Name: Identificatie van functionele eiwit regios via chimeer eiwit bouw (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer chimeer eiwitbouw voor functionele analyse door regio-uitwisseling tussen structureel verwante eiwitten. Deze methode identificeert kritieke domeinen voor biologische activiteit en helpt bij proteïne-engineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het Max-Planck-Gesellschaft en de Schüchtermann-kliniek (Bad Rothenfelde, Duitsland). Onderdeel van dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het dagboek van biologische chemie. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. De lus van de AB en D-helix in de bindende site III van menselijke Oncostatin M (OSM) zijn vereist voor OSM receptor activering. J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029. © de auteurs.

<ol><li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li>
<li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+%28IL%29+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li>
<li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+recognition+by+gp130+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li>
<li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li>
<li>Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787(2017).</li>
<li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+%28OSM%29+are+required+for+OSM+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li>
<li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+wild+type%2C+truncated%2C+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li>
<li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li>
<li>Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure%2Ffunction+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li>
<li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li>
<li>Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li>
<li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li>
<li>Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li>
<li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surprising+similarities+in+structure+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li>
<li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMDB+and+VAST%2B%3A+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).</li>
<li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980(2003).</li>
<li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).</li>
<li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCBI%27s+LocusLink+and+RefSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li>
<li>Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/">http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</a> (2018).</li>
<li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539(2011).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li>
<li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS%3A+Minipreparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate%3A+Maxipreps%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351(2018).</li>
<li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li>
<li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li>
<li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li>
<li>Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+cytokine%3AIg-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+%28LIF%29+in+complex+with+the+LIF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li>
<li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li>
<li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82(2015).</li>
<li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li>
<li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li>
<li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li>
<li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De generatie van chimeer eiwitten vormt een veelzijdige techniek, die in staat zijn verder te gaan dan de grenzen van afgeknotte eiwitten om vragen te stellen zoals de modulariteit van cytokine-receptor bindende domeinen13is. Het ontwerp van Chimaera is een belangrijke stap in dit soort studies, en vereist zorgvuldige afweging. Voorbereidende studies om functionele domeinen vergt over het algemeen substitutie van brede regio's in een eerste fase, terwijl kleinere vervangingen van variabele lengtes...

Verschillende soorten eiwitten, met inbegrip van cytokines en groeifactoren, gegroepeerd in gezinnen waarvan de leden delen van soortgelijke driedimensionale structuren maar vaak oefenen verschillende biologische functies1,2. Deze functionele diversiteit is meestal het gevolg van kleine verschillen in aminozuursamenstelling binnen3actieve sites van het molecuul. Identificatie van dergelijke sites en functionele determinanten alleen bieden geen waardevolle evolutionaire inzichten maar ook ontwerpen van meer specifieke agonisten en remmers4. Echter compliceert het grote aantal verschillen in de samenstelling van de residuen vaak gevonden tussen structureel verwante proteïnen deze taak. Hoewel de bouw van grote bibliotheken met honderden mutanten is tegenwoordig haalbaar, beoordeling van elke één residu variatie en combinaties van hen blijft een uitdagende en tijdrovende inspanning5.
Technieken beoordelen het functionele belang van grote eiwit regio's zijn dus van waarde om het aantal mogelijke residuen tot een beheersbaar nummer6. Afgeknotte proteïnen zijn de meest gebruikte aanpak van dit probleem. Dienovereenkomstig, regio's worden beschouwd als functioneel relevant als de eiwitfunctie bestudeerde wordt beïnvloed door de verwijdering van een bepaalde regio7,8,9. Een belangrijke beperking van deze methode is echter dat de verwijderingen van het eiwit secundaire structuur, wat leidt tot misfolding, samenvoeging en het onvermogen om te bestuderen van de beoogde regio kunnen beïnvloeden. Een goed voorbeeld is een afgeknotte versie van de cytokine-oncostatin M (OSM), waarin een interne schrapping groter dan 7 residuen resulteerde in een misfolded mutant die niet verder kan worden bestudeerd10.
De generatie van chimeer eiwitten vormt een alternatieve en innovatieve aanpak waarmee de analyse van de regio's groter eiwit. Het doel van deze methode is om te wisselen van regio's van belang in een eiwit door structureel verwante sequenties in een ander eiwit, teneinde de bijdrage van de vervangen onderdelen aan specifieke biologische functies. Op grote schaal gebruikt op het gebied van signalering van receptoren te identificeren van functionele domeinen11,12, zijn chimeer eiwitten met name nuttig zijn te onderzoeken eiwit gezinnen met weinig aminozuur identiteit maar geconserveerde secundaire structuur. Passende voorbeelden kunnen worden gevonden in de klasse van Interleukine-6 (IL-6) type cytokines, zoals Interleukine-6 en Ciliaire neurotrophic factor (6% reeks identiteit)13 of leukemie remmende factor (LIF) en OSM (20% identiteit)6, waarop de volgens protocol is gebaseerd.

<table><tbody><tr><td>Labcycler thermocycler</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td>Om dit protocol uit te voeren, kan elke conventionele PCR-machine worden gebruikt</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c UV-Vis spectrofotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td>DNA-kwantificering</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SM0331</td><td></td></tr><tr><td>AscI restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0558</td><td></td></tr><tr><td>PacI restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-set (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MHS6278-202857165</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Op bestelling</td></tr><tr><td>Human Oncostatin M cDNA</td><td></td><td></td><td>Gift van Dr. Heike Hermanns (Afdeling Hepatologie, Universitair Ziekenhuis W&uuml;rzburg, Duitsland)&nbsp;</td></tr><tr><td>pCAGGS vector met PacI en AscI restrictieplaatsen</td><td></td><td></td><td>Gift van Dr. Andr&eacute; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Duitsland)</td></tr></tbody></table>

identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Het doel van dit protocol omvat het ontwerp van chimeer eiwitten waarin verschillende regio's van een eiwit worden vervangen door hun overeenkomstige sequenties in een structureel vergelijkbaar eiwit, om te bepalen van het functionele belang van deze regio's. Dergelijke Chimaera worden gegenereerd door middel van een geneste PCR protocol met overlappende DNA-fragmenten en adequaat ontworpen primers, gevolgd door hun expressie binnen een zoogdieren systeem om inheemse secundaire structuur en posttranslationele modificaties.
De functionele rol van een afzonderlijke regio wordt vervolgens aangegeven door een verlies van activiteit van de Chimaera in een passende uitlezing assay. Als gevolg hiervan worden regio's herbergen een aantal essentiële aminozuren geïdentificeerd, die verder kan worden gescreend door complementaire technieken (bijvoorbeeld plaats-geleide mutagenese) te verhogen van de moleculaire resolutie. Hoewel beperkt tot gevallen waarin een structureel verwante proteïne met verschillende functies kan worden gevonden, hebben chimeer eiwitten met succes gewerkt aan het identificeren van de kritische bindende regio's in de proteïnen zoals cytokines en cytokine receptoren. Deze methode is met name geschikt in gevallen waarin de proteïne van functionele regio's niet goed gedefinieerd, en vormt een waardevolle eerste stap in gerichte evolutie benaderingen te beperken van de regio's van belang en de betrokken controle-inspanning te verminderen.

Bouw en generatie van een chimeer eiwit (Figuur 1) zal worden geïllustreerd met twee leden van de familie van Interleukine-6 cytokine, OSM en LIF, die het voorwerp van een onlangs gepubliceerde studie6 waren. Figuur 2 toont de driedimensionale structuur van deze proteïnen. Beide moleculen vast de karakteristieke secundaire structuur van klasse I cytokines, met vier helices (genoemd A tot D) verpakt in een ...

Structureel verwante proteïnen oefenen vaak verschillende biologische functies. De uitwisseling van gelijkwaardige gebieden van deze proteïnen te creëren chimeer eiwitten vormt een innovatieve aanpak ter identificatie van de kritische eiwit-regio's die verantwoordelijk voor hun functionele verschillen zijn.

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Het uitwisselen van regio's van structureel vergelijkbare eiwitten om kimeras te creëren stelt ons in staat om het belang te onderzoeken van regio's die verantwoordelijk zijn voor de biologische functies van het te bestuderen molecuul. Regio-uitwisselingen predoff de algemene secundaire structuur van het eiwit, zodat de regio belangrijk is voor de algehele structuur kan worden onderscheiden van die direct bemiddelen biologische functies. Het kan worden omgezet in selecteren welke exacte regio's moeten worden vervangen.Beginnen met grotere uitwisselingen is meestal nuttig om de belangrijkste functionaliteit van het eiwit te identificeren. Om de procedure te beginnen, selecteert u een geschikt eiwit als donor om regio's uit te wisselen met het eiwit van belang zoals beschreven in het tekstprotocol. Verkrijg vervolgens de eiwitaminozuursequenties van de ontvanger en donoreiwitten uit de referentiesequentiedatabase door eerst toegang te krijgen tot de gensectie op de ref seq-webpagina.Typ de naam van het eiwit van belang in het zoekvak en klik op zoeken. Klik op de gennaam voor de gewenste soort in de resulterende lijst. Schuif omlaag naar de sectie ref seq om alle gedocumenteerde isovormen te bekijken.Klik op de sequentie-id voor het isoform van belang. Scroll naar beneden en klik op cd's om het eiwitcoedeergebied van het gen te markeren. Klik rechtsonder op het scherm op FAFSDA en kopieer de gensequentie.Sla de DNA-sequentie op met behulp van een geschikte DNA-bewerkingssoftware. Wanneer u de vrij beschikbare APE gebruikt, opent u het programma, plakt u de gekopieerde reeks in het lege vak, selecteert u de volgordenaam en klikt u op Opslaan. Kies nu de eiwitgebieden die moeten worden vervangen in de verschillende kimerische constructies door eerst de eiwitsequentie van belang in verschillende structurele gebieden te delen.Download hiervoor de structurele gegevens van het eiwit van belang van de PDBe-website. Toegang tot de PDBe-pagina voor het eiwit en download het PDBe-bestand door te klikken op downloaden aan de rechterkant van het scherm. Open het PDBe-bestand in een moleculair visualisatiesysteem, zoals Pymol.Geef in Pymol de nucleotidevolgorde weer, verberg de standaard structurele gegevens en selecteer de cartoonweergave om de structurele kenmerken van het eiwit duidelijk te visualiseren. Klik op de nucleotide sequentie aan de bovenkant van het scherm om verschillende delen van het molecuul te markeren, wijzend op de aminozuren die overeenkomen met elke onderscheidende structurele functie. Annoteer nu de verschillende structurele gebieden op de DNA-sequentie in APE door de DNA-sequentie te openen, te selecteren en op ORF's te klikken en vervolgens op het laatste aminozuur van het eerste gebied te klikken om zijn positie in de DNA-sequentie te benadrukken en de codering van de nucleotide voor dat gebied te selecteren.Klik met de rechtermuisknop op de selectie en selecteer nieuwe functie om deze een naam en een kleur te geven. Herhaal het proces voor elke structurele regio die in de vorige stap is geïdentificeerd. Om de residusequenties van de twee eiwitten uit te lijnen, verkrijgen we eerst de volledige aminozuursequenties van donor- en receptoreiwitten in APE.Open net als voorheen de donor-DNA-sequentie, selecteer deze en klik op ORFs translate. Dan, toegang tot de Clustal Omega webpagina en zet dan de aminozuur sequenties van de twee eiwitten. Elke sequentie moet worden uitgevoerd door een tekstregel met eiwitnaam die naar behoren moet worden geïdentificeerd.Scroll naar beneden en klik op verzenden. Haal het uitlijningsbestand op door op het tabblad Downloaduitlijningsbestand te klikken en het op te slaan. Dit bestand kan worden geopend door elk tekstbewerkingsprogramma.Met behulp van de uitlijning bestand als referentie, annoteren de overeenkomstige structurele gebieden van de donor eiwit in hun DNA-sequentie. Maak een kopie van de geannoteerde DNA-sequentie van het receptoreiwit en hernoem het als een kimerisch eiwit. Open de omgedoopte DNA-sequentie in APE.Selecteer het gebied dat moet worden uitgewisseld in het donoreiwit en selecteer vervolgens het overeenkomstige gebied in het omgedoopte receptoreiwit. Plak de dna-sequentie van het donoreiwit en sla de veranderingen op. Ontwerp de terminalprimers met behulp van een DNA-editor zoals APE.Maak een nieuw DNA-bestand, start de eindterminal primer met een leider sequentie. Gevolgd door de eerste beperkingsplaats geselecteerd in de vectoren MCS en de optionele spacer in de eerste 18 tot 27 basisparen van het gen van belang. In het nieuwe DNA-bestand, ontwerp de C terminal primer sequentie om te beginnen met de laatste 18 tot 27 basisparen van het gen van belang, gevolgd door een optionele spacer, de tweede beperking site gekozen, en de leider sequentie.Markeer de hele reeks, klik met de rechtermuisknop en selecteer omgekeerd compliment om de omgekeerde primer te verkrijgen. Nu, ontwerp primers voor elk van de grensregio's in de kimerische constructies. Markeer in de DNA-sequentie van de kimera een 30-basispaargebied in de zone waar de oorspronkelijke en ingevoegde sequenties in contact zijn.Dit bestaat uit 15 basisparen in elke reeks. Kopieer de regio en plak het in een nieuw DNA-bestand. Deze volgorde zal de voorwaartse primer zijn.Maak een kopie van de voorwaartse primer die in de vorige stap is gegenereerd en wijzig deze als de omgekeerde primer. Markeer de primer-reeks, klik met de rechtermuisknop en selecteer omgekeerd compliment om de omgekeerde primer-reeks te genereren. Herhaal deze stappen voor elke contactzone in de kimeric DNA-sequentie.Over het algemeen zijn twee sets van voorwaartse omgekeerde primers nodig om één kimera te genereren, tenzij de vervanging plaatsvindt in de N-terminal- of C-terminalregio's. Bereid een individueel PCR-reactiemengsel voor elk van de fragmenten die het kimerïsche eiwit vormen. Stel eerst een één punt vijf mililiter microfuse buis op ijs en pipet de verschillende reagentia van de PCR mengsels in de volgorde vermeld in het tekstprotocol.Zorg ervoor dat voor elke PCR-reactie correcte primers en sjablonen worden gebruikt. Label twee dunne ommuurde nulpunt twee mililiter PCR buizen voor elke reactie en overdracht 20 microliters van de overeenkomstige PCR mengsel in elke buis. Breng de PCR-buizen over naar een PCR-thermocycler en start het protocol zoals beschreven in het tekstprotocol.Nadat de PCR-reactie is voltooid, voeg vier microliters van zes x DNA-laadbuffer in elke buis toe. Steek de agarossgel van één procent in een elektroforese-eenheid en bedek met TAE-buffer. Laad de monsters voorzichtig in de gel samen met een moleculair gewicht laatste.Na het uitvoeren van de gel op 80 tot 120 volt gedurende 20 tot 45 minuten, zet de elektroforese unit en verwijder de agoros gel. Visualiseer de versterkte DNA-banden onder UV-licht. Knip met een scheermesje de afzonderlijke DNA-fragmenten uit de gel en breng ze over naar twee mililiter microfuse buizen.Na het gebruik van een PCR clean up kit om de DNA-fragmenten te zuiveren, kwantificeren van de hoeveelheid DNA teruggevonden door het meten van de absorptie van de monsters op 260 nanometer en 340 nanometer in een spectrofetometer. Voer NU PCR-versterking uit om de kimeric DNA-sequentie te genereren. Stel eerst 50 microliter van een PCR-reactie in om de afzonderlijke bestanddelen van de kimera te smelten zoals voorheen.Gebruik de N terminal en C terminal primers samen met 10 nanogram van elk van de versterkte DNA-fragmenten. Herstel en kwantificeer het gezuiverde DNA-fragment zoals voorheen, in 30 microliter kernvrij water. Dit fragment bevat de kimeric DNA sequentie geflankeerd door de beperking sites opgenomen in de terminal primers.Generatie van een kimeric eiwit wordt geïllustreerd met twee leden van de inter luke en zes sytokine familie. Oncostaten M in leukemie remmende factor. De OSM lift kimera is het resultaat van het uitwisselen van de BC loop regio van OSM met een overeenkomstige lift sequentie.De eerste PCR versterkingsstap bestond uit drie afzonderlijke reacties. Het N-terminal OSM-fragment, waarvoor N-terminal OSM naar voren en BC start reverse primers gebruikt OSM als de sjabloon. De LIF BC-lus werd verkregen door bc start naar voren en BC N omgekeerde primers met LIF als sjabloon.De C-terminal OSM fragment gebruikt BC einde vooruit en C terminal OSM reverse primers evenals OSM als de sjabloon. Deze gezuiverde fragmenten werden vervolgens gebruikt als de sjabloon in de tweede PCR-reactie, samen met N-terminal OSM naar voren en C-terminal OSM reverse primers om de overeenkomstige OSM LIF BC-lus gensequentie te versterken. Na zuivering en transformatie in e-coli, werden individuele plasmiden geïsoleerd en gescreend door beperking enzymvertering voor een goede invoeging van het DNA-fragment.Gel elektroforese bleek positieve hits die vervolgens werden verzonden voor sequentie verificatie. Kimeric eiwitten moeten worden geproduceerd en de activiteit gemeten in een perfecte factie systemen. Om het belang van de vervangen regio's voor die specifieke fractie te bepalen.Deze techniek is zeer nuttig en vaak toegepast, interfereerde van signally receptoren om belangrijke functie domeinen en receptor herkenning sites te identificeren. Het nummer dat ik gebruik voor DNA-elektroforese moet worden behandeld met behulp van wegwerphandschoenen, een laboratoriumjas en beschermende brillen.

identification-functional-protein-regions-through-chimeric-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In vergelijking met traditionele affiniteitschromatografie met behulp van eiwit A agarose kraal-verpakte kolommen, eiwit A membraan adsorbers kunnen aanzienlijk versnellen laboratorium-schaal isolatie van antilichamen en andere Fc fragment-expresserende eiwitten. Geschikte analyse- en kwantificeringsmethoden kunnen de eiwitverwerking verder versnellen, waardoor isolatie/karakterisering in één werkdag kan worden voltooid, in plaats van 20+ werkuren.

Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow

Dit artikel illustreert het gebruik van puls-chase radio-labeling in combinatie met plaatsspecifiek fotocrosslinking om interacties te monitoren tussen een eiwit van belang en andere factoren in E. coli. In tegenstelling tot traditionele chemische cross-linking methoden, genereert deze aanpak hoge resolutie “momentopnamen” van een geordende assemblageroute in een levende cel.

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Hier presenteren we een protocol om de oriëntatie en topologie van integrale membraaneiwitten in levende cellen te bepalen. Dit eenvoudige protocol is gebaseerd op de selectieve proteasegevoeligheid van chimaeren tussen het eiwit van belang en GFP.

Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

Synthetische eiwitsequenties gebaseerd op consensusmotieven negeren doorgaans co-evolerende residuen, die interpositionele afhankelijkheden (IPD's) impliceren. IPD's kunnen essentieel zijn voor activiteit, en ontwerpen die ze negeren, kunnen resulteren in suboptimale resultaten. Dit protocol gebruikt StickWRLD om IPD's te identificeren en helpt bij het informeren van rationeel eiwitdesign, wat resulteert in efficiëntere resultaten.

Optimalisatie van synthetische eiwitten: Identificatie van interpositioneel afhankelijkheden Indicating structureel en / of functioneel verbonden Residuen

Een construct dat codeert TMEM184A met een GFP-tag aan het carboxy-uiteinde ontworpen voor eukaryotische expressie, werd gebruikt in testen die de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen bevestigen.

Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity

Hier presenteren we chimera assemblage door plasmideherstel en restrictie-enzymplaatsinzending (CAPRRESI), een protocol gebaseerd op de invoeging van restrictie-enzymplaatsen in synoniem-DNA-sequenties en functioneel plasmideherstel. Dit protocol is een snelle en goedkope methode voor het smelten van proteïne-coderende genen.

CAPRRESI: Chimera Assembly Door Plasmide Recovery En Restriction Enzyme Site Insertion

De beschreven protocollen toestaan de bouw, karakterisering en selectie (tegen het doelwit) van een bibliotheek van de "domainome" gemaakt van elke bron van DNA. Dit wordt bereikt door een onderzoek-pijpleiding dat verschillende technologieën combineert: faag display, een opvouwbare verslaggever en de volgende generatie sequencing met een web-tool voor data-analyse.

Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Dit protocol wordt beschreven hoe een verslaggever systeem dat kan worden gebruikt voor het identificeren en kwantificeren van receptor-ligand interacties te stellen.

Een systeem van de BW verslaggever voor het bestuderen van de Receptor-Ligand interacties

We beschrijven een methodologie gebaseerd op sequentiediversificatie om de aminozuurvoorkeuren van multispecifieke bindingsplaatsen in eiwit-eiwitinteracties (PPI's) te schatten. In deze strategie worden duizenden potentiële peptideliganden gegenereerd en gescreend in silico, waardoor enkele beperkingen van beschikbare experimentele methoden worden overwonnen.

Computationele voorspelling van aminozuurvoorkeuren van potentieel multispecifieke peptide-bindende domeinen die betrokken zijn bij eiwit-eiwitinteracties

Leer chimeer eiwitbouw voor functionele analyse door regio-uitwisseling tussen structureel verwante eiwitten. Deze methode identificeert kritieke domeinen voor biologische activiteit en helpt bij proteïne-engineering.

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

Meer video's verkennen