Name: Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer technieken om pathogeen-efflux te analyseren met in vitro- en in vivo-infectieassays. Deze methoden evalueren efflux-efficiëntie en karakteriseren pathogenen na uitstoot voor gastheer-pathogeenonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Muizen werden humaan behandeld overeenkomstig alle richtlijnen van de desbetreffende overheid voor de verzorging en gebruiken van proefdieren van het National Institutes of Health en het gebruik ervan werd goedgekeurd voor deze hele studie door de Universiteit van Miami institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité (protocol 16-053).
1. voorbereiding van de cellen voor infectie
<ol><li>Muis macrofaag-achtige cellijn RAW 264.7 in DMEM weefsel voedingsbodems aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (voortaan aangeduid als DMEM/FCS) doorgeven met behulp van een kolf van 125 mL en een weefselkweek incubator gehandhaafd op 37 °C/5% CO2.</li>
	<li>De dag voordat de infectie, gebruik een cel schraper te verwijderen van cellen uit de uitbreiding kolf en verzamelen in een schroefdop van de conische tube van 15 mL. Cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten centrifugeren, decanteren supernatant schorten de cel pellet in 1 mL DMEM/FCS (zonder antibiotica) en bepalen van de titer die met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.</li>
	<li>
Aanpassen van de titer tot 2 x 106 cellen/mL en Voeg 0,10 mL (2 x 105 cellen) aan putjes van een 48-well weefselkweek schotel. Zorg ervoor dat de celsuspensie heeft betrekking op het gehele oppervlak van de put.
	<ol>
<li>De cellen van de plaat in extra putten voor een latere bron van geconditioneerde media. Ook het plaatsen van 0,10 mL van DMEM/FCS in drie aanvullende bronnen om te dienen als een 'cel oncontroleerbaar'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na een nacht bebroeden in een incubator weefselkweek op 37 °C/5% CO2. De volgende dag, Verwijder niet uit incubator totdat de bacterie entmateriaal is bereid en klaar voor gebruik.</li>
</ol>2. voorbereiding Listeria monocytogenes (Lm) van de infecties
<ol><li>Hersenen-hart infusie (BHI) 2 mL beënten met een één kolonie van een vers-streaked agarplaat (< 2 dagen) van Lm en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 130 rotaties/min.</li>
	<li>De volgende dag, Voeg 0,10 mL overnachting cultuur tot 2 mL pre opgewarmd BHI en blijven incuberen bij 37 ° C met schudden tot de optische dichtheid (OD600) tussen 0.4 en 0.6 is.</li>
	<li>Geschatte bacteriële titer met behulp van een empirisch afkomstige conversieformule bepalen. In ons lab, een exponentieel groeiende Lm cultuur in BHI is ongeveer 1.3 x 109 kolonievormende eenheden (kve) /OD600. Minimaliseer de hoeveelheid tijd bacteriële culturen worden blootgesteld aan kamertemperatuur.</li>
	<li>Pas de titer tot en met 5 x 107 CFU/mL voorverwarmde DMEM/FCS als oplosmiddel gebruiken vlak voor infectie.</li>
</ol>3. infectie
<ol><li>Werkt snel en precies, Voeg 20 µL (1 x 106 CFU; multipliciteit van infectie, MOI = 5) van de vers bereide Lm entmateriaal (stap 2.4 hierboven) te putten door lichtjes kantelen van de schotel en zorgvuldig het plaatsen van het uiteinde van de pipet in de bovenliggende media; Opmerking: raak de wanden van de put met de pipet-tip.</li>
	<li>Zachtjes Pipetteer de inhoud van elk putje om ervoor te zorgen volledige mengen; niet schudden of kantelen aanzienlijk de plaat, zoals dit zal Lm verspreid over de muren van de put. Cel cultuur schotel terugkomen 37 °C/5% CO2 incubator.</li>
	<li>Bereid een 10 µg/mL gentamicine oplossing met behulp van geconditioneerde media uit niet-geïnfecteerde putten als oplosmiddel.</li>
	<li>Op 30 minuten na de infectie (mpi), zorgvuldig de inhoud van de evenals vóór en terugkeer cel cultuur schotel toevoegen 30 µL van de gentamicine oplossing (eindconcentratie 2,5 µg/mL) en zachtjes Pipetteer aan 37 °C/5% CO2 incubator.</li>
	<li>Oogst op 60 mpi, passende putten voor CFU assay (60 mpi tijdstip) of FCM analyse (zoals hieronder beschreven in de hoofdstukken 4 en 5, respectievelijk).</li>
	<li>Voor de resterende putten, op verschillende tijdstippen daarna ofwel oogst cellen zoals vóór of, voor de bepaling van de opkomst Lm , volledig uit put media verwijderen en met 150 µL van gentamicine-vrije geconditioneerde media vervangen.</li>
</ol>4. bemonstering van de verwerking en analyse van intracellulaire en opkomende Lm door CFU Assay
<ol><li>Oogsten, iets tilt de schotel en verwijder voorzichtig de hele media uit de put. Voeg 0,50 mL gedestilleerd steriel water (dsH2van O) naar de waterput. Na 30 s, dragen de resulterende water lysate (100) voor een tube van 1,5 mL microcentrifuge en vortex krachtig gedurende 10 s.</li>
	<li>10-1 en 10-2 verdunningen voorbereiden door toe te voegen of 4.5 µL of 50 µL van het water lysate tot 450 µL van dsH2O en kort vortex om homogenisatie van het mengsel.</li>
	<li>Verspreiden van 50 µL van de 100, 10-1 en/of 10-2 monsters op lysogenie Bouillon (LB) agar platen.</li>
	<li>Assay voor opkomende Lm (stap 3.6 hierboven), verwijderen van 10 µL van de overlay-media en het in twee 5 µL aliquots verdelen: aan één aliquot toevoegen 5 µL van DMEM/FCS en het tweede monster 5 µL van DMEM/FCS met 5 µg/mL gentamicine. Het laatste besturingselement wordt onderscheid gemaakt tussen extracellulaire Lm (gentamicine gevoelig) en intracellulaire Lm (gentamicine resistente) in de daaropvolgende CFU assay.</li>
	<li>Na 5 min bij kamertemperatuur, 90 µL van dsH2O, vortex krachtig gedurende 10 s en verspreiding 50 µL toevoegen op LB agar platen.</li>
	<li>Opsommen van Lm kolonies op LB agar platen na 2 dagen incubatie bij 37 ° C.</li>
</ol>5. bemonstering van de verwerking en analyse van intracellulaire en opkomende Lm door Stroom Cytometry (FCM)
<ol><li>Opstellen RAW 264.7 cellen zoals beschreven in stap 1.1-4. Aanpassen van cellen aan 1 x 106 cellen/mL en 1 mL (1 x 106 cellen) toe te voegen aan putjes van een 6-well weefselkweek schotel.</li>
	<li>Bacterie entmateriaal bereiden zoals beschreven in stap 2.1-2.3 en infecteren van cellen met een volume van entmateriaal overeenkomt met een MOI van 50 (5 x 107 CFU).</li>
	<li>1,5 uur post infectie (hpi), media ophalen eerste set van putten en plaats in een tube microcentrifuge 1,5 mL met 500 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) en plaats op ijs totdat alle putjes zijn verwerkt.</li>
	<li>Het verzamelen van intracellulaire Lm, voeg 1 mL dsH2O naar de waterput en na 60 s, de resulterende water lysate overbrengen in een tube microcentrifuge 1,5 mL met 500 µL van 4% PFA. Vortex krachtig gedurende 10 s en plaats op ijs totdat alle putjes zijn verwerkt. (Monster verwerking is beschreven in stap 5,8 hieronder.)</li>
	<li>Voor de resterende putten, media verwijderen en vervangen door 1 mL van DMEM/FCS met 5 µg/mL gentamicine te doden extracellulaire Lm en cellen snel terug te keren naar incubator.</li>
	<li>Na 30 min (2 hpi) media verwijderen en vervangen door DMEM/FCS zonder gentamicine.</li>
	<li>Na 2 en 4 h (4 en 6 hpi) nemen de tweede en derde keer punten door het verzamelen van media en lysates als stap 5.3 en 5.4.</li>
	<li>Centrifugeer buizen bij 10.000 x g gedurende 7 min. verwijderen bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet.</li>
	<li>Opschorten van elke pellet in kleuring cocktail van 50 µL van 4% PFA en 15 µL van phalloidin. Incubeer buizen in het donker bij 4 ° C gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Voeg na een incubatieperiode van 1 mL FACS buffer aan elke buis en Pipetteer omhoog en omlaag te mengen.</li>
	<li>Spin buizen bij 10.000 x g gedurende 7 min. verwijderen bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet.</li>
	<li>Opschorten van elke pellet in 400 µL van FACS buffer voor onmiddellijk gebruik of 200 µL van FACS buffer en 200 µL van 4% PFA als slaan voor latere analyse.</li>
	<li>Voorbeelden van op een stroom cytometry uitvoeren en analyseren van de verzamelde gegevens.</li>
</ol>6. bemonstering van de verwerking en analyse van Lm kolonisatie en Host Reacties in de lever
<ol><li>Voorbereiden op Lm infectie zoals beschreven in stap 2.1-2.3.</li>
	<li>Bereken de benodigde hoeveelheid subcultuur voor gewenste titer van 3 x 106 CFU/mL.</li>
	<li>Verdun de hoeveelheid berekende bacteriën met voorverwarmde Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) in een eindvolume van 1 mL enkel voorafgaand aan de infectie. Dit is de input entmateriaal die is geïnjecteerd in de muis.</li>
	<li>Behulp van een 28 G½ 100U insuline spuit, trekken 100 µL (3 x 105 van CFU) input entmateriaal en zichtbare luchtbellen te verwijderen.</li>
	<li>Plaatst u de muisaanwijzer (stam C57BL/6; mannen tussen 6 en 12 weken oud) in het bedrijf terughoudendheid en gebruik warm water (niet meer dan 45 ° C) de staart ader te verwijden, dan de invoer entmateriaal injecteren in de ader.</li>
	<li>Plaat 10-2 en 10-3 verdunningen van het input entmateriaal op LB agar 10bcm platen en na een nacht bebroeden bij 37 ° C te bepalen van de werkelijke invoer dosering.</li>
	<li>Op 18 hpi, humaan euthanaseren muis (CO2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie) en het gebruik van steriele schaar geslepen open muis buikvlies voor het verzamelen van de frontale kwab van de lever met behulp van afzonderlijke paren schaar of pincet voor de buitenkant en binnenkant van de muis. Plaats de lever in een 6 cm petrischaal op ijs.</li>
	<li>Snijd de lever in kleine blokjes en leg in een glazen ampul met een magnetische roer bar. Voeg toe 2 mL 2 mg/mL collagenase D gereconstitueerd in DMEM zonder FCS. Incubeer flesjes bij 37 ° C op een magneetroerder voor 30−45 min. Zodra het weefsel is gehomogeniseerd, voeg 3 mL DMEM/FCS voor inactivering van de collagenase.</li>
	<li>Filtreer de cellen door een 70 µm cel zeef in een conische buis, meer DMEM/FCS toe te voegen indien nodig.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 min, verwijderen van supernatant en Suspendeer cel pellet in 500 µL van ACK buffer lyse van rode bloedcellen.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. in ACK buffer. Cellen in 1 mL DMEM/FCS opschorten.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 min, verwijderen van supernatant en Suspendeer in 1 mL van DMEM/FCS. Vervolgens met behulp van een hemocytometer of een teller geautomatiseerde cel cellen te tellen.</li>
	<li>1 x 106 cellen naar 1,5 mL microcentrifuge buis en spin te pellet overbrengen. Dan opschorten in 1 mL dsH2O en vortex Lyse de cellen. Typeplaatje 50 µL op LB platen op onverdunde en 10-2 verdunningen en Incubeer bij 37 ° C bij het inventariseren van Lm CFU p.a..</li>
	<li>1 x 106 cellen overboeken naar FACS buizen voor elk weefsel monster volgens de graven van de cel en wassen met 1 mL FACS buffer.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof.</li>
	<li>Voorbereiden van een antilichaam cocktail met de antilichamen van belang op basis van de aanbevolen concentratie voor elke antilichaam en FACS buffer. Zie Tabel van materialen voor aanbevolen hoeveelheden gebruikt bij de analyse.</li>
	<li>Schorten pellet in 100 µL van antilichaam cocktail en buizen in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.</li>
	<li>Na incubatie, voeg toe 2 mL FACS buffer aan elke buis en schorten cellen.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Vervolgens Suspendeer de pellet in 400 µL van FACS buffer voor onmiddellijk gebruik of 200 µL van FACS buffer en 200 µL van 4% PFA als opslaan voor later.</li>
	<li>Analyseren van cellen door stroom cytometry (zie stap 5.13).</li>
</ol>

<ol><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
<li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li>
<li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li>
<li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li>
<li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085(2018).</li>
<li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li>
<li>Blériot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut%2C+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li>
<li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li>
<li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li>
<li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+%28HRI%29+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754(2013).</li>
<li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2%CE%B1+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707(2018).</li>
<li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).</li>
<li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vanwege zijn snelle en processive cellulaire infectie programma is Lm een ideale pathogen sonde van cellulaire activiteiten die van invloed zijn infectie. Een aantal gastheer factoren geïdentificeerd die positief dan wel negatief Lm cellulaire infectie11,12,13,14 beïnvloeden. Twee dergelijke gastheer factoren gekenmerkt in ons laboratorium, Perforine-2 en de Heem geregeld remm...

Infectie-gebaseerde experimentele modellen zijn inherent uitdagend vanwege hun afhankelijkheid van de startende staat voorwaarden van de gastheer en ziekteverwekker, de verschillende pathogen infectie strategieën en de moeilijkheid van de toerekening van de pathogeen - en gastinstellingen gestuurde processen gebaseerd op de resultaten. De bacterie Listeria monocytogenes (Lm) is een ideale pathogen sonde host defense reacties vanwege haar genetische en microbiologische werkwillig, haar snelle en processive cellulaire infectie-strategie en de relatief duidelijk geworden relatie tussen de mobiele - en organismic-level infectie fenotypen. De cellulaire infectie van Lm verloopt via vier fasen1: (i) cellulaire invasie die wordt afgesloten met Lm worden omsloten binnen een vacuole; (ii) Lm-gestuurde ontbinding van de vacuole membraan en introductie van Lm in het cytosol; (iii) intracytosolic replicatie; en (iv) fysieke penetratie van het plasma-membraan dat in ofwel de infectie van de direct aangrenzende cellen (zoals in een epitheliale blad) of, in de eenzame cellen resulteert, introductie van Lm in de extracellulaire milieu. Elk van deze fasen worden gepromoot door specifieke Lm-gecodeerd factoren (hierna aangeduid als 'virulentiefactoren') die, wanneer verwijderd, infectie defecten veroorzaken in zowel cellulaire en dierlijke modellen. Deze algemene infectie strategie is onafhankelijk geëvolueerd door een aantal van de zogenaamde 'cytosolische' ziekteverwekkers2.
Kolonie-vormende eenheid (CFU) testen te evalueren zowel in vitro algemeen werkzaam zijn (dat wil zeggen, cellulaire) zo goed als in vivo (d.w.z. organismic) infectie resultaten. Naast hun hoge gevoeligheid, met name voor in vivo infecties, voorzien CFU assays in een duidelijke uitlezing pathogen invasie en intracellulair overleven/proliferatie. CFU testen zijn uitgebreid gebruikt voor het analyseren van zowel Lm en gastheer cel bepalende factoren die van invloed zijn infectie. Zo informatief als deze voorafgaande studies zijn geweest voor het analyseren van cellulaire invasie en intracytosolic replicatie, CFU testen hebben, tot de beste van onze kennis, niet gebruikt voor het bijhouden van de vierde fase van het proces van de infectie Lm : cellulaire ontsnappen. Hier beschrijven we relatief eenvoudig hoe cellulaire ontsnappingsvoorzieningen (hierna te noemen 'opkomst') kan worden gecontroleerd door CFU assay (en stroom cytometry) en Toon voorbeelden van hoe beide factoren pathogen - en host-gecodeerde regelen deze fase van de Lm infectie cyclus. De analyse van de terminale fase van de cellulaire Lm infectie cyclus kan maken het mogelijk om extra pathogenen en host cel infectie-specifieke factoren en activiteiten te identificeren.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>ArC Amine Reactive Compensation Beads&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>BHI (Brain Heart Infusion) bouillon</td><td>EMD Milipore</td><td>110493</td><td></td></tr><tr><td>Celzeven, 70 &micro;m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medium&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FACS-buisjes&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Hitte-geïnactiveerd&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB-agar</td><td>Grow Cells MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800 Spectral Analyzer</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuit 28 G 1/2" 1cc</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP Tissue Culture 48 Well Plates&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Antigeen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE Cy5, Verdunning = 1/100, Clone = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = AF 647, Verdunning = 1/100, Clone = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = APC Cy7, Verdunning = 1/100, Clone = 30-F11</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE, Verdunning = 1/100, Clone = BM8</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Flurochrome = AmCyN, Verdunning = 1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PacBlue, Verdunning = 1/200, Clone = HK1.4</td></tr><tr><td>MHC II</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = AF 700, Verdunning = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK 1.1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = BV 605, Verdunning = 1/100, Clone = PK136</td></tr></tbody></table>

met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor cellulair en organismic niveau host reacties

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Er zijn een verscheidenheid van strategieën bacteriële pathogenen in dienst om te overleven en eenmaal binnen de eukaryote cel vermenigvuldigen. De zogenaamde 'cytosolische' pathogenen (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisen Rickettsia spp) toegang tot de geïnfecteerde cel cytosol door fysiek en enzymatisch verlaagt het primaire vacuolar membraan. Eenmaal in het cytosol, deze ziekteverwekkers zowel vermenigvuldigen als het genereren van voldoende mechanische krachten te doordringen van het plasma-membraan van de gastheercel om nieuwe cellen infecteren. Hier, laten we zien hoe deze terminal stap van de cellulaire infectie cyclus van L. monocytogenes (Lm) kunnen worden gekwantificeerd door zowel kolonie-vormende eenheid testen en stroom cytometry en voorbeelden geven van hoe beide factoren pathogen - en host-gecodeerde effect dit proces. We tonen ook een nauwe correspondentie van Lm infectie dynamiek van gekweekte cellen in vitro geïnfecteerd en die van de hepatische cellen afgeleid van muizen geïnfecteerd in vivo. Deze functie gebaseerde testen zijn relatief eenvoudig en kunnen gemakkelijk worden opgeschaald voor ontdekking gebaseerde high-throughput schermen voor modulatoren van eukaryotische cel functie.

Beoordeling van de rol van pathogenen en host-gecodeerde factoren invloed van cellulaire infectie De voorwaarden van de infectie hierboven beschreven gebruiken, wordt 0,15% van de invoer van wild-type Lm hersteld na 1,5 uur van co incubatie met gekweekte macrofagen(Figuur 1). In de daaropvolgende 1,5 h co incubatietijd (3 h post infectie, hpi), was er een toename van de terugwinning van levensvatbare Lm 4...

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Microbiële pathogenen die intracellulair repliceren, moeten uiteindelijk de geïnfecteerde cel verlaten. Die, in vergelijking met andere aspecten van gastheerpathogen interacties is relatief understudied. Hier beschrijven we technieken om pathogene efflux te analyseren.We laten zien hoe relatief eenvoudig testen kunnen worden gebruikt om de efflux-efficiëntie te evalueren of post-effluxpathogenen te karakteriseren De algemene hier beschreven technieken zijn breed toepasbaar, hoewel specifieke pathogene gastheercelmodellen kunnen verschillen in kinetiek, doseringen en eventueel uitlezingen. Zoals bij het opzetten van elk experimenteel systeem is het van essentieel belang dat er duidelijke controles worden vastgesteld die ervoor zorgen dat echte, biologische processen worden waargenomen in experimentele monsters of cohorten. Het aantonen van de procedure zal Petoria Gayle zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium.Om te beginnen met de infectie experiment, gebruik maken van een pipet om 20 microliters van de vers bereide Lm entmateriaal toe te voegen aan putten, met de schotel iets gekanteld en de pipet tip zorgvuldig geplaatst in de bovenbakkende media. Raak de wanden van de put niet aan met de pipetpunt. Voorzichtig pipette de inhoud van elke put om volledig mengen te garanderen.Schud of kantel de plaat niet om verspreiding van LM over de wanden van de put te voorkomen. Terugkeer cel cultuur schotel aan de 37 graden Celsius, vijf procent kooldioxide incubator. Gebruik geconditioneerde media van niet-geïnfecteerde cellen als verdunningsmiddel om een 10 microgram per milliliter gentamicine oplossing voor te bereiden.Voeg na 30 minuten na infectie voorzichtig 30 microliter van de gentamicine-oplossing toe aan de schotel om een uiteindelijke concentratie van twee-punt-vijf microgram per milliliter te bereiken. Voorzichtig pipette de inhoud van de put te mengen en terug te keren van de cel cultuur schotel naar de couveuse. Om te oogsten, lichtjes kantelen van de schotel en voorzichtig gebruik maken van een pipet om de hele media te verwijderen uit de put.Voeg punt-vijf milliliter gedistilleerd, steriel water aan de put. Breng na 30 seconden het resulterende waterlysaat gedurende 10 seconden krachtig over op een microcentrifugebuis van één punt en vortex. Voeg vier-punt-vijf microliter en 50 microliter van het water lysaat aan 450 microliter van gedestilleerd, steriel water om de tienvoudige en honderdvoudige verdunningen voor te bereiden.Kort vortex om een grondige mix te garanderen. Voeg 50 microliter van de originele tienvoudig verdunde en honderdvoudig verdunde monsters toe aan lysogeny bouillonplaten en verdeel met een plaatspreader. Om te testen voor opkomende LM, extract 10 microliter van de overlaying media uit de schotel en verdeel het in twee vijf-microliter aliquots en micro centrifuge buizen.Voeg vijf microliter van DMEM/ FCS toe aan een aliquot en voeg vijf microliter DMEM/FCS met vijf microliter per milliliter gentamicine toe aan de tweede aliquot als controle. Wacht vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg 90 microliter gedestilleerd steriel water toe aan elk aliquot en vortex de twee krachtig gedurende 10 seconden.Voeg vervolgens 50 microliter van het monster op LB agar platen en verspreid met behulp van een plaatspreader. Bewaar de platen in 37 graden celsius incubator voor twee dagen voor het opsommen van Lm kolonies. Met behulp van een geautomatiseerde cel teller, pas de voorbereide, ruwe twee-zes-vier-punt-zeven cellen aan de concentratie van een keer 10 tot de zesde cellen-per-milliliter.Voeg een milliliter van het monster toe aan putten van een zes-goed weefselkweekplaat. Infecteer de cellen met een voorbereid Lm-entmateriaal, wat overeenkomt met een veelheid aan infectie van 50. Op een-punt-vijf uur na infectie, in een one-point-five milliliter microcentrifuge buis gevuld met 500 microliters van vier procent PFA, verzamelen media uit de eerste set van putten en plaats de buis op ijs.Om intracellulaire Lm te verzamelen, voeg een milliliter gedistilleerd, steriel water aan elke put. Breng na 60 seconden het resulterende waterlysaat over naar een microcentrifugebuis van één punt met 500 microliter van vier procent PFA. Vortex de buis krachtig gedurende 10 seconden en plaats het op ijs.Voor de resterende putten, verwijder de media en vervang met een milliliter DMEM / FCS met vijf microgram per milliliter gentamicine te doden extracellulaire Lm.Prompt terug te keren naar de couveuse. Na 30 minuten, verwijder de media en vervang met DMEM / FCS zonder gentamicin. Na nog eens twee en vier uur, verzamelen media in lysates voor de tweede en derde keer punten in de buizen en leg ze op ijs om te koelen.Centrifuge buizen op 10.000 keer G gedurende zeven minuten. Verwijder met behulp van een pipet supernatant zonder de pellet te storen. Voeg kleuringcocktail met 50 microliters van vier procent PFA en 15 microliter phalloidin in de buis en meng om elke pellet op te schorten.Incubeerbuizen in het donker op vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Na incubatie, voeg een milliliter FACS buffer aan elke buis en pipet op en neer te mengen. Spinbuizen in de centrifuge op 10.000 keer G gedurende zeven minuten.Verwijder supernatant zonder de pellet te storen. Voor onmiddellijk gebruik, hang elke pellet in 400 microliter van FAX buffer. Als opslag voor latere analyse, voeg 200 microliter fax buffer en 200 microliters van vier procent PFA in de buis en meng op te schorten.Met behulp van de infectie voorwaarden in de korte behandeling met het antibioticum gentamicine te elimineren niet-geïnternaliseerde Lm, nul-punt-een-vijf procent van de wilde-type Lm wordt hersteld na een-punt-vijf uur co-incubatie met gekweekte macrofagen. In de daaropvolgende co-incubatie was er een verviervoudiging en zevenmaal vervijfvoudigde toename van het herstel van levensvatbare Lm, die uitsluitend intracellulaire proliferatie vertegenwoordigt. Vergelijkbaar profiel werd waargenomen voor de Lm stam met een hypervirulente prfA tijdens de eerste infectie, maar niet tussen de drie en zes HPI.Wanneer de prfA uit de Lm-stam is verwijderd, is er een daaropvolgende vermindering van het herstel van de stam na langdurige co-incubatie. Wanneer gentamicine wordt verwijderd uit de putten op zes HPI, extracellulaire Lm kan worden gedetecteerd een uur later voor zowel wilde en hypervirulente prfA stammen, maar niet voor de stam met prfA verwijderd. Media die zowel niet-geïnfecteerde als geïnfecteerde macrofagen overlays bevatten lichtverstrooiing, bacterie-sized fijnstof.Echter, alleen de media van geïnfecteerde macrofagen bezat GFP positieve signalen binnen de grootte gating. Een tijdafhankelijke toename van het uiterlijk van phalloïden-positieve Lm werd waargenomen met geïnfecteerde macrofagen. Bij het plating van de macrofagen in de 48-well weefsel cultuur schotel, laat een aantal putten zonder cellen.Deze no-cell controleputten worden dan precies hetzelfde behandeld als de celhoudende putten, in termen van de toevoeging van de ziekteverwekker, antibiotica, enz. Vergelijkbaar met de experimenten in figuren een en drie, kunnen pathogene of gastheerfactoren en of kleine moleculen worden getest op hun impact op pathogene cellulaire efflux.

using-bacterial-pathogen-to-probe-for-cellular-organismic-level-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een algemeen protocol voor de studie van de invasie van gastheercellen door een bacteriële ziekteverwekker, gericht...

Invasie van menselijke cellen door een bacteriële pathogenen

This video demonstrates an in vitro quantification technique to determine Listeria monocytogenes infection of macrophages by the colony-forming unit assay. The bacterial colonies on the agar plate represent the intracellular bacterial population that escapes the host-defense mechanism and survives within the macrophages.

Quantification of Bacterial Infection in Host Cells by the Colony-Forming Unit Assay

This video demonstrates a technique for assessing the ability of Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, to adhere to and invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). After infecting the host cells with the bacteria, the host cells are lysed to release both adhered and internalized bacteria. When the lysate is plated in an appropriate medium, the presence of colonies indicates successful bacteria-host cell interactions.

A Bacterial Infection Assay for Studying Anaerobic Bacteria-Host Cell Interactions

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Listeria monocytogenes is een Gram-positieve bacteriële pathogenen vaak gebruikt als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasieten. Beeldvorming laat L. monocytogenes infectie fasen in het kader van kleine interfererende RNA schermen maakt de globale studie van cellulaire mechanismen vereist voor bacteriële infectie van target gastheercellen.

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

We ontwikkelden een protocol dat snel, gevoelig en reproduceerbaar is voor het profileren van pathogene genexpressie tijdens een infectie.

Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

Twee assays voor microscopie-gebaseerd high-throughput screening van gastheerfactoren betrokken bij Brucella -infectie worden beschreven. De entry assay detecteert gastheerfactoren die nodig zijn voor Brucella entry en de endpoint assay degenen die nodig zijn voor intracellulaire replicatie. Hoewel toepasbaar voor alternatieve benaderingen, wordt siRNA screening in HeLa-cellen gebruikt om de protocollen te illustreren.

-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in<em&gt; Brucella</em&gt; Infectie van Hela cellen

Hier presenteren we een elegante protocol voor in vivo evaluatie van vaccin effectiviteit en host immuunrespons. Dit protocol kan worden aangepast voor vaccin modellen die studeren virale, bacteriële of parasitische ziekteverwekkers.

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.

Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties

Detectie van gastheer-bacteriële pathogene interacties op basis van fenotypische therapietrouw met behulp van high-throughput fluorescentie labeling beeldvorming samen met geautomatiseerde statistische analysemethoden maakt een snelle evaluatie van potentiële bacteriële interacties met gastheercellen mogelijk.

Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen

Leer technieken om pathogeen-efflux te analyseren met in vitro- en in vivo-infectieassays. Deze methoden evalueren efflux-efficiëntie en karakteriseren pathogenen na uitstoot voor gastheer-pathogeenonderzoek.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

Meer video's verkennen