stigmators, de openingen en de focus totdat een duidelijk beeld ontstaat. Vastleggen van de afbeelding met hoge resolutie instellingen volgens de instructies van de fabrikant van de SEM.</li>
</ol>

<ol><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+microscopy%2C+principles+and+techniques+for+biologists%22">Electron microscopy, principles and techniques for biologists</a>. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).</li>
<li>Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldstein%2C+J+%22Scanning+electron+microscopy+and+X-ray+microanalysis%22">Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis</a>. , Springer. New York. (2003).</li>
<li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEgerton%2C+RF+%22Physical+principles+of+electron+microscopy%3A+an+introduction+to+TEM%2C+SEM%2C+and+AEM%22">Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM</a>. , Springer. New York. (2005).</li>
<li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Brain+Mitochondria+Using+Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (113), (2016).</li>
<li>Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Electron+Microscopy+%28SEM%29+Protocols+for+Problematic+Plant%2C+Oomycete%2C+and+Fungal+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li>
<li>Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+Investigating+the+Anatomy+of+the+Ant+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System.</a> Journal of visualized experiments. (129), (2017).</li>
<li>Endres, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+to+Characterize+the+Morphological+Changes+of+Clostridium+difficile+in+Response+to+Antibiotic+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment.</a> Journal of visualized experiments. (123), (2017).</li>
<li>Chan, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Calcification+Events+Using+Live+Optical+and+Electron+Microscopy+Techniques+in+a+Marine+Tubeworm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li>
<li>Miquel Guennoc,, C,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Method+for+Qualitative+Multi-scale+Analysis+of+Bacterial+Biofilms+on+Filamentous+Fungal+Colonies+Using+Confocal+and+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (119), (2017).</li>
<li>Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+Studying+B.+subtilis+Biofilms+as+a+Model+for+Characterizing+Small+Molecule+Biofilm+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors.</a> Journal of visualized experiments. (116), (2016).</li>
<li>Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Keratin-based+Nanofiber+for+Biomedical+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering.</a> Journal of visualized experiments. (108), e53381(2016).</li>
<li>Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+methods+for+the+analysis+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).</li>
<li>Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+the+mechanical+properties+of+conducting+polymer+coating-substrate+structures+and+their+influencing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).</li>
<li>Hortola, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEM+examination+of+human+erythrocytes+in+uncoated+bloodstains+on+stone%3A+use+of+conventional+as+environmental-like+SEM+in+a+soft+biological+tissue+%28and+hard+inorganic+material%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material).</a> Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).</li>
<li>Joy, D. C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/36d5/4331704e59ee5cd7c87b0e174cb4188a8f2d.pdf">Scanning electron microscopy for materials characterization.</a> Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).</li>
<li>Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0037073811000650">Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada.</a> Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).</li>
<li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+Labeling+for+Scanning+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li>
<li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).</li>
<li>Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexamethyldisilazane+in+preparation+of+retinal+tissue+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy.</a> Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).</li>
<li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+using+hexamethyldisilazane+for+preparation+of+soft+insect+tissues+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22Preparation+of+Drosophila+eye+specimens+for+scanning+electron+microscopy%22">Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy</a>. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).</li>
<li>Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22549162">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).</li>
<li>Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+model+system+to+study+tau+action%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila model system to study tau action.</a> Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).</li>
<li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li>
<li>Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuillard%2C+RRL+%22Culture+of+Marine+Invertebrate+Animals%22">Culture of Marine Invertebrate Animals</a>. , Plenum Press. New York. (1975).</li>
<li>Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatanabe%2C+MM+%22National+Institute+for+Environmental+Studies%22">National Institute for Environmental Studies</a>. , Tsukuba, Japan. 159(1997).</li>
<li>Inoue, T., Osatake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+drying+method+of+biological+specimens+for+scanning+electron+microscopy%3A+the+t-butyl+alcohol+freeze-drying+method%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method.</a> Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).</li>
<li>Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatotoxic+cyanobacteria%3A+a+review+of+the+biological+importance+of+microcystins+in+freshwater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health.+Part+B%2C+Critical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).</li>
<li>Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+fixation+and+photosynthetic+oxygen+evolution+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria.</a> Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).</li>
<li>Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10531-013-0561-x">How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number.</a> Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).</li>
<li>Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1574-6968.1986.tb01396.x">Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces.</a> FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).</li>
<li>Diestra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+oil-degrading+Microcoleus+consortium+by+means+of+confocal+scanning+microscopy%2C+scanning+electron+microscopy+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.</a> Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).</li>
<li>Komárek, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10750-009-0030-4">Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera.</a> Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).</li>
<li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+I.+Patterns+of+strips+and+pores%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).</li>
<li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+II.+Diversity+of+strip+substructure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).</li>
<li>Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+evolution+of+the+euglenid+pellicle%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Trends in the evolution of the euglenid pellicle.</a> Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).</li>
<li>Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10">http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10</a> (2012).</li>
<li>Shulman, J. M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modifiers+of+tauopathy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila.</a> Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).</li>
<li>Reinecke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implicating+calpain+in+tau-mediated+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo.</a> PLoS One. 6 (8), e23865(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschreven hier een protocol met behulp van SEM voor gedetailleerde informatie over externe morfologische kenmerken van drie soorten organismen die anderen toepassen kunnen om de functies van veel soorten organismen of weefsels te onderzoeken. Binnen elke stap van het protocol zijn er potentiële punten van fout die zich kunnen voordoen en worden besproken in detail besproken.
Terwijl de volumes voor fixeer en wast hier gegeven specifieke zijn, moet in het algemeen de fixeer en wast 5-10 x h...

Een gerichte lichtbundel van hoog-energetische elektronen een Scannende Elektronen Microscoop (SEM) gebruikt voor het genereren van een afbeelding van secundaire elektronen die toont de morfologie en de topografie van een monster1. SEM kan worden gebruikt om rechtstreeks bepalen de fysieke omvang van een steekproef, de oppervlaktestructuur, driedimensionale vorm, en het biedt grotere resolutie en grotere diepte van het veld ten opzichte van de lichte microscopie. Een andere vorm van elektronenmicroscopie (EM), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) gebruikt gerichte elektronen die passeren van het monster, afbeeldingen met fijne details van interne structuur te genereren. Terwijl TEM hogere resolutie dan licht of SEM heeft en kan worden gebruikt om op te lossen structuren zo klein als enkele atomen, heeft drie grote nadelen: uitgebreide monstervoorbereiding, een kleine gezichtsveld en een ondiepe diepte van veld2,3. Hoewel andere gevisualiseerd protocollen bestaan met behulp van SEM te bestuderen van specifieke weefsels, cellen en organellen4,5,6,7,8,9, 10 , dit protocol is uniek in die zin dat we beschrijven methoden die in grote lijnen kunnen worden toegepast op een groot aantal organismen voor morfologische beoordeling.
SEM heeft brede toepassingen voor de behandeling van anorganische materialen met inbegrip van nanodeeltjes11,12, polymeren13en talrijke toepassingen in geologische, industriële en materiële wetenschappen14, gevonden 15,16. In de biologie, heeft SEM lange tijd gebruikt als een methode voor de behandeling van biologische monsters variërend van individuele eiwitten tot hele organismen17,18. SEM is van bijzonder belang omdat morfologische oppervlak details kunnen worden gebruikt om wetenschappelijke ontdekking. SEM analyse is een snelle, goedkope en eenvoudige methode om het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de structuur, de grootte en oppervlakte van de kenmerken van een breed scala van biologische monsters.
Omdat een SEM normaal onder hoog vacuüm (10-6 Torr minimale opereert) ter ondersteuning van een coherente lichtstraal high-speed elektronen, zijn geen vloeistoffen (olie, water, alcoholen) toegestaan in de monsterkamer, zoals vloeistoffen te voorkomen een vacuüm oprichten dat. Aldus, moeten alle monsters onderzocht met behulp van SEM worden gedehydrateerde, meestal met behulp van een reeks van de gesorteerde ethanol gevolgd door een droogprocédé te verwijderen van de ethanol. Er zijn verschillende methoden voor het drogen van biologische weefsels voor gebruik in de SEM, met inbegrip van lucht drogen, lyofilisatie, gebruik van een kritisch punt drogen (CPD) apparaat, of chemische drogen met behulp van de t-butylalcohol (TBA) of hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. selectie van een droogrek methode is meestal empirische aangezien elk biologische monster verschillend op elke drogen methode reageren kan. Voor elk monster, kan al deze methoden passend zijn, dus het vergelijken van de voor- en nadelen van elk nuttig is in het selecteren van de juiste methode.
Terwijl lucht drogen een monster bij kamertemperatuur of in een droogstoof (60 ° C) de eenvoudigste methode is, meeste biologische monsters Toon drogen-veroorzaakte schade zoals shriveling en instorten, wat resulteert in een verstoring van het model. Het proces van lyofilisatie ook water (of ijs) verwijdert uit een monster, maar vereist te worden flash-bevroren monsters en onder vacuüm te verwijderen het ijs via het proces van sublimatie, potentieel schadelijke het monster geplaatst. Bovendien moet de gebruiker beschikken over een lyophilizer. De meest gebruikte methode voor het drogen van de monsters voor SEM is kritisch punt drogen (CPD). In CPD, wordt de ethanol in een monster vervangen met vloeibare kooldioxide (CO2) en, onder specifieke temperatuur en druk voorwaarden bekend als het kritische punt (31.1 ° C en 1,073 psi), CO2 verdampt zonder het maken van de oppervlaktespanning, waardoor effectief handhaven de morfologische en structurele kenmerken van de steekproef. Terwijl CPD over het algemeen de standaardmethode is, heeft meerdere nadelen. Ten eerste, het proces vereist toegang tot een kritisch punt droger, die is niet alleen duur, maar ook noodzakelijk het gebruik van vloeibare kooldioxide. Ten tweede, de grootte van de steekproef die kan worden gedroogd is beperkt tot de grootte van de kamer van het kritieke punt droger. Ten derde kan de uitwisseling van vloeistoffen tijdens CPD turbulentie die schade aan het monster toebrengen kan.
Chemische droging biedt vele voordelen ten opzichte van de BPR en fungeert als een geschikt alternatief dat steeds wijd in de bereiding van de monsters van de SEM gebruikt is. Het gebruik van chemische dehydrants zoals TBA en HMDS biedt een snel, goedkoop en eenvoudig alternatief voor andere methoden, terwijl nog het handhaven van de structurele integriteit van het monster. We onlangs bleek dat er geen verschil in de integriteit van het weefsel of de kwaliteit van het uiteindelijke beeld gevangen genomen toen met CPD of TBA als de drogen methode in volwassen Drosophila retinale weefsel23was. In tegenstelling tot de CPD, TBA en HMDS hoeft niet een droogrek instrument of vloeibare CO2 en er is geen beperking op de grootte van de steekproef worden gedroogd. Naast het verkrijgen van de chemicaliën, zijn alleen een standaard chemische zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril) vereist om te voltooien van het droogproces. Terwijl zowel de HMDS als de TBA ontvlambaar zijn, TBA minder giftig en minder duur is (ongeveer 1/3 de kosten van HMDS) dan HMDS.
In dit artikel beschrijven we hoe te repareren, wassen, uitdrogen, droog, mount, sputter vacht, en beeld van drie soorten organismen: blauwalgen (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. en een onbekende sp.), twee euglenoids uit het geslacht Monomorphina (M. aenigmatica en M. pseudopyrum), en de fruitvlieg (Drosophila melanogaster). Deze organismen vertegenwoordigen een breed scala in omvang (0,5 µm tot 4 mm) en cellulaire verscheidenheid (eencellige aan meercellige), maar allemaal gemakkelijk vatbaar voor SEM analyse met slechts kleine variaties die nodig zijn voor de voorbereiding van het monster. Dit protocol beschrijft de methoden voor het gebruik van chemische uitdroging en SEM analyse te onderzoeken van morfologische details voor drie soorten organismen en zou breed toepasbare beoordeling van veel organisch en weefseltypes (HLA).

<table><tbody><tr><td>gold&ndash;palladium</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91212</td><td></td></tr><tr><td>Zilver geleidend kleefmiddel 503</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore grootte 8 &mu;m, polycarbonaat</td><td>Sigma</td><td>WHA110614</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore grootte 0.8 &mu;m, polycarbonaat, zwart</td><td>Sigma</td><td>WHA110659</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore grootte 0.2 &mu;m, polycarbonaat</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td></td></tr><tr><td>aluminium weegschaal&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-100</td><td></td></tr><tr><td>aluminium montagesokjes (12 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75210</td><td></td></tr><tr><td>aluminium montagesokjes (25 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75186</td><td></td></tr><tr><td>Kleefflippers&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>76760</td><td></td></tr><tr><td>geleidend koolstof kleefflippers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77825</td><td></td></tr><tr><td>F/2 media</td><td>Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin</td><td>https://utex.org/products/f_2-medium</td><td>Geen catalogusnummer gegeven - zie link&nbsp;</td></tr><tr><td>AF6 media</td><td>Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota</td><td>https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td><td>Geen catalogusnummer gegeven - zie link&nbsp;</td></tr><tr><td>Bodemwatermedium</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>153785</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol tert-octylfenylether (Triton X-100)</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Hummer 6.2 Sputtering Coater</td><td>Anatech USA</td><td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td><td>Geen catalogusnummer gegeven - zie link&nbsp;</td></tr><tr><td>Hitachi 3400N-II SEM&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&amp;md=sms2-1&amp;sd=sms2-1 -2&amp;gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE</td><td>Het bedrijf lijkt dit model niet meer te verkopen&nbsp;</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van scanning elektronen microscopie (sem)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning elektronen microscopie (SEM) is een algemeen beschikbare techniek die is toegepast om te bestuderen van biologische monsters variërend van individuele eiwitten tot cellen, weefsels, organellen en zelfs hele organismen. Dit protocol is gericht op twee chemische drogen methoden, hexamethyldisilazane (HMDS) en t-butylalcohol (TBA), en hun toepassing aan imaging van zowel prokaryote en eukaryote organismen met behulp van SEM. In dit artikel beschrijven we hoe te repareren, wassen, uitdrogen, droog, mount, sputter vacht, en beeld van drie soorten organismen: blauwalgen (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. en een onbekende sp.), twee euglenoids uit het geslacht Monomorphina (M. aenigmatica en M. pseudopyrum), en de fruitvlieg (Drosophila melanogaster). Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een snelle, goedkope en eenvoudige methode voor het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de structuur, de grootte en oppervlakte kenmerken van specimens die in grote lijnen kunnen worden toegepast op een groot aantal organismen voor morfologische beoordeling. Succesvolle afronding van dit protocol zal toestaan dat anderen te gebruiken SEM te visualiseren van monsters door deze technieken toe te passen aan hun systeem.

Blauwalgen zijn een prokaryote groep van organismen die essentieel voor de mondiale koolstof, zuurstof en stikstof cycli28,29 zijn. Van de geschatte 6000 soorten cyanobacteriën30, de meeste hebben een mucilaginous omhulsel dat dekken en de cellen met elkaar verbinden en aan andere structuren31, die samen met de vorm, kunnen worden opgelost microscopisch32. Cel...

SEM analyse is een effectieve methode om te helpen bij de identificatie van soorten of fenotypische discriminatie. Dit protocol beschrijft de methoden voor de behandeling van specifieke morfologische details van drie representatieve soorten organismen en zou breed toepasbare beoordeling van functies van veel organisch en weefseltypes (HLA).

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Dit protocol richt zich op twee chemische droogmethoden, Hexamethyldisilazane en T-butylalcohol en hun toepassing beeldvorming zowel prokaryotische als eukaryotische organismen met behulp van SEM. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het niet het gebruik van gespecialiseerde droogapparatuur, zoals een kritische puntdroger, nodig heeft om monsters voor te bereiden op analyse. Dit protocol beschrijft de methoden voor het gebruik van chemische uitdroging en SEM-analyse van drie soorten organismen, maar zou in grote lijnen van toepassing zijn op het onderzoeken van vele organismale en weefselsoorten.Het aantonen van de procedure zal Madison Koon zijn, een studente van mijn laboratorium. Om te beginnen, bereiden cyanobacteriën door 's nachts fixatie. Breng ze vervolgens over in een filtratie-installatie van 10 mL met een polycarbonaat van 25 mL.Verzegel de zijarm en trechter van de filtratie-installatie met rubberen stoppers om de cultuur in de trechter te bevatten. Na het verwijderen van beide stoppers, verwijder het fixatief door zacht stofzuigen op de filtratiekolf. Om eencellige algen euglenoïden voor te bereiden, bevestig ze door 3 druppels van 4% osmiumtetroxide direct toe te voegen aan de cultuur die eerder is overgebracht naar een filtratie-installatie van 10 mL.Na een incubatie van 30 minuten verwijdert u beide stoppers en verwijdert u het fixatief door zacht stofzuigen op de filtratiekolf. Was de vaste euglenoïden drie maal met 5 ml fosfaatbuffer pH 7.0 bij kamertemperatuur gedurende tien minuten en houd de kolf en trechter gesloten met de stoppers om de was te houden. Na het verwijderen van beide stoppers, verwijder elke wasbeurt door zacht vacuüm op de filtratiekolf.Gebruik een gesorteerde ethanolserie gedurende tien minuten in een volume van 5 mL in de trechter om het monster te dehydrateren met behoud van continue onderdompeling, gedurende tien minuten in een volume van 5 mL in de trechter, terwijl de kolf en trechter gesloten blijven met de stoppers om de ethanol in de trechter te bevatten. Na het verwijderen van beide stoppers zachtjes vacuüm op de filtratie kolf om ethanol te verwijderen. Breng het monster naar een wegwerp aluminium weegschaal met net genoeg 100% ethanol om het monster te dekken.Voor het chemisch drogen van de euglenoïden met TBA, eerst de 100% ethanol oplossing in de aluminium schotel te vervangen door een 1 tot 1 oplossing van TBA en 100% ethanol gedurende twintig minuten. Vervang vervolgens de 1-1-oplossing gedurende twintig minuten door 100% TBA en herhaal het proces twee keer. Verwijder TBA en vervang met net genoeg verse 100% TBA om het monster te dekken.Plaats de schotel op vier graden celsius gedurende tien minuten om de TBA te bevriezen. Breng het monster over naar een vacuümdesiccator met bevroren gelverpakkingen om TBA bevroren te houden. Gebruik een roterende pomp om vacuüm te evacueren en te onderhouden om het monster te laten drogen door vacuüm sublimatie van de bevroren TBA gedurende ten minste drie uur.Om cyanobacteriën in euglenoïden te monteren, labelt u de onderkant van een 25 mm aluminium montagestub om aan te geven wat er bovenop wordt geplaatst. Plaats vervolgens elk filter op een carbon lijm tab bevestigd aan de bovenkant van de stomp. Om Drosophila melanogaster voor te bereiden, dompel je verdoofde vliegen onder in 1 mL fixatiemiddel gedurende twee uur bij vier graden Celsius, om ervoor te zorgen dat ze volledig onder water staan.Gebruik een glazen pipet om het fixatieve te verwijderen. Was het vaste Drosophila monster drie maal in een 1,5 mL microcentrifugebuis met 1 mL fosfaatbuffer van 0,1 M, pH 7,2 bij kamertemperatuur gedurende tien minuten. Gebruik een glazen pipet om elke was te verwijderen, voorzichtig is om het monster niet te verwijderen.Vervolgens, dehydrateren het monster in een microfuge buis in een volume van 1 mL met behulp van een gesorteerde ethanol serie gedurende tien minuten per stuk. Gebruik een glazen pipet om elke was te verwijderen, voorzichtig is om het monster niet te verwijderen. Bewaar het monster in de 1,5 mL microcentrifuge buis met net genoeg 100% ethanol om het te bedekken.Voor het chemisch drogen van de vliegen met HMDS, eerst de 100% ethanol oplossing te vervangen door een 1 tot 2 oplossing van HMDS en 100% ethanol gedurende twintig minuten. Vervang de oplossing vervolgens gedurende twintig minuten door een 2-1 oplossing van HMDS en 100% ethanol. Tot slot, vervang deze oplossing met 100% HMDS gedurende twintig minuten en herhaal het proces vervolgens een keer.Breng het monster in een 1,5 mL micro centrifuge buis en HMDS in een wegwerp aluminium weegschaal. Vervang de 100%HMDS door net genoeg verse 100%HMDS om het monster te dekken. Plaats het monster in de aluminium schotel direct in een chemische rookkap te drogen met een losse deksel, zoals een doos om te voorkomen dat vuil valt op het monster en laat het drogen voor 12 tot 24 uur.Om Drosophila te monteren, label de onderkant van een aluminium montage stomp. Gebruik precisie pincet om de gedroogde vliegen in de gewenste positie op een koolstoflijm tab bevestigd aan de bovenkant van een stomp onder een ontleden microscoop. Breng zilver geleidende lijm rond de buitenste randen van de stompen.Gebruik een tandenstoker om de zilveren verf aan te sluiten op de vliegen, zorgen voor geleidbaarheid, ervoor te zorgen dat de verf niet het gewenste beeldvormingsgebied raakt. Plaats de stompen in een stomphouderdoos, en plaats dan de open stomphouderdoos in een desiccator en laat de zilveren verf minstens drie uren drogen. Voer 4 tot 5 spoelingen argongas uit om het sputtercoatingapparaat voor te bereiden.Afhankelijk van de te coaten monsters stelt u de timer in op verschillende instellingen zoals beschreven in het manuscript. Sputter coat de stompen volgens de instructies van de fabrikant. Tot slot, beeldmonsters met behulp van een scanning elektronenmicroscoop die een secundaire elektronendetector met instellingen die afhankelijk zijn van het gebruikte monster omvat.Succesvolle voorbereiding van cyanobacteriën voor SEM met behulp van dit protocol leverde beelden op waarbij details van de cel, inclusief vorm en textuur van het oppervlak zichtbaar zijn, evenals een schede van mucilage en projecties uit de cellen. SEM beeld van een filamenteuze zoetwatersoort uit Colorado toont een zichtbare schede van mucilage. SEM beeld van een zoetwaterbacteriën uit Ohio onthult individuele cellen die soms kolonies samengehouden door een dunne laag mucilage vormen.Filament-achtige uitsteeksels strekken zich uit van de individuele cellen. Beelden van onbekende filamenteuze soorten uit een hoog zoutgehalte estuarium in de kustwateren van Texas tonen individuele en delende cellen. SEM werd gebruikt om de pellicle strips van twee verschillende Euglenoid soorten te visualiseren.Bij het vergelijken van Monomorphina en Aenigmatica met Monomorphina pseudo pyrum, de zichtbare spiraalvormige opstelling van de pellicle strips die ontstaan aan het achterste uiteinde om een staart te vormen, steun in fylogenie tot beëindiging. SEM beelden van normale drosophila ogen tonen een geordende reeks van haren en lenzen, maar expressie van eiwitten geassocieerd met de ziekte van Alzheimer maken de ruwe oog fenotype. Genen die het ruwe oogfenotype onderdrukken of verbeteren, kunnen een fysiologische rol spelen bij de progressie van de ziekte.Hier zijn voorbeelden van potentiële putvallen te vermijden, met inbegrip van een voorbeeld van de ingestorte structuur van het oog van onjuiste droogtechniek en elektronenladen van onvoldoende sputtercoding die tijdens beeldverwerving verschijnt. De hier beschreven protocollen gebruikten organismen die zeer sterk met gerespecteerde medeplichtigheid, maar alle zijn vatbaar voor SEM analyse om nuttige, morfologische informatie die van cruciaal belang is voor wetenschappelijke ontdekkingen verspreid over vele subdisciplines van de biologie te verzamelen. Vergeet niet dat het werken met T-Butylalcohol, Hexamethyldisilazane en osmiumtergoxide gevaarlijk kan zijn en dat de juiste veiligheidsmaatregelen altijd moeten worden nageleefd om gebruikers te beschermen, met name studenten die met deze chemicaliën zullen omgaan.

preparation-prokaryotic-eukaryotic-organisms-using-chemical-drying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een krachtig hulpmiddel om de oppervlaktekenmerken van een biologisch monster in beeld te brengen. Een goede monstervoorbereiding is echter van cruciaal belang voor het verkrijgen van kwaliteitsafbeeldingen. Deze video richt zich op de uitdrogings- en droogstappen van het voorbereiden van intacte volwassen Drosophila voor SEM.

Chemisch drogen: biologisch monsterpreparaat voor het scannen van elektronenmicroscopie (SEM)

Source: Bucher, T., et. al., Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp.(2016)This video demonstrates the preparation of mature bacterial biofilm colonies for high-resolution imaging. It covers fixation, dehydration, mounting, and metal coating steps to preserve and visualize biofilm morphology.

Preparation of Bacterial Biofilm Colonies for Morphological Analysis

Problemen bij de verwerking van biologische monsters voor waarneming door middel van rasterelektronenmicroscopie omvatten celimplosie, behandeling van monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Goedkope en relatief snelle protocollen die geschikt zijn voor het voorbereiden van uitdagende monsters zoals bloemtoppen, oömyceten cysten en schimmels (Agaricales) zijn hier samengesteld en gedetailleerd.

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Dit rapport beschrijft een monstervoorbereidingsprotocol en specifieke beeldvormingscondities voor het uitvoeren van schuifende transmissie-elektronentomografie van dikke biologische monsters.

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

Deze studie geeft betrouwbare en eenvoudige procedures voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van een micro-organisme zonder dure apparatuur in transmissie-elektronenmicroscopie.

Een methode voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van micro-organismen in transmissie-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we gedetailleerde verwerkingsprotocollen voor Imaging delicate weefselmonsters met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Drie verschillende verwerkingsmethoden, namelijk hexamethyl disilazana (HMDS) chemisch drogen, eenvoudige lucht drogen en het drogen van kritische punten worden beschreven voor het bereiden van stijve eierschalen, embryo's in vroege ontwikkelingsstadia en schimmel culturen respectievelijk.

Verwerking van embryo-, eierschaal-en schimmel cultuur voor het scannen van elektronenmicroscopie

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

We stellen een geoptimaliseerd Scanning Electron Microscopie-protocol voor voor het visualiseren van zeer heterogene en delicate monsters die planten- en schimmelbiomassa bevatten, samen met microbiota en biofilm. Dit protocol maakt het mogelijk om de ruimtelijke dimensies van de microbiota-organisatie te beschrijven.

Microbiota van attine mierentuinen: visualisatie van een microbieel landschap door scanning elektronenmicroscopie

We beschrijven een proces voor fixatie, inbedden, snijden, en de beeldvorming van laat...

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

Leer chemisch drogen met Hexamethyldisilazane en T-butyl alcohol voor SEM-analyse van prokaryote en eukaryote organismen zoals cyanobacteriën, euglenoïden en Drosophila melanogaster. Deze methode maakt gedetailleerde morfologische beeldvorming mogelijk zonder gespecialiseerde apparatuur.

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM) (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Meer video's verkennen