Name: Een sferoïde doden Assay door auto T cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Leer een sferoïde doden assay met CAR T-cellen voor immunotherapie-onderzoek. Deze methode combineert geavanceerde beeldvorming met een gevoelige immunologische test om cytotoxiciteit in realtime te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Noorse Onderzoeksraad onder subsidies #244388, #254817 en #284983; de Noorse Cancer Society (#6829007); De Noorse gezondheid regio Zuid-Oost onder Grant #17/00264-6 en #2016006.

1. generatie van spheroïden van Colorectal kanker cellijn
<ol><li>Wassen HCT 116 (stabiel getransduceerde om uit te drukken Cluster van differentiatie 19 (CD19) en groene fluorescentie proteïne (GFP)) cel monolayers met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 5 mL of 10 mL voor een 75 cm2 kolf voor een 25 cm2 ). Voeg trypsine (0,5 mL voor een 25 cm2 of 1 mL voor een kolf van 75 cm2 ) en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Controleren van mobiele-detachement onder een microscoop en cel dissociatie enzym met volledige Roswell Park Memorial Instituut 160 medium (RPMI 1640) te neutraliseren (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamycine; 10 mL voor een 25 cm2 of 20 mL voor een kolf van 75 cm2 ).</li>
	<li>Centrifuge celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant met behulp van een precisiepipet en resuspendeer op en neer waarbij verschillende malen met 5 mL van volledige RPM1 1640 medium.</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting op een compatibele mobiele teller.</li>
	<li>Centrifuge celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant met behulp van een precisiepipet en resuspendeer in RPMI middellange tot het verkrijgen van 5 x 10-3 cellen/mL.</li>
	<li>De celsuspensie overbrengen in een steriele reservoir en afzien van 200 µL per putje in een 96-Wells ronde bodem platen met een meerkanaalspipet.</li>
	<li>De plaat overbrengen in de geautomatiseerde beeldvormende apparatuur in een incubator (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%).</li>
	<li>Log in op de acquisitie software, selecteert u Schema te verwerven | Lancering toevoegen schip | Scannen op schema | Schip maken: nieuwe.</li>
	<li>
Selecteer scantype: sferoïde. Selecteer de kanalen van belang: fase + helderveld (te volgen spheroïden groei), groen (volg tumor signaal en acquisitie tijd 300 ms) en rood (volg apoptosis en acquisitie tijd 400 ms).
	<ol>
<li>Selecteer de gewenste vergroting: 10 x.</li>
		<li>Kies de plaat model en haar positie in de lade. Selecteer de positie van putten om het imago. Voer een omschrijving in voor het experiment: naam, soort cellen, aantal cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de opstelling van de analyse, uitstellen analyse tot een Later momentinschakelt. Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en selecteer Instellen geselecteerd Scan Groepeerinterval optie en stel toevoegen scans elke 4 h en u wilt voor een totaal van 24 h. instellen de gewenste begintijd (ten minste 1 h na incubatie in de geautomatiseerde beeldvormende apparatuur).</li>
	<li>
Om de 2 dagen voor de groei van de spheroïden controleren door in te loggen in de imaging software.
	<ol>
<li>Kies de optie Weergave recente scant en dubbelklik op het gewenste experiment. Helderveld selecteren in het deelvenster beeld kanalen en gebruik vervolgens het hulpprogramma voor het maatregel image - functies voor het meten van de diameter van de spheroïden. Het duurt 6 dagen voordat een sferoïde te bereiken van de gewenste grootte: 0,5 mm diameter. Voeg 50 µL van volledige RPMI medium per putje op dag 4 om middellange verdamping gevolgen te beperken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. productie van CD19 auto T cellen
<ol><li>
Uitbreiding van CD19 auto T cellen Opmerking: Stabiele expressie van CD19 auto T cellen overgenomen door bulk retrovirale transductie van de gezonde donor PBMCs als eerder beschreven16. De retrovirale construct codering voor CD19 auto is een tweede generatie auto en bestaat uit fmc63 scFv keten, CD8 scharnier en transmembraan domein, een 4-1BB co-stimulatory domein en tot slot een CD3ζ domein.<ol>
<li>Uit te breiden, cultuur de getransduceerde T cellen in aanwezigheid van anti-CD3/28 magnetische kralen met een cel parel/verhouding van 1:1 voor 10 – 11 dagen. Tijdens de expansie, cellen zijn in volledige medium (X-VIVO 15, 5% Serum vervanging, en 100 U/mL recombinante menselijke IL-2). Opmerking: De ideale dichtheid voor een efficiënte uitbreiding is 1 tot 2 x 106 cellen/mL. Afhankelijk van het eerste nummer, kunnen cellen worden uitgebreid in kolven (25 cm2 flacons met 20 mL, 75 cm2 kolven tot 40 mL van het totale volume) in een cel cultuur incubator (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%).</li>
		<li>Als een negatieve controlegroep voor de volgende tests, bevatten niet-getransduceerde PBMCs (zal worden verwezen als Mock) bij de uitbreiding protocol parallel aan de CD19 auto T-cellen.</li>
		<li>Op dag 3 en vanaf, voeg verse medium dagelijks en verdelen van de cellen in meer cultuur kolven, indien nodig.</li>
		<li>Op dag 10 – 11: centrifuge cellen bij 500 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant en combineren van alle cellen in een tube van 50 mL en resuspendeer de cellen in ongeveer 30 mL verse volledige media.</li>
		<li>Plaats de tube van 50 mL, met de geresuspendeerde cellen op een magnetische stand te scheiden van de magnetische kralen van het kweekmedium.</li>
		<li>Wacht 2-3 min voor de kralen te verzamelen aan de kant van de buis.</li>
		<li>Verwijder het kweekmedium met een pipet en overdracht aan een nieuwe buis zonder het aanraken van de magnetische kraal collectie zones.</li>
		<li>Herhaal de stappen met betrekking tot de verwijdering van de Parel (2.1.5–2.1.7) eens te meer op het beperken van het aantal parels in het uiteindelijke kweekmedium.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen tellen en aanpassen van de dichtheid op 1 tot 2 x 106 cellen/mL in volledige medium.</li>
		<li>Rusten de cellen voor ten minste 4 h tot overnachting. Vervolgens direct bevriezen ze neer bij-80 ° C en de flesjes overbrengen in een tank met vloeibare stikstof op de volgende dag voor langdurige opslag. U kunt ook kunt een verlengen de rest tot 's nachts voor onmiddellijk gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CD19 auto expressie controle op primaire T cellen
	<ol>
<li>Tel het aantal uitgebreide T-cellen, zoals de nummers enigszins, na overnachting cultuur of matig na vorst/dooi variëren kunnen.</li>
		<li>5 x 105 cellen van beide CD19 auto en Mock primaire T-cellen te scheiden van de stroom cytometry buizen overbrengen.</li>
		<li>Wassen van de cellen met 200 μL van Flow Buffer (2% FBS in PBS) en centrifuge de buizen bij 500 x g gedurende 5 min. Herhaal de stappen wassen om zich te ontdoen van alle artefacten, veroorzaakt door het kweekmedium.</li>
		<li>Het primaire antilichaam (Biotine geit-antimuis IgG, F(ab') ₂ Fragment specifieke) voor te bereiden door het uitvoeren van 1:200 verdunning in Flow Buffer.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 100 μl van antilichaam mix per buis en incubeer op ijs voor 15 min. Herhaal de vorige stap van het wassen tweemaal te verwijderen overtollige antilichaam.</li>
		<li>Het secundaire antilichaam (streptavidine-PE) voor te bereiden als 1:400 verdunning in Flow Buffer.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 100 μl van antilichaam mix per buis en incubeer op ijs voor 15 min. Herhaal de vorige stap van het wassen tweemaal om zich te ontdoen van overtollige antilichaam.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 200 μL van Flow Buffer per buis en analyseren op een stroom cytometer.</li>
		<li>Gebruik bespotten T cellen instellen van de negatieve en positieve poort en analyseren van CD19 auto getransduceerde T cellen dienovereenkomstig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D Tumor sferoïde doden Assay
<ol><li>
Na 6 dagen of eens spheroïden bereiken de gewenste grootte, verwijderen de plaat uit de incubator. Met behulp van een meerkanaalspipet, zachtjes verwijderen 100 µL per putje van volledige RMPI 1640 medium de sferoïde platen.
	<ol>
<li>Voor deze stap, hoek de tips naar binnen muur van de 96-wells-plaat, vermijden van contact met de bodem van de put om te minimaliseren van de verstoring van de spheroïden. Resterende volume moet ongeveer 100 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de oplossing van een 1:200 Annexine v rood door het mengen van 50 µL van Annexine V rood met 9.95 mL van volledige RPMI 1640 medium.</li>
	<li>Voeg 100 µL per putje van de 1:200 Annexine V rood oplossing.</li>
	<li>De plaat overbrengen in een incubator (5% CO2, 37° C, luchtvochtigheid van 95%) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Oogst de getransduceerde auto CD19 T-cellen in een tube van 15 mL en centrifuge hen bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet en resuspendeer op en neer waarbij verschillende malen met 2 mL van volledige RPM1 1640 medium.</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting op een compatibele mobiele teller.</li>
	<li>Centrifuge celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant met behulp van een precisiepipet en resuspendeer in RPMI middellange tot het verkrijgen van 2 x 105 cellen/mL.</li>
	<li>De celsuspensie overbrengen in een steriele reservoir en breng 100 µL per putje in een 96-Wells ronde bodemplaat sferoïde met een meerkanaalspipet.</li>
	<li>De plaat ook terug overzetten naar de geautomatiseerde beeldvormende apparatuur in een incubator (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%).</li>
	<li>
Log in op de acquisitie software, selecteert u schema te verwerven.
	<ol>
<li>Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn van de Scan en selecteer Bewerken tijdlijn. Klik met de rechtermuisknop op de groep van de scan en verwijder deze. Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en Stel geselecteerd Scan Groepeerinterval optie selecteren en instellen toevoegen scans elke 1,5 h en u wilt voor een totaal van 24 h.</li>
		<li>Stel de gewenste begintijd (ten minste 1 h na incubatie in de geautomatiseerde beeldvormende apparatuur). Selecteer Opslaan planning scans.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. automatische beeldanalyse
<ol><li>Log in acquisitie, kies de optie Weergave recente scant en selecteer de optie Launch Analysis . Selecteer Create nieuwe analyse definitie | Soort analyse: sferoïde. De kanalen van de afbeelding om te analyseren (fase + helderveld, groen en rood) aan te kruisen.</li>
	<li>Selecteer ten minste 10 representatieve beelden: meestal 1 per voorwaarde en ten minste 3 punten van de tijd (begin, Midden en einde van de overname).</li>
	<li>Preview de standaard analyseren procedure op de hele afbeelding stack.</li>
	<li>De parameters voor helderveld masker wijzigen. Typische parameters zijn: gevoeligheid 10, gat vullen 1.000 µm2, min gebied 1.000 µm2. Op de hele afbeeldingsstapel bekijken en controleren dat de geselecteerde parameters de spheroïden nauwkeurig detecteren.</li>
	<li>Het wijzigen van de parameters voor groene masker (GFP). Typische parameters zijn: hoge hoed segmentatie met RADIUS-200 µm en drempel 3 GCU, rand afgesplitst, gat vullen 5.000 µm2, aanpassen grootte -2 pixels, gebied min 3.000 µm2. Op de hele afbeeldingsstapel bekijken en controleren dat de geselecteerde parameters de spheroïden nauwkeurig detecteren.</li>
	<li>Het wijzigen van de parameters voor rode masker (Annexine V). Typische parameters zijn: hoge hoed segmentatie met RADIUS-150 µm en drempel 2 GCU, rand afgesplitst, gat vullen 5.000 µm2, aanpassen grootte 0 pixels, gebied min 1.000 µm2. Op de hele afbeeldingsstapel bekijken en controleren dat de geselecteerde parameters de spheroïden nauwkeurig detecteren.</li>
	<li>
Start de analyzer.
	<ol>
<li>Zodra de analyse wordt gedaan, pak de meting van belang. Selecteer het geanalyseerde bestand en vervolgens de optie Maatstelsel van de grafiek . Selecteer de statistieken van belang, de scan en de put. Totale rode en groene intensiteit binnen de grenzen van de helderveld geven meestal de meest nauwkeurige metingen door het beperken van het signaal van de fluorescentie tot de grenzen van de spheroïden bepaald door de helderveld masker (Figuur 3). Pak de geselecteerde statistieken in verschillende bestandsindeling door te klikken op "Gegevens exporteren".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gaat u verder met de winning van de afbeeldingen en films door het selecteren van de geanalyseerde file en selecteer vervolgens de optie afbeeldingen exporteren en films . Twee opties zijn beschikbaar, ofwel "als weergegeven" ophalen afbeeldingen en films als gezien op de denkbaar software (meestal samengestelde afbeeldingen), ofwel "als opgeslagen" ruwe gegevens voor externe analyse via derde-deel software op te halen.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).</li>
<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511(2014).</li>
<li>Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+fibroblasts+induces+proinflammatory+chemokine+secretion+promoting+leukocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).</li>
<li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Galateanu, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2016.3467?text=abstract">Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response.</a> International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).</li>
<li>Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-Formation+%28Colonosphere%29+Assay+for+in+Vitro+Assessment+and+Expansion+of+Stem+Cells+in+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).</li>
<li>Izraely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metastatic+Microenvironment%3A+Melanoma-Microglia+Cross-Talk+Promotes+the+Malignant+Phenotype+of+Melanoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li>
<li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+Mixed-Cell+Spheroids+Mimic+Stroma-Mediated+Chemoresistance+and+Invasive+Migration+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li>
<li>Merker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ErbB2-CAR-engineered+cytokine-induced+killer+cells+for+the+treatment+of+high-risk+soft+tissue+sarcoma+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children.</a> Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).</li>
<li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncolology%22%5BJournal%5D)">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncolology. 7, 293(2017).</li>
<li>X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpredicted+phenotypes+of+two+mutants+of+the+TcR+DMF5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gebruik van spheroïden als een vernieuwend hulpmiddel voor het valideren van toekomstige kankerbehandeling is uitgegroeid tot een gebied van groeiende belangstelling in de afgelopen jaren. Spheroïden vertegenwoordigen een tussenstap tussen klassieke 2D analyse van in vitro en in vivo beoordeling. De methode verder houdt een heleboel belofte met betrekking tot hun potentie in termen van tumor nabootsen van de micro-omgeving en gene7profilering. Het protocol gepresenteerd in deze publicatie werd...

Adoptief cel overdracht (ACT) vertegenwoordigt de volgende generatie kankerbehandeling. Zij beroept zich op de injectie van effector cellen (T - of NK-cellen) in een patiënt. Deze cellen kunnen genetisch worden gewijzigd met een receptor die hen leiden naar hun doel, de tumor, en vernietigen. Deze aanpak werd onlangs aangetoond dat het haalbaar wanneer een chimeer antigeen Receptor (auto) gericht tegen de markering van de B-cel CD19 werd geïntroduceerd in de patiënt T-cellen te doden zijn/haar kanker1. In het geval van auto, die een kunstmatige receptor is, het ontwerp bestaat uit specifieke antilichaam fragmenten, het antigeen-bindend domein teruggebracht tot een entiteit aangewezen één keten variabele fragment (scFv), gekoppeld aan de signalering domeinen van T-cel. Hoewel er verschillende ontwerpen zijn, de meest gebruikte versies waarnaar wordt verwezen als tweede generatie auto ontwerpen, bestaan uit CD3z voor TCR signalering en een co-stimulatory domein (CD28, 4-1BB, OX40, enz.) 1 , 2. het veld immunotherapie geregisseerd allermeest naar de aandacht voor deze nieuwe vorm van wet wanneer CD19 auto-T-cellen spenderen vele patiënten met B-cel maligniteiten3,4 behandelde. Na dit succes, onderzoekers geprobeerd misbruik te maken van de vergelijkbare ontwerpen door gericht op andere epitopes voor solide tumoren met beperkt succes. Helaas, de schaarste van specifieke antigenen van de tumor en de hardere tumor microenvironments gesmolten auto T cellen minder doeltreffend naar solide tumoren5.
Op dit moment vertrouwen de meest gebruikte in vitro validatie strategieën op tweedimensionale (2D) systemen die alleen betrekking hebben op een fragment van de al genoemde solide tumor uitdagingen. Klassiek, waarbij 2D in vitro systemen een mengsel van auto T-cellen en cellijnen van doel kanker als monolayers de functionaliteit en de specificiteit van deze cellen effector te beoordelen. Hoewel deze strategieën belangrijk en essentieel onderdeel van de studies zijn, doen ze niet rekening houden met de complexe morfologie en driedimensionale (3D) structuur van de kanker cellen6. Kankercellen gekweekt in 3D systemen, aangeduid als spheroïden, verwerven nieuwe fenotypische kenmerken door veranderingen in gen expressie profiel7, die de erkenning door omgeleide effector cellen kunnen beïnvloeden. Birgersdotter en collega's aangetoond dat een lijn van de cel van Hodgkin-lymfoom (HL), wanneer alleen gegroeid in een 3D cultuur model verwerft een genexpressie profiel dat is vergelijkbaar met primaire tumor monsters8. Daarom, spheroïden of soortgelijke 3D cultuur methodologieën aanbod relevanter in vitro modellen in tegenstelling tot standaard 2D systemen. Dergelijke systemen zijn ook vergelijkbaar met in vivo onderzoek die worden gezien als de laatste stap in het validatieproces voor een bepaalde auto. Gezien het feit dat 2D systemen niet na te bootsen de morfologie van kanker clusters, spheroïden bieden gelijkaardige formaties om te beoordelen van de functionaliteit van auto T cellen voorafgaand aan in vivo modellen. In een studie, Pickl et al. geïdentificeerd dat een sferoïde model van menselijke epidermale groeifactor receptor (HER2) overexpressing van kankercellen aangetoond vergelijkbare signalering profielen in vivo modellen9. Verder ondersteunt dit dat spheroïden meer relevante en close-te-in vivo beoordelingvan de auto T-cellen bieden. Bovendien, auto T-cel validatie tegen spheroïden zou kunnen helpen hun werkzaamheid meer kritisch te beoordelen en te voorkomen dat enkele van de ontwerpen verhuizen naar in vivo onderzoek voortijdig10; aldus, bij te dragen aan ethisch betrokken onderzoek door het offeren van minder dieren. Bovendien, protocollen met behulp van spheroïden zijn niet duurder dan de klassieke 2D systemen en veel sneller in vergelijking met de klassieke in vivo studies. Samen genomen, kan men voorspellen dat de opneming van sferoïde studies standaardpraktijk koppeling van in vitro en in vivo studies zal binnenkort.
Hier presenteren we de voorbereiding van de spheroïden van de dikke darm kanker cellijn HCT 116. Deze cellijn was aangepast zodat het menselijke CD19 molecuul te gevoelig voor CD19 auto T-cellen maken en te zorgen voor een duidelijke evaluatie van het doden met behulp van een klinisch gevalideerde auto construct express.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td><td>Lotnummer: RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; groeikerngebied kolven</td><td>VWR</td><td>430639</td><td>Lotnummer: 2218002</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; groeikerngebied kolven</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td>Lotnummer: 3718006</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td><td>Lotnummer: SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-glutamine, 10 x 500 mL</td><td>Life Technology (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>Lotnummer: 1926384</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>Lotnummer: 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>Lotnummer: 1904924A</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td>Lotnummer: 1886513</td></tr><tr><td>96 wel plate, ronde bodem</td><td>VWR</td><td>734-1797</td><td>Lotnummer: 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D</td><td>-</td></tr><tr><td>X-VIVO 15 met Gentamicin L-Gln, Fenol Rood, 1 L</td><td>BioNordika</td><td>BE02-060Q</td><td>Lotnummer: 8MB036</td></tr><tr><td>CTS Immune Cell Serum Replacement</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2596102</td><td>Lotnummer: 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>Lotnummer: 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>Lotnummer: 17A1025-122117</td></tr><tr><td>Reagens Reservoir</td><td>VWR</td><td>89094-672</td><td>Lotnummer: 89094-672</td></tr><tr><td>15 mL buizen</td><td>VWR</td><td>734-1867</td><td>Lotnummer: 19317044</td></tr><tr><td>anti-human CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>Lotnummer: 4016990 RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>Biotin-SP (lange ruimte) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td><td>Lotnummer: 129474: RRID: AB_2338583</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>Lotnummer: 5191579: RRID: AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 Colorectal Carcinoma Line</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>-</td></tr><tr><td>Incucyte S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een sferoïde doden assay door auto t cellen

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapie is uitgegroeid tot een gebied van de groeiende interesse in de strijd tegen kanker anders onbehandelbaar. Onder alle immunotherapeutische Doorverwezen chimeer antigeen receptor (auto) T-cellen verkregen van de meest spectaculaire resultaten, in het bijzonder met pediatrische B-acute lymfatische leukemie (B-ALL). Validatie van de klassieke methoden van auto T-cellen zijn, is afhankelijk van het gebruik van specificiteit en testen van de functionaliteit van de auto T cellen tegen doelcellen in suspensie en in xenograft-modellen. Helaas, opmerkingen in vitro zijn vaak losgekoppeld van de resultaten verkregen in vivo en veel inspanning en dieren kan worden gespaard door toe te voegen een andere stap: het gebruik van 3D-cultuur. De productie van spheroïden uit potentiële doelcellen die de 3D structuur van de tumorcellen na te bootsen wanneer ze worden geaccepteerd in de diermodel vertegenwoordigt een ideaal alternatief. Wij rapporteren hier een betaalbare, betrouwbare en gemakkelijke methode voor de productie van spheroïden van een getransduceerde colorectal cellijn als een hulpmiddel van de bevestiging voor adoptief celtherapie (hier wordt geïllustreerd door CD19 auto T-cellen). Deze methode is in combinatie met een geavanceerd levende imaging systeem dat sferoïde groei kan volgen, effector cellen apoptosis van cytotoxiciteit en tumor cel.

Zoals te zien in Figuur 1, is het van cruciaal belang om te controleren door stroom cytometry van het niveau van expressie van CD19 auto op T-cellen (figuur 1A) en het niveau van de CD19 op HCT116 tumor cellijnen (figuur 1B). Figuur 2 illustreert het resultaat van een typische sferoïde experiment. De geautomatiseerde beeldvormende apparatuur neemt foto's in vier verschil...

Dit protocol is ontworpen voor het beoordelen van de immunotherapeutische omgeleide T-cel (auto T-cel) cytotoxiciteit tegen 3D gestructureerde kankercellen (spheroïden) in real-time.

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van immunotherapie over de beoordeling van immuuncelcytotoxiciteit tegen 3D-structuur tumorcellen te beantwoorden. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het eenvoudig is en het combineert geavanceerde beeldvormingstechnologie en een gevoelige immunologische test. Begin met het wassen van de colorectale kankercellijn van belang met vijf milliliter PBS en het verwijderen van de cellen uit de kolf bodem met 0,5 milliliter trypsine gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius.Na bevestiging van onthechting onder een microscoop, neutraliseren de cel dissociatie enzym met 10 milliliter van compleet medium en het verzamelen van de cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in vijf milliliter vers compleet medium voor het tellen en resuspend de cellen op een 1,5 keer 10 tot de derde cellen per milliliter concentratie. Zaad vervolgens 200 microliters cellen in elke put van 96-goed ronde bodemplaat en plaats de plaat in een geautomatiseerd beeldvormingsapparaat in een 37 graden Celsius incubator met 5% CO2 en 95%vochtigheid.Log in op de acquisitiesoftware van het apparaat en selecteer Schedule to Acquire, Launch Add Vessel, Scan on Schedule en Create Vessel New. Selecteer vervolgens scantype Sferoid en selecteer de juiste heldere veld- en fluorescentiekanalen van belang. Stel de vergroting in op 10 keer en selecteer het plaatmodel en de positie ervan in de lade van het beeldapparaat.Selecteer de positie van de putten die moeten worden afgebeeld en voer de beschrijving van het experiment in, inclusief de naam, het type cellen en het aantal cellen. Selecteer voor de analyse-instelling De analyse uitstellen tot later, klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en selecteer Geselecteerd scangroepinterval instellen en stel Scans toevoegen elke tot vier uur en voor een totaal van 24 uur in. Stel vervolgens de begintijd in op ten minste één uur na de incubatie in het geautomatiseerde beeldverwerkingsapparaat.Als u de voortgang van de sferoïdegroei wilt controleren, logt u elke twee dagen in op de beeldsoftware en selecteert u Recente scans weergeven. Dubbelklik op het interessant experiment en selecteer Brightfield in het deelvenster Afbeeldingskanalen. Gebruik vervolgens het gereedschap Beeldkenmerken meten om de diameter van de sferoïden te meten en voeg 50 microliter van volledig medium per put toe op dag vier om eventuele gemiddelde verdampingseffecten te beperken.Wanneer de sferoïden de juiste experimentele grootte bereiken, moet u de plaat voorzichtig in de hoek zetten en een meerkanaalspipet gebruiken om voorzichtig 150 microliter van volledig medium uit elke put te verwijderen zonder de sferoïden te verstoren. Vervang vervolgens het afgedankte medium door 50 microliter van een 1 tot 200 oplossing van Annexin V Red en plaats de plaat gedurende 15 minuten in een celkweek incubator. Centrifuge getransduceerde CAR CD19 T cellen in een 15 milliliter conische buis en resuspend de pellet in twee milliliter van compleet medium.Verdun de cellen na het tellen tot twee keer 10 tot de vijfde cel per milliliter van volledige gemiddelde concentratie. Voeg vervolgens 100 microliter CAR CD19 T-cellen toe aan elke sferoïde-bevattende put en breng de plaat terug naar het geautomatiseerde beeldverwerkingsapparaat. Selecteer in de acquisitiesoftware De optie Plannen om te verwerven en klik met de rechtermuisknop op de scantijdlijn.Selecteer Tijdlijn bewerken en klik met de rechtermuisknop op de scangroep om deze te verwijderen. Klik opnieuw op de tijdlijn en selecteer Geselecteerd scangroepinterval instellen en stel Scans toe op 1 1/2 uur en voor een totaal van maximaal 24 uur. Stel vervolgens de begintijd van de beeldvorming in op ten minste één uur na het begin van de incubatie in het geautomatiseerde beeldverwerkingsapparaat en selecteer Scans van het schema opslaan.Selecteer in de scansoftware recente scans bekijken en Analyse starten voor geautomatiseerde beeldanalyse. Selecteer Nieuwe analysedefinitie en analysetype Sferoid maken en stel de te analyseren afbeeldingskanalen in. Selecteer ten minste 10 representatieve afbeeldingen en bekijk een voorbeeld van de standaardanalyseprocedure op de gehele afbeeldingsstack.Wijzig de parameters voor het helderveldmasker en bekijk een voorbeeld van de afbeeldingsstack, zodat de geselecteerde parameters de sferoïden nauwkeurig detecteren. Wijzig de parameters voor het groene masker en bekijk een voorbeeld van de afbeeldingsstack om te bevestigen dat de geselecteerde parameters de sferoïden nauwkeurig detecteren. Wijzig de parameters voor het rode masker en bekijk een voorbeeld van de afbeeldingsstack om te bevestigen dat de geselecteerde parameters de sferoïden nauwkeurig detecteren.Zorg ervoor dat u het beste signaal over ruis en gevoeligheid over specificiteitsverhoudingen bereikt, rekening houdend met het feit dat u niet in staat zal zijn om een set parameters te vinden die het mogelijk maken om elke gebeurtenis op elk tijdstip vast te leggen. Start dan de analyzer. Wanneer de analyse is voltooid, moet u de meting van de rente extraheren en het geanalyseerde bestand en de optie grafiekstatistieken selecteren.Selecteer de interessestatistieken, de scan en de put. Klik op Gegevens exporteren om de geselecteerde statistieken in verschillende bestandsindelingen te extraheren. Als u de afbeeldingen wilt extraheren, selecteert u het geanalyseerde bestand en selecteert u Afbeeldingen en films exporteren.CD19 CAR expressie op getransduceerde T-cellen en CD19 expressie op transducale colorectale kankercellen kan worden bevestigd door flow cytometrie. Hier kan de uitkomst van een typisch sferoïde experiment worden waargenomen. In tegenstelling tot mock T cellen, CD19 CAR T cellen zijn in staat om specifiek te doden de colorectale kankercel lijn afgeleide sferoïden, sterk verminderen van het aantal levende tumorcellen.Tracking van de evolutie van de totale groene en rode signalen binnen de sferoïde grenzen in de tijd blijkt dat kort na CD19 CAR T cel injectie, de grootte van de sferoïden krimpt snel als de apoptose signaal snel toeneemt. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals toxiciteitstesten, celmigratietesten of sferoïde structuurmetingen worden uitgevoerd om aanvullende vragen over respectievelijk t-celbeglijkheid of sferoïde vorming te beantwoorden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Spheroids are a type of 3D cell culture model used to more accurately represent a cell’s environment compared to 2D cell culture monolayer models. In the example protocol, we will see scientists generate spheroids from a colorectal cancer cell line and apply live-cell imaging to track the spheroids’ growth.

Spheroid Generation from Cell Lines: A Three-Dimensional (3D) Cell Culture Method

In this video, we demonstrate the repetitive tumor challenge assay to evaluate the CAR T cells’ repetitive tumor killing potential during high tumor cell loads. Further, the CAR T cells can be analyzed using flow cytometry to determine the different subpopulations of CAR T cells in the sample.

Repetitive Tumor Challenge Assay: An In Vitro Culture Assay to Evaluate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Repetitive Tumor Killing Potential

This video demonstrates a method for monitoring CAR T cell activity against cancer cells through real-time electrical impedance measurements. Tracking changes in impedance assesses the effectiveness of CAR T cells in inducing cancer cell cytolysis, providing insights into their cytotoxic capabilities.

A Real-Time In Vitro Cytolysis Assay to Evaluate the Potency of CAR T Cells

This video demonstrates an in vitro assay evaluating the cytotoxic effects of CAR T cells on 3D tumor spheroids expressing fluorescent proteins. This assessment utilizes the Annexin V red fluorescent probe, which binds to exposed phosphatidylserine residues on the outer leaflet of apoptotic cancer cells after interactions with CAR T cells. The red fluorescence emitted by the probe aids in distinguishing these cells from healthy ones emitting green fluorescence.

An In Vitro Assay to Assess CAR T Cell Cytotoxicity against Tumor Spheroids

This video demonstrates an in vitro assay to validate chimeric antigen receptor (CAR) T cell activity. B-cell lymphoma cells expressing CD19 antigen and cytoplasmic luciferase are co-cultured with CD19-specific CAR T cells. CAR binding to CD19 on a tumor induces the CAR T cells to release cytokines and toxins that cause tumor cell cytotoxicity. The CAR T cell activity is evaluated by quantifying the released cytokine and decreased luciferase-mediated bioluminescence in the tumor cells.

An In Vitro Assay to Evaluate the Anti-Tumor Activity of Tumor-Specific CAR T Cells

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

We beschrijven de evolutie van een sferoïde gebaseerde, driedimensionale in vitro model waarmee we kunnen testen van de huidige standaard voor experimentele therapie regimes voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom op cellijnen, die gericht zijn op het evalueren van therapie gevoeligheid en weerstand op primaire cellen van menselijke specimens in de toekomst.

Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Leer een sferoïde doden assay met CAR T-cellen voor immunotherapie-onderzoek. Deze methode combineert geavanceerde beeldvorming met een gevoelige immunologische test om cytotoxiciteit in realtime te evalueren.

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Meer video's verkennen