Name: Evaluatie van de virulentie en pathogenese van Aeromonas infectie in een Model Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Leer virulentie-evaluatie van Aeromonas-infecties in Caenorhabditis elegans. Deze methode maakt toxiciteitsvergelijking tussen en binnen soorten mogelijk voor microbiologisch onderzoek naar gastheer-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar voor de hulp uit de C. elegans kern facility in Taiwan en de diagnostische microbiologie en antimicrobiële resistentie laboratorium van nationale Cheng Kung universiteitsziekenhuis voor het verstrekken van de Aeromonas isoleert. We erkennen ook de Caenorhabditis genetica Center (CGC), en de WormBase. Wij danken ook Savana Moore voor het bewerken van het manuscript.
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en technologie van Taiwan (meest 105-2628-B-006-017-MY3) en het nationale Cheng Kung universitair ziekenhuis (NCKUH-10705001) aan P.L. Chen.

1. voorbereiding van de voedingsbodem
Opmerking: Zie tabel 1 voor de voorbereiding van de oplossing.
<ol><li>Los om te bereiden M9 middellange12, 1.5 g van KH2PO4, 5.66 g nb2HPO4en 2,5 g NaCl in 500 mL gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten wachten tot afgekoeld tot kamertemperatuur en Voeg 0,5 mL 1 M MgSO4 vóór eerste gebruik.</li>
	<li>Los om te bereiden nematode groei medium (NGM)12, 3 g NaCl, 2,5 g bacteriële pepton en 20 gram agar in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. wacht totdat afgekoeld tot 55 ° C in een waterbad en voeg vervolgens 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL 5% cholesterol in ethanol en 25 mL fosfaatbuffer. Swirl aan meng goed.</li>
	<li>Giet ongeveer 5 mL NGM in elk 6 cm petrischaal. Vermijd zeepbel productie op het oppervlak van de plaat. Laat de platen bij kamertemperatuur voor 1 nacht en pakket te slaan bij 4 ° C. Breng terug op kamertemperatuur voordat gebruik.</li>
	<li>Ter voorbereiding van verrijkte NGM (ENGM), Los 3 g NaCl, bacteriële pepton 5 g en 1 g gistextract 30 g agar in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. wacht totdat afgekoeld tot 55 ° C in een waterbad en voeg 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL 5% cholesterol in ethanol en 25 mL fosfaatbuffer. Swirl aan meng goed.</li>
	<li>Giet ongeveer 10 mL ENGM in elke 9 cm petrischaal. Vermijd zeepbel productie op het oppervlak van de plaat. Laat de platen bij kamertemperatuur voor 1 nacht en pakket te slaan bij 4 ° C. Breng op kamertemperatuur vóór gebruik.</li>
	<li>Te bereiden S middellange12mix 40 mL S basale, 0.4 mL 1 M kaliumcitraat, metalen 0.4 mL trace oplossing, 0,12 mL 0,12 mL 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, 40 µL van 5% cholesterol in ethanol en 1 mL van 8 mM FudR vóór gebruik.</li>
</ol>2. synchronisatie van C. elegans6,9,12
<ol><li>Wassen ongeveer 2.000 wormen in de fase van de gravid-volwassene met 10 mL steriel gedeïoniseerd water in een tube van 15 mL. Spoelen de bacteriën 3 x, de wormen houden aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Centrifugeer het monster voor 1 min bij 500 x g te trekken van de wormen. Verwijder het supernatant en houden de wormen in 3,5 mL gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Voeg 1 mL NaOCl (10-15%) en 0,5 mL 5 M KOH in de buis. Mix gelijkmatig door schudden voor < 6 min lyse van de organen van de worm.</li>
	<li>Nadat de eieren zijn vrijgesteld van de wormen, voeg toe 10 mL gedeïoniseerd water om te stoppen met de lysis. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.200 x g pull-down de eieren en het verwijderen van het supernatans dat zo veel mogelijk. Wassen met 15 mL M9 middellange minstens 3 x. Opmerking: Zie stap 1.1 voor de samenstelling van M9 medium.</li>
	<li>Eieren in 1 mL M9 medium houden. Transport van eieren naar een 3,5 cm schotel voor incubatie gedurende één nacht (ongeveer 12-18 h) bij 20 ° C. Opmerking: Na de incubatie, de eieren zullen uitkomen om de worm larve die wordt genoemd als eerste stadium van de larve (L1).</li>
	<li>Pipetteer uit 10 µL van L1 wormen in M9 medium. Worm tellen en bereken dat de concentratie van L1 wormen in M9 medium.</li>
	<li>Zaad hooguit 10.000 geïncubeerd L1 fase wormen met een pipet op een 9 cm ENGM plaat verspreid met Escherichia coli OP50.<ol>
<li>In deze stap gekweekt verspreiding 0,5 mL's nachts E. coli OP50 met Luria Bertani (LB) Bouillon op de plaat van de ENGM 9 cm. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 tot 18 h Opmerking: Om besmetting te voorkomen, de verspreiding stap moet worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.</li>
		<li>Afkoelen tot kamertemperatuur alvorens het zaaien van L1 wormen. Zaad hooguit 10.000 geïncubeerd L1 fase wormen op de ENGM plaat met E. coli OP50.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de wormen bij 20 ° C voor 44 h of totdat ze naar de 4th larve (L4) fase groeien. Opmerking: Zie stap 1.3 voor de samenstelling van ENGM medium. Een worm is een witte stip in halve maan vorm in het midden van de kant van het lichaam in de L4-stadium.</li>
	<li>Gebruik de gesynchroniseerde L4 fase in de volgende tests wormen. Wild type die N2 in de kwantitatieve analyse van C. elegans , overleven met Aeromonas dhakensis en de kwantitatieve analyse van C. elegans , vloeibare toxiciteit met Aeromonas dhakensis wormengebruiken. Gebruik RW1596 wormen (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) in de C. elegans spier necrose assay met Aeromonas dhakensis.</li>
</ol>3. C. elegans Survival Assay met Aeromonas6,9
<ol><li>Kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50 en cultuur met de pond-Bouillon 2 mL respectievelijk bij 37 ° C gedurende 16 uur op de dag van L1 wormen op het verspreiden met E. coli OP50 ENGM zaaien. Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moet deze stap worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap. Hier, de volgende bacteriestammen werden gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Meet de extinctie van de600 OD van bacteriële Bouillon en aanpassen van de bacteriële Bouillon OD600 = 2.0 met de pond-Bouillon.</li>
	<li>Ter plaatse en verspreid 30 µL van bacteriële Bouillon elke 6 cm NGM plaat. De platen bij kamertemperatuur 's nachts cultuur. Opmerking: Zie stap 1.2 voor de samenstelling van NGM medium.</li>
	<li>Op de dag dat de L1 wormen naar het werkgebied L4 groeien, willekeurig plukken en 50 wormen overbrengen in een NGM plaat met elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50.</li>
	<li>Incubeer de platen van de NGM bij 20 ° C, totdat de test is voltooid.</li>
	<li>Elke dag tot de laatste worm dood is alle de levende wormen naar een nieuw bereid NGM plaat met bacteriën en tellen het aantal, dood leven, en sensor wormen overbrengen. Opmerking: Overbrengen van wormen naar een vers voorbereid NGM plaat elke dag voor het onderhoud van infectie, zelfs als met behulp van steriele wormen (b.v.glp-4, of met FudR).</li>
	<li>De curven van de overleving gebaseerd op de dagelijkse berekening van de gegevens worden uitgezet.</li>
</ol>4. C. elegans vloeibare toxiciteit Assay met Aeromonas7
Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moeten stappen worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
<ol><li>De dag na het zaaien van de L1 wormen op de plaat van de ENGM uitbreiden met E. coli OP50, kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen E. coli OP50 en cultuur met 5 mL de pond-Bouillon elke bij 37 ° C gedurende 16 uur. Opmerking: In het protocol, werden de volgende bacteriën stammen gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Meet de extinctie van de600 OD van de bacteriën Bouillon.</li>
	<li>Centrifugeer de bacteriële Bouillon bij 3500 x g gedurende 15 minuten te verwijderen van de pond-Bouillon. Resuspendeer de bacteriën en aanpassen van de bacteriële Bouillon OD600 = 3.0 met S medium. Voeg 195 µL van bacteriële Bouillon in S middellange tot ten minste 8 wells van een 96-wells-plaat. Opmerking: Zie stap 1.6 voor de samenstelling van S medium.</li>
	<li>De wormen L4 op de plaat van de ENGM met E. coli OP5 M9 medium met afwassen. Pas de worm oplossing tot een concentratie van 5 wormen per µL en 5 µL van de worm-oplossing toevoegen aan elk putje van de 96-wells-plaat. Ervoor zorgen dat er ongeveer 25 wormen per putje.</li>
	<li>Incubeer de 96-wells-plaat op een shaker bij 200 t/min bij 25 ° C.</li>
	<li>Het aantal levende wormen en dode wormen na 24, 48 en 72 h. de overlevingscijfers van elk putje met de volgende formule Bereken: (levende wormen/totaal worms) × 100%.</li>
	<li>Teken een spreidingsgrafiek plot met de berekening van de dagelijkse gegevens.</li>
</ol>5. C. elegans spier necrose Assay met Aeromonas6
Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moeten deze stappen worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
<ol><li>Op de dag de L1-wormen worden overgeënt op de ENGM verspreid met E. coli OP50, kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen E. coli OP50 en cultuur met 2 mL LB Bouillon, elke bij 37 ° C gedurende 16 uur. Opmerking: Hier, de volgende bacteriën stammen werden gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Meet de extinctie van de600 OD van de bacteriën Bouillon en aanpassen van de bacteriën Bouillon OD600 = 2.0 met de pond-Bouillon. Ter plaatse en verspreiden van 30 µL van bacteriële Bouillon op 6 cm NGM platen. De platen bij kamertemperatuur 's nachts cultuur.</li>
	<li>Op de dag groeien de wormen van L1 naar de L4-fase, de 50 wormen overdracht aan elke NGM plaat met elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50. Incubeer de platen NGM bij 20 ° C. Wormen elke 24 h overbrengen in nieuw bereid NGM platen met bacteriën.</li>
	<li>Het nemen van beelden van de spier met behulp van een fluorescentie Microscoop.<ol>
<li>Keuze willekeurig 10 wormen op een 2% agarose gel in M9 medium op een dia. De wormen met 2 µL van 1% natriumazide M9 medium op agarose voor minder dan 5 min voordat de opnamen te verlammen.</li>
		<li>Plaats een cover slip en vastleggen van de beelden van de spier met behulp van een groen fluorescente proteïne (GFP) filteren op een fluorescente microscoop met charge - coupled apparaat camera. Vastleggen van de beelden van de spier op 24, 48, en 72 uur na de L4-fase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeren beeld-analyse en figuur voorbereiding met een beeld processing software. Opmerking: De definities van de scores en de spier schade niveaus worden weergegeven in Figuur 3, waarvan de criteria als volgt worden weergegeven: 3 punten voor ontbrekende spiervezels; 2 punten voor gescheurde of gebroken spiervezels; 1 punt voor gebogen spiervezels; 0 punten voor gezonde spiervezels.</li>
</ol>6. statistische Analyses
<ol><li>Voer alle experimenten minimaal drie keer onafhankelijk.</li>
	<li>Gebruik de methode Kaplan-Meier te beoordelen van de C. elegans overleving testen, en de log-rank test in het analyseren van overleving verschillen. Statistische significantie vastgesteldop 0.05.</li>
	<li>Van de Student t-test gebruiken om de statistische resultaten van de tests van C. elegans vloeibare toxiciteit voor de twee verschillende groepen te analyseren. One-way ANOVA-test in het analyseren van de verschillen tussen drie of meer waarden voor één onafhankelijke variabele gebruiken. Statistische significantie vastgesteldop 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>Parker, J. L., Shaw, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas+spp.+clinical+microbiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aeromonas spp. clinical microbiology and disease.</a> Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft-tissue+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tract+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biliary tract infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).</li>
<li>Chuang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+clinical+characteristics+among+Aeromonas+hydrophila%2C+Aeromonas+veronii+biovar+sobria+and+Aeromonas+caviae+monomicrobial+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia.</a> Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft+tissue+infection+caused+by+Aeromonas+species+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Disease+Model+of+Muscle+necrosis+caused+by+Aeromonas+dhakensis+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 2058(2016).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+diversity+among+bacteremic+Aeromonas+isolates%3A+ex+vivo%2C+animal%2C+and+clinical+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences.</a> PLoS One. 9 (11), 111213(2014).</li>
<li>Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+infection+models+in+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29+to+study+the+pathogenesis+of+Aeromonas+hydrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1219(2016).</li>
<li>Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIOK-1+Is+a+Suppressor+of+the+p38+MAPK+Innate+Immune+Pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Immunology. 9, 774(2018).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Caenorhabditis+elegans+infection+by+bacterial+and+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens.</a> Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Engelmann, I., Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in C. elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).</li>
<li>Feinbaum, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Pseudomonas+aeruginosa+virulence-related+genes+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

C. elegans is een nematode bacterivorous dat natuurlijk inname bacteriën als voedsel en een ingewikkeld aangeboren immuniteit voor bacteriën tijdens de evolutionaire proces heeft ontwikkeld. Twee van de belangrijke organen, onderhouden en ondersteunen van de immuniteit zijn de opperhuid en darm9,-13. De epidermis en de bands van spier van C. elegans lijken op de structuren van de soft-weefsel in zoogdieren en mensen6. Van...

De menselijke pathogenen, Aeromonas, is klinisch aangetoond dat het veroorzaken van gastro-enteritis, wond infecties, bloedvergiftiging en1,2van de infecties van de urinewegen. Meest geassocieerde ziekten bij de mens zijn gemeld te worden geassocieerd met vier bacteriële soorten: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniien Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. onder Aeromonas besmettelijke ziekten, infecties van het zachte weefsel kunnen leiden tot ernstige morbiditeit en mortaliteit bij de mens. Van de nota is spieren necrose de meest ernstige vorm van weke delen-infectie6. Observatie van de overleving, spieren necrose van Caenorhabditis elegans na infectie is een handige methode om te speculeren op de toxiciteit van Aeromonas.
Wetenschappers hebben al talrijke modelorganismen om te bestuderen van bacteriële infecties ontwikkeld. In eerdere studies, werden muizen, zebrafishes en nematoden gebruikt als diermodellen om de pathogenese en de virulentie van Aeromonas6,7,8te studeren. Elke diermodel heeft haar ' voordelen en toepassingen. De model-organisme, Caenorhabditis elegans, is een nematode bacterivorous welke inname bacteriën als foodnaturally. C. elegansheeft ontwikkeld een ingewikkeld ingeboren immune systeem tegen bacteriële infecties in de loop van de evolutie. Onder de stress van een bacteriële infectie, heeft C. elegans bewezen een uitstekende infectie model te bestuderen van de bacteriële pathogenese van Aeromonas6,7,9 en andere ziekteverwekkers Als de schimmel10 en enterohemorragische Escherichia coli O157:H711. Er is echter nog steeds geen publicatie die zich op de methodologie richt bij het gebruik van C. elegans als een model voor het bestuderen van de virulentie van Aeromonas.
Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie met C. elegans als een dierlijk model: testen voor overleving, vloeibare toxiciteit en spier necrose. Deze methoden zijn een handige manier voor evaluatie van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas en verbetering van het inzicht van de pathogenese van Aeromonas.

<table><tbody><tr><td>Shaker incubator</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>Bacterie incubatie</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021519455</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-05</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021914405</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>31434</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SIGMA</td><td>M7506</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td>Difco</td><td>214530</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>SIGMA</td><td>C8503</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>SIGMA</td><td>32205</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>SIGMA</td><td>P5958</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>6 cm Petri plate</td><td>ALPHA PLUS</td><td>46</td><td>Agar plaat bereiding</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>FALCON</td><td>353072</td><td>vloeibare test</td></tr><tr><td>bacteriële pepton</td><td>Affymetrix/USB</td><td>AAJ20048P2</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>gist extract</td><td>SIGMA</td><td>92144</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>citroenzuur&bull;H2O</td><td>SIGMA</td><td>C1909</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>tri-kalium citraat&bull;H2O</td><td>SIGMA</td><td>104956</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>FudR&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>1271008</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>disodium EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E1644</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO4&bull;7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>215422</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>MnCl2&bull;4 H2O</td><td>SIGMA</td><td>221279</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>ZnSO4&bull;7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>204986</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>CuSO4&bull;5 H2O</td><td>SIGMA</td><td>C8027</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>tryptone</td><td>SIGMA</td><td>16922</td><td>Voedingsbodem bereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope systeem</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipase Ti inverted&nbsp;</td><td>microscoop beeldvorming</td></tr><tr><td>Wetenschappelijke CCD Camera</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>Retiga-2000R Fast 1394&nbsp;</td><td>microscoop beeldvorming</td></tr></tbody></table>

evaluatie van de virulentie en pathogenese van aeromonas infectie in een model caenorhabditis elegans

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

De menselijke pathogenen Aeromonas is klinisch aangetoond dat het veroorzaken van gastro-enteritis, wond infecties, sepsis en urineweginfecties. Meest menselijke ziekten zijn gemeld te worden geassocieerd met vier soorten bacteriën: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniien Aeromonas caviae. De model-organisme Caenorhabditis elegans is een Bacterivoor waarmee een uitstekende infectie model voor het bestuderen van de bacteriële pathogenese van Aeromonas. Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie met behulp van een C. elegans -model, met inbegrip van overleven, vloeibare toxiciteit en spier necrose testen. De resultaten van de drie methoden voor het bepalen van de virulentie van Aeromonas waren consistent. A. dhakensis bleek te zijn de giftigste onder de 4 grote Aeromonas soorten klinische infecties veroorzaken. Deze methoden worden weergegeven als een handige manier om de evaluatie van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas en bijdragen aan ons begrip van de pathogenese van Aeromonas infectie.

Door het volgen van de bovenstaande protocollen, is het gemakkelijk om te differentiëren tussen de toxicities van de vier Aeromonas stammen. De bepaling van de overleving van de C. elegans is afgebeeld in Figuur 1. De overlevingskansen bij C. elegans besmet met Aeromonas soorten, weergegeven in volgorde van hoog naar laag waren: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila, en A. dhakensis. Hoewel er diversiteit o...

Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie in C. elegans. Met behulp van deze handige methoden, is het gemakkelijk om te evalueren van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas .

Evaluatie van de virulentie en pathogenese van Aeromonas infectie in een Model Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het interactieveld gastheer-ziekteverwekker, zoals de pathogeniteit en virulentie van bacteriële infectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de toxiciteit onder en binnen Aeromonas-soorten kunnen evalueren en kunnen bijdragen aan ons begrip van de pathogenese van Aeromonas-infectie. Om te beginnen wassen ongeveer 2.000 aangetrokken volwassen wormen met steriel gedeïmiseerd water.Herhaal de was drie keer houden van de wormen aan de onderkant van de buis. Na het centrifugeren verwijderen de wormen de supernatant en houden de wormen in 3,5 milliliter gedeïmiseerd water. Voeg een milliliter natriumhypochloriet en 0,5 milliliter kaliumhydroxide toe aan de buis.Schud vervolgens zes minuten de buis om de wormlichamen te lyse. Nadat de eieren zijn vrijgegeven, voeg 10 milliliter gedeïmiseerd water toe om de lyse te stoppen. Centrifuge vervolgens de buis om de eieren naar beneden te trekken en zoveel mogelijk van de supernatant te verwijderen.Was de eieren met 15 milliliter M9 medium ten minste drie keer. Breng de eieren op een schaal van 3,5 centimeter en broed ze één nacht uit op 20 graden Celsius. Verwijder hierna 10 microliter L1-wormen en M9-medium van de plaat.Tel de wormen en verkrijg de concentratie L1-wormen in het M9-medium. Neem met behulp van een pipet 0,5 milliliter E.coli OP50 LB bouillon en verdeel deze op een ENGM-plaat. Dan incubeer de plaat op 37 graden Celsius voor 16 tot 18 uur.Koel het ENGM af op kamertemperatuur. Dan zaad geïncubeerd L1 wormen op een ENGM plaat met E.coli OP50. Broed de wormen uit op 20 graden Celsius tot ze het L4-stadium bereiken.Selecteer eerst een enkele kolonie van elk van de vier Aeromonas-stammen en kweek ze volgens het tekstprotocol. Meet vervolgens de OD 600-absorptie van de bacteriële bouillon en pas deze aan totdat de absorptie gelijk is aan 2,0. Volgende plek en verspreid 30 microliter bacteriële bouillon van elke stam in NGM platen.Selecteer en breng de eerder voorbereide L4-wormen willekeurig over naar de NGM-platen met de Aeromonas-stammen. Vervolgens broeden de platen op 20 graden Celsius totdat de test is voltooid. Elke dag brengen alle levende wormen naar een nieuwe NGM plaat met bacteriën.Tel de aantallen levende, dode en sensorwormen elke dag tot de laatste worm dood is. Na het kweken van Aeromonas stammen en het meten van hun absorptie zoals eerder beschreven, centrifugeren de bacteriële bouillon op 3, 500 g's gedurende 15 minuten. Pas de bacteriële bouillon aan met S Medium.En voeg 195 microliter bacteriële bouillon toe in het S-medium tot acht putten van een 96-putplaat. Was de wormen van de ENGM-plaat met hen M9 medium. Pas vervolgens de concentratie van de wormoplossing aan op vijf wormen per microliter.Voeg vijf microliter van de wormoplossing toe aan elk van de putten van de 96-putplaat. Broed de plaat op een shaker, en tel het aantal levende wormen op 24, 48 en 72 uur. Na het kweken van Aeromonas stammen en het aanpassen van de absorptie volgens de tekst protocol plek en verspreid de bacteriële bouillon op NGM platen.Breng hierna 50 L4-wormen over naar elke NGM-plaat. Elke 24 uur brengen de wormen over op verse NGM platen. Selecteer willekeurig 10 wormen en breng ze over naar een 2%agarose gel in M9 medium op een dia.Positioneer ten slotte een coverslip op de gel en leg spierbeelden vast met een groen fluorescerend eiwitfilter op een fluorescerende microscoop uitgerust met een camera. In dit protocol werden de toxiciteiten van vier Aeromonas-stammen beoordeeld. De overlevingskans van C.elegans besmet met Aeromonas soorten was het hoogst in tests met behulp van A.caviae, en laagste in testen met behulp van A.dhakensis.In een vloeibare toxiciteit test overleving van C.elegans aanzienlijk afgenomen wanneer besmet met A.dhakensis of A.hydrofilie. In de spiernecrose test graden van spierschade gevarieerd onder de Aeromonas soorten. A.caviae veroorzaakte de minste spierschade, terwijl A.dhakensis de meeste spierschade veroorzaakte.De methoden beschreven in deze video bieden een handige manier om de diversiteit van de virulentie te onderscheiden tussen en binnen Aeromonas-soorten. Daarnaast is het ook een betrouwbaar model om de interactie tussen een ziekteverwekker en gastheer te bestuderen.

evaluating-virulence-pathogenesis-aeromonas-infection-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Anderson, Q. L., et al. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a liquid-based assay where genetically modified C. elegans larvae are exposed to pathogenic bacteria in a microplate. Bacterial toxins secreted into the medium induce host stress and death. A fluorescent dye stains dead worms, allowing imaging-based quantification of mortality to assess genetic susceptibility or resistance.

Assessing Pathogenic Bacteria–Induced Mortality in C. elegans Larvae

Source: Chen, Y., et al. Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a survival assay using C. elegans to model Aeromonas pathogenesis, where oral ingestion of the bacteria leads to intestinal infection and mortality, enabling quantitative assessment of bacterial virulence in a live host system.

Modeling Aeromonas Pathogenesis in C. elegans Using a Survival Assay

Source: Chen, Y., et al. Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the C. elegans Liquid Toxicity Assay with Aeromonas, a method used to evaluate bacterial virulence by measuring worm survival in a nutrient-limited liquid environment. The assay reveals strain-specific pathogenicity based on the extent of toxin-induced damage and mortality in C. elegans.

Evaluating Bacterial Virulence Using the C. elegans Liquid Toxicity Assay

Source: Chen, Y. et. al., Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a muscle necrosis assay in C. elegans (Caenorhabditis elegans) using pathogenic Aeromonas strains. By feeding green fluorescent protein (GFP)-expressing worms on Aeromonas-seeded plates, the assay models bacterial infection and reveals tissue damage through fluorescence imaging. The progressive loss of muscle structure and GFP...

Muscle Necrosis Assay in C. elegans Induced by a Pathogenic Aeromonas Strain

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme...

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Hier beschrijven we een protocol dat is een aanpasbaar, hele gastheer, hoge-content screening tool die kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties en worden gebruikt voor drugontdekking.

Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

Wilde Caenorhabditis-nematoden worden geassocieerd met veel microben, vaak in het darmlumen of infecteren de darm. Dit protocol beschrijft een methode om niet-tecultureerbare microben te verrijken die de darm koloniseren, gebruikmakend van de weerstand van de dauer cuticula.

Selectieve reiniging van wilde caenorhabditis nematoden om te verrijken voor intestinale microbioombacteriën

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Leer virulentie-evaluatie van Aeromonas-infecties in Caenorhabditis elegans. Deze methode maakt toxiciteitsvergelijking tussen en binnen soorten mogelijk voor microbiologisch onderzoek naar gastheer-pathogeen interacties.

Evaluatie van de virulentie en pathogenese van Aeromonas infectie in een Model Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen