Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Om het begrip van transcriptiefactor-DNA binding te verbeteren, ontwikkelden we een methode om dissociatieconstanten op grote schaal te meten met behulp van bijvoorbeeld anisotropiemetingen. Deze techniek maakt het verkrijgen van automatisch volledige titratie curven om de dissociatieconstante met hoge gevoeligheid te bepalen. Het werkt in oplossing op evenwicht, heeft een matige doorvoer en een groot dynamisch bereik.

We hebben HiP-FA toegepast om het bindende affiniteitslandschap van transcriptiefactoren te verfijnen. Het protocol kan echter worden toegepast op andere soorten bindende gebeurtenissen, zoals eiwit-eiwit of eiwit-drug interacties, bijvoorbeeld. Ik adviseer om eerst meerdere titraties uit te voeren met dezelfde bindingspartners om een schatting te krijgen van de reproduceerbaarheid van de metingen.

Gebruik indien beschikbaar een geautomatiseerd systeem voor een nog betere reducibility. Om de DNA-oligomers van het referentie-DNA te annealen, meng dan zeven microliters van elke tien millimolar di-label naar voren en niet-gelabelde omgekeerde streng in één buis. Voor de concurrent DNA, meng 20 microliter van elke 100 millimolar unlabeled streng in twee putten van een 96 welled PCR plaat.

Gebruik vervolgens een standaard PCR-machine om de DNA-oplossingen gedurende de drie minuten op te warmen tot 70 graden Celsius. Verlaag vervolgens tot kamertemperatuur met een snelheid van 0,1 graden Celsius per seconde. Gebruik een magnetron om 0,5 gram agarose smelten in 100 milliliter bindende buffer.

Voeg dubbel gedestilleerd water toe om het uiteindelijke volume aan te passen om mogelijke verdamping te compenseren. Bereid tien milliliter voorraad aliquots. Om de titratie- en kalibratieputten van een 96-putplaat voor te bereiden, breng je twee gelvoorraad aliquots over naar een 75 graden Celsius incubator shaker.

Voeg voor elke titratie goed 1,4 nanomol aan referentie-DNA, transcriptiefactoreiwit, toe bij een uiteindelijke concentratie van 20-60 nanomol, 0,2 millimolar DTT en de bindende buffer tot 240 microliter van de gesmolten gel. Meng grondig door het omkeren en schudden van de buis. Dan, langzaam pipette 200 microliters per put van de DNA-bevattende gel in de aangewezen titratie putten van een 96 put plaat.

Voeg voor elke kalibratie goed 5 nanomolnijlsblauwe kleurstof toe aan 240 microliter van de gesmolten gel. Het vermijden van luchtbellen, langzaam pipette 200 microliters van de kleurstof-bevattende gel oplossing in vijf tot zes putten van de 96 put plaat. Plaats de gel op een perfect horizontaal oppervlak en broed gedurende tien minuten op kamertemperatuur, en nog eens 10 minuten op 4 graden Celsius.

Gebruik een multi-well plaatlezer om de homogeniteit van de gelhoogteniveaus in verschillende putten van de plaat te controleren. Om de DNA-oplossing van de concurrent voor te bereiden, combineert u eerst het gelabelde referentie-DNA, het eiwit en de drievoudig geconcentreerde bindingsbuffer. Meng vervolgens 20 microliter van de oplossing met 40 microliter van elk van de geannealed concurrent DNA-oplossingen.

Combineer voor elke kalibratie goed de juiste hoeveelheden van een van de geannealed concurrent DNA-oplossingen en de drievoudige geconcentreerde binding buffer met 15 millimolar nijl blauwe kleurstof oplossing. Voeg ten slotte 50 microliter van de gemengde concurrentoplossingen zo gelijktijdig mogelijk toe aan de gels. Om te beginnen beeld verwerving, plaats de 96 goed plaat op de microscoop stadium.

Neem vervolgens de tijdreeks van Z-stack beelden van putten tot het volledig ontbinden van het eiwit uit het referentie-DNA. Voer de titratietest uit volgens het manuscript. Gebruik vervolgens HiP-FA-software om titratiecurven te maken voor individuele concurrentsequenties.

Klik vervolgens op de exportknop om de dissociatieconstante en concentratie van het actieve eiwit in elke titratie goed te verkrijgen. Let er vooral op bij het pipetteren van de geloplossingen die stroperig zijn. Onnauwkeurige pipetting kan de nauwkeurigheid voor de bepaling van de dissociatieconstanten verminderen.

In deze studie wordt de HiP-FA-methode toegepast om de DNA-bindende voorkeuren van een B-zipped transcriptiefactor te bepalen. Reus, van het fly segmentatie gennetwerk. De hoge gelijkenis van de PWM's voor replica's die handmatig of met behulp van automatiseringstechnieken werden bereid, toonde de hoge reproduceerbaarheid van de HiP-FA-methode aan.

PWM's verkregen door deze methode en andere methoden zijn over het algemeen vergelijkbaar. Er zijn echter significante afwijkingen te zien op posities twee en zeven van het kernmotief waar mutaties kunnen leiden tot volledig verlies van binding of veel sterkere binding dan eerdere metingen. We gebruiken HiP-FA om verfijningen te genereren voor de bindingen van tientallen transcriptiefactor en het laat zien dat uiteindelijk een betere voorspelling van gegevens wordt verkrijgt.

Wij zijn van mening dat de meting van hoge nauwkeurigheid zeer nuttig kan zijn om de TF-DNA-binding voor het hele systeem of voor allerlei interacties beter te begrijpen.