Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de mechanobiologie, zoals hoe biologische monsters reageren op mechanische krachten geproduceerd door lage intensiteit echografie stimulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een experimentalist in staat stelt om niet-invasief mechanische krachten toe te passen op een monster en verschillende biologische omtrek in realtime te meten. Om te beginnen, langzaam boren een 12 millimeter gat aan de onderkant van een standaard 35 millimeter cultuur schotel met behulp van een verticale pers boor.

Eenmaal geboord, verwijder stukken plastic bevestigd aan de onderkant van de schotel met behulp van een mes, om een glad oppervlak aan de externe kant te creëren. Breng vervolgens een dunne laag van mariene kwaliteit epoxy of lijm aan op het externe onderste oppervlak van de schotel. Op de top van de lijm, plaats een twee-punt-vijf-micron dikke film van polyester, stevig te drukken om ervoor te zorgen dat de lijm gelijkmatig verspreidt tussen de film en het dikke plastic oppervlak.

Trek de film voorzichtig op een centrifugale manier met vingers, om een plat oppervlak te creëren. Zodra de lijm is gedroogd, kort spoelen van de polyester bodem schotel met 95%ethanol. Vervolgens steriliseren UV de schotel door deze onder een sterke 254 nanometer UV-excitatiebron te plaatsen.

Pas de duur en intensiteit aan om een UV-dosis van ongeveer 330 millijoule per vierkante centimeter te leveren. Verdun vervolgens een commercieel verkrijgbaar extracellulair matrix-eiwitmengsel met het gewenste kweekmedium met een verhouding van één tot 100. Werk aan ijs om matrixpolymerisatie te voorkomen en breng snel 100 microliter van het mediummengsel aan op de polyesterfolie.

Plaats het deksel terug op de schotel om steriliteit te behouden. Eenmaal bedekt, incubeer de matrix-gecoate, polyester bodem schotels in een cel cultuur, kooldioxide-gebufferde incubator op 37 graden Celsius voor zes tot 12 uur. Na incubatie, aspirate het overtollige medium en direct zaad van het oppervlak met cellen op de gewenste dichtheid.

Plaats een watertank onder het doel van een rechtopstaande microscoop. Positioneer vervolgens, met behulp van commercieel verkrijgbaar optomechanische componenten, de monsterhouder tussen de doelstelling en de transducer. Zorg ervoor dat de bewegende delen en de actuatoren van de vertaalfases zich buiten de tank of boven de waterleiding bevinden om waterschade te voorkomen.

Vul vervolgens de tank met gedeïoniseerd en ontgast water tot aan het horizontale vlak van de monsterhouder, voordat u de onderdompelingstransducer gebruikt. Met behulp van niet-corrosieve, commercieel verkrijgbare optomechanische componenten, zorg ervoor dat de transducer in een schuine positie ten opzichte van het optische pad. Dit zal ervoor zorgen dat alle gereflecteerde golven zal worden weggeleid van het monster.

Pas de frequentie van de functiegenerator aan op de nominale piekfrequentie van de transducer. Maak vervolgens een sinusoïdale spanningspuls van de gewenste duur en herhalingsfrequentie, met behulp van de burst-modus van de functiegenerator. Pas vervolgens piek-naar-piekspanning aan op een gewenste waarde.

Zorg ervoor dat de pulsduur korter is dan de verstreken tijd tussen twee opeenvolgende pulsen. Sluit de output van de functiegenerator aan op de ingang van een oscilloscoop. Gebruik de oscilloscoop om te bevestigen dat de golfvorm overeenkomt met het gewenste signaal.

Sluit vervolgens de output van de functiegenerator aan op de ingang van een vermogen van een goed formaat RF-versterker. Met behulp van een hydrofoonsonde die werkt met een frequentiebereik en akoestische intensiteit die compatibel zijn met die van de ultrasone transducer, breng de tip van de sonde voorzichtig in beeld binnen het gezichtsveld van de doelstelling op de positie van het monster. Zorg ervoor dat zowel de sonde als de transducer in het waterbad worden ondergedompeld en een grove vooruitlijning van de transducer uitvoeren door de akoestische as visueel in de richting van de hydrofoonsonde te positioneren.

Zorg ervoor dat de afstand tussen de twee overeenkomt met de brandpuntsafstand van de transducer. Stoot de punt van de hydrofoon niet met een ander fysiek voorwerp dan water, omdat dit de coating zal veranderen en de meting zal beïnvloeden. Sluit vervolgens de hydrofoonuitgang aan op een signaalingang van de oscilloscoop.

Sluit vervolgens de synchronisatietrigger van de functiegenerator aan op een andere oscilloscoopingang. Visualiseer beide signalen tegelijkertijd op de oscilloscoop. Vervolgens drijft u de transducer met weinig ultrasone cycli bij een lage cyclus en lage amplitude om beschadiging van de sonde te voorkomen.

Neem contact op met de fabrikant van de hydrofoon veilige werking voorwaarden om te voorkomen dat beschadiging van de hydrofoon tip. Pas de S-divisieknop aan op basis van de reistijd van de echografie van het oppervlak van de transducer naar de hydrofoon. Zoek naar een hydrofoonsignaal op de oscilloscoop na de synchronisatietrigger.

Vervolgens werkt u de transducer langzaam aan met behulp van een gemotoriseerde of handmatige XYZ-fase. Plaats de transducer in de positie die correleert met het maximale hydrofoonsignaal. Met de bundel nu uitgelijnd, meet de piek-tot-piek amplitude van de hydrofoon uitgang op de oscilloscoop voor verschillende spanningen rijden de transducer.

Zorg ervoor dat u de druklimiet van de hydrofoon niet overschrijdt. Vervang het kweekmedium van de cel door de gewenste beeldvormingsbuffer met vijf micromolar van een cel-permeant, calciumgevoelige kleurstof, zoals Fluo-4 AM. Vervolgens, inculbateren de cultuur schotel in een kooldioxide-gebufferde incubator op 37 graden Celsius voor een uur. Na incubatie, zorgvuldig wassen cellen met dezelfde buffer vrij van kleurstof.

Plaats vervolgens de schotel in de monsterhouder. Prikkel de cellen met behulp van blauw licht verlichting op 490 nanometer. Pas de excitatieintensiteit en camerablootstelling aan om overmatige bleeking of pixelverzadiging te voorkomen.

Voer time-lapse imaging uit met behulp van een onderdompelingsdoelstelling met een lange werkafstand voor een betere beeldkwaliteit en om ongewenste reflecties te verminderen. Hier worden glioblastoomcellen getoond op extracellulaire polyesterfilm met matrixcoating in standaard kweekmedium. Deze cellen zijn geïncubeerd met een calciumgevoelige tl-verslaggever.

In deze afbeelding vertegenwoordigen de rode stippen individuele fluorescerende cellen, geïdentificeerd met behulp van een beeldverwerkingssoftware. Na stimulatie gedurende 10 seconden met echografie, robuuste calcium verhogingen werden gevisualiseerd in vele regio's van belang. Het aantal geactiveerde regio's van belang worden hier in de loop van de tijd weergegeven.

Na de activering van 10 seconden met echografie bleek ongeveer 70% van de regio's hoger te zijn dan door de gebruiker gedefinieerde drempelwaarden. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de ultrasone straal uit te lijnen voordat het doen van fluorescentie meting.