Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

Het uitwisselen van regio's van structureel vergelijkbare eiwitten om kimeras te creëren stelt ons in staat om het belang te onderzoeken van regio's die verantwoordelijk zijn voor de biologische functies van het te bestuderen molecuul. Regio-uitwisselingen predoff de algemene secundaire structuur van het eiwit, zodat de regio belangrijk is voor de algehele structuur kan worden onderscheiden van die direct bemiddelen biologische functies. Het kan worden omgezet in selecteren welke exacte regio's moeten worden vervangen.

Beginnen met grotere uitwisselingen is meestal nuttig om de belangrijkste functionaliteit van het eiwit te identificeren. Om de procedure te beginnen, selecteert u een geschikt eiwit als donor om regio's uit te wisselen met het eiwit van belang zoals beschreven in het tekstprotocol. Verkrijg vervolgens de eiwitaminozuursequenties van de ontvanger en donoreiwitten uit de referentiesequentiedatabase door eerst toegang te krijgen tot de gensectie op de ref seq-webpagina.

Typ de naam van het eiwit van belang in het zoekvak en klik op zoeken. Klik op de gennaam voor de gewenste soort in de resulterende lijst. Schuif omlaag naar de sectie ref seq om alle gedocumenteerde isovormen te bekijken.

Klik op de sequentie-id voor het isoform van belang. Scroll naar beneden en klik op cd's om het eiwitcoedeergebied van het gen te markeren. Klik rechtsonder op het scherm op FAFSDA en kopieer de gensequentie.

Sla de DNA-sequentie op met behulp van een geschikte DNA-bewerkingssoftware. Wanneer u de vrij beschikbare APE gebruikt, opent u het programma, plakt u de gekopieerde reeks in het lege vak, selecteert u de volgordenaam en klikt u op Opslaan. Kies nu de eiwitgebieden die moeten worden vervangen in de verschillende kimerische constructies door eerst de eiwitsequentie van belang in verschillende structurele gebieden te delen.

Download hiervoor de structurele gegevens van het eiwit van belang van de PDBe-website. Toegang tot de PDBe-pagina voor het eiwit en download het PDBe-bestand door te klikken op downloaden aan de rechterkant van het scherm. Open het PDBe-bestand in een moleculair visualisatiesysteem, zoals Pymol.

Geef in Pymol de nucleotidevolgorde weer, verberg de standaard structurele gegevens en selecteer de cartoonweergave om de structurele kenmerken van het eiwit duidelijk te visualiseren. Klik op de nucleotide sequentie aan de bovenkant van het scherm om verschillende delen van het molecuul te markeren, wijzend op de aminozuren die overeenkomen met elke onderscheidende structurele functie. Annoteer nu de verschillende structurele gebieden op de DNA-sequentie in APE door de DNA-sequentie te openen, te selecteren en op ORF's te klikken en vervolgens op het laatste aminozuur van het eerste gebied te klikken om zijn positie in de DNA-sequentie te benadrukken en de codering van de nucleotide voor dat gebied te selecteren.

Klik met de rechtermuisknop op de selectie en selecteer nieuwe functie om deze een naam en een kleur te geven. Herhaal het proces voor elke structurele regio die in de vorige stap is geïdentificeerd. Om de residusequenties van de twee eiwitten uit te lijnen, verkrijgen we eerst de volledige aminozuursequenties van donor- en receptoreiwitten in APE.

Open net als voorheen de donor-DNA-sequentie, selecteer deze en klik op ORFs translate. Dan, toegang tot de Clustal Omega webpagina en zet dan de aminozuur sequenties van de twee eiwitten. Elke sequentie moet worden uitgevoerd door een tekstregel met eiwitnaam die naar behoren moet worden geïdentificeerd.

Scroll naar beneden en klik op verzenden. Haal het uitlijningsbestand op door op het tabblad Downloaduitlijningsbestand te klikken en het op te slaan. Dit bestand kan worden geopend door elk tekstbewerkingsprogramma.

Met behulp van de uitlijning bestand als referentie, annoteren de overeenkomstige structurele gebieden van de donor eiwit in hun DNA-sequentie. Maak een kopie van de geannoteerde DNA-sequentie van het receptoreiwit en hernoem het als een kimerisch eiwit. Open de omgedoopte DNA-sequentie in APE.

Selecteer het gebied dat moet worden uitgewisseld in het donoreiwit en selecteer vervolgens het overeenkomstige gebied in het omgedoopte receptoreiwit. Plak de dna-sequentie van het donoreiwit en sla de veranderingen op. Ontwerp de terminalprimers met behulp van een DNA-editor zoals APE.

Maak een nieuw DNA-bestand, start de eindterminal primer met een leider sequentie. Gevolgd door de eerste beperkingsplaats geselecteerd in de vectoren MCS en de optionele spacer in de eerste 18 tot 27 basisparen van het gen van belang. In het nieuwe DNA-bestand, ontwerp de C terminal primer sequentie om te beginnen met de laatste 18 tot 27 basisparen van het gen van belang, gevolgd door een optionele spacer, de tweede beperking site gekozen, en de leider sequentie.

Markeer de hele reeks, klik met de rechtermuisknop en selecteer omgekeerd compliment om de omgekeerde primer te verkrijgen. Nu, ontwerp primers voor elk van de grensregio's in de kimerische constructies. Markeer in de DNA-sequentie van de kimera een 30-basispaargebied in de zone waar de oorspronkelijke en ingevoegde sequenties in contact zijn.

Dit bestaat uit 15 basisparen in elke reeks. Kopieer de regio en plak het in een nieuw DNA-bestand. Deze volgorde zal de voorwaartse primer zijn.

Maak een kopie van de voorwaartse primer die in de vorige stap is gegenereerd en wijzig deze als de omgekeerde primer. Markeer de primer-reeks, klik met de rechtermuisknop en selecteer omgekeerd compliment om de omgekeerde primer-reeks te genereren. Herhaal deze stappen voor elke contactzone in de kimeric DNA-sequentie.

Over het algemeen zijn twee sets van voorwaartse omgekeerde primers nodig om één kimera te genereren, tenzij de vervanging plaatsvindt in de N-terminal- of C-terminalregio's. Bereid een individueel PCR-reactiemengsel voor elk van de fragmenten die het kimerïsche eiwit vormen. Stel eerst een één punt vijf mililiter microfuse buis op ijs en pipet de verschillende reagentia van de PCR mengsels in de volgorde vermeld in het tekstprotocol.

Zorg ervoor dat voor elke PCR-reactie correcte primers en sjablonen worden gebruikt. Label twee dunne ommuurde nulpunt twee mililiter PCR buizen voor elke reactie en overdracht 20 microliters van de overeenkomstige PCR mengsel in elke buis. Breng de PCR-buizen over naar een PCR-thermocycler en start het protocol zoals beschreven in het tekstprotocol.

Nadat de PCR-reactie is voltooid, voeg vier microliters van zes x DNA-laadbuffer in elke buis toe. Steek de agarossgel van één procent in een elektroforese-eenheid en bedek met TAE-buffer. Laad de monsters voorzichtig in de gel samen met een moleculair gewicht laatste.

Na het uitvoeren van de gel op 80 tot 120 volt gedurende 20 tot 45 minuten, zet de elektroforese unit en verwijder de agoros gel. Visualiseer de versterkte DNA-banden onder UV-licht. Knip met een scheermesje de afzonderlijke DNA-fragmenten uit de gel en breng ze over naar twee mililiter microfuse buizen.

Na het gebruik van een PCR clean up kit om de DNA-fragmenten te zuiveren, kwantificeren van de hoeveelheid DNA teruggevonden door het meten van de absorptie van de monsters op 260 nanometer en 340 nanometer in een spectrofetometer. Voer NU PCR-versterking uit om de kimeric DNA-sequentie te genereren. Stel eerst 50 microliter van een PCR-reactie in om de afzonderlijke bestanddelen van de kimera te smelten zoals voorheen.

Gebruik de N terminal en C terminal primers samen met 10 nanogram van elk van de versterkte DNA-fragmenten. Herstel en kwantificeer het gezuiverde DNA-fragment zoals voorheen, in 30 microliter kernvrij water. Dit fragment bevat de kimeric DNA sequentie geflankeerd door de beperking sites opgenomen in de terminal primers.

Generatie van een kimeric eiwit wordt geïllustreerd met twee leden van de inter luke en zes sytokine familie. Oncostaten M in leukemie remmende factor. De OSM lift kimera is het resultaat van het uitwisselen van de BC loop regio van OSM met een overeenkomstige lift sequentie.

De eerste PCR versterkingsstap bestond uit drie afzonderlijke reacties. Het N-terminal OSM-fragment, waarvoor N-terminal OSM naar voren en BC start reverse primers gebruikt OSM als de sjabloon. De LIF BC-lus werd verkregen door bc start naar voren en BC N omgekeerde primers met LIF als sjabloon.

De C-terminal OSM fragment gebruikt BC einde vooruit en C terminal OSM reverse primers evenals OSM als de sjabloon. Deze gezuiverde fragmenten werden vervolgens gebruikt als de sjabloon in de tweede PCR-reactie, samen met N-terminal OSM naar voren en C-terminal OSM reverse primers om de overeenkomstige OSM LIF BC-lus gensequentie te versterken. Na zuivering en transformatie in e-coli, werden individuele plasmiden geïsoleerd en gescreend door beperking enzymvertering voor een goede invoeging van het DNA-fragment.

Gel elektroforese bleek positieve hits die vervolgens werden verzonden voor sequentie verificatie. Kimeric eiwitten moeten worden geproduceerd en de activiteit gemeten in een perfecte factie systemen. Om het belang van de vervangen regio's voor die specifieke fractie te bepalen.

Deze techniek is zeer nuttig en vaak toegepast, interfereerde van signally receptoren om belangrijke functie domeinen en receptor herkenning sites te identificeren. Het nummer dat ik gebruik voor DNA-elektroforese moet worden behandeld met behulp van wegwerphandschoenen, een laboratoriumjas en beschermende brillen.