Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over Telomeren, zoals gist telomeric noncoding RNA TERRA lokaliseren, en ik kan erop aandringen dat het telomeer van oorsprong of in trans, een andere cromes-mants Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om TERRA moleculen te visualiseren uitdrukken van een enkele telomeer in levende cellen. Demonstreren van de procedure zal Claudio Oss Pegorar en Nicole Bettin, twee afgestudeerde studenten van mijn laboratorium. Om te beginnen met het kweken van AGS-cellen volgens het tekstprotocol.

Wanneer de cellen 50 tot 60% samenvloeiing bereiken, transpect ze dan met sgRNA Cas9 uitdrukkende vector en de MS2 cassette. De volgende dag vervang het culturing medium door medium met Neomycine. Voeg hierna 10 microliter van 0,25% Tripsyn toe aan elke put van een 96 putplaat.

Met behulp van een microscoop en een marker, markeer de positie van elke kloon zichtbaar in de schotel. Vervang het Neomycine kweekmedium door voldoende PBS om een dunne laag vloeistof op de klonen te vormen. Met behulp van een 10 microliter pipet met vijf microliters trypsin, langzaam laat de Trypsin op de kolonie.

Laat de Trypsin de cellen een minuut losmaken. Schraap de kolonie met de punt, en zuig het op in de punt. Breng hierna de cellen van de kolonie over naar een put van de 96 putplaat.

Broed de plaat vijf minuten lang in bij kamertemperatuur. Vul vervolgens de put met 150 microliters van selectief medium. Voeg vervolgens 100 microliters gelatine toe aan elke put van drie 96 putplaten.

Incubeer de platen op kamertemperatuur gedurende 30 minuten en was de platen twee keer met PBS. Nadat de klonen 90% samenvloeiing bereiken, het medium uit elke put van de plaat aanzuigen en de plaat wassen met PBS. Voeg vervolgens 30 microliter trypsin toe aan elke put en broed de plaat gedurende vijf minuten uit op 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 70 microliter selectief medium toe aan elk van de putten. Verstoor de cellen door op en neer te pipetten. Breng 30 microliter van het mengsel over naar de put van de gelatiniseerde DNA-plaat met 120 microliter van selectief medium.

Breng vervolgens 30 microliter van het mengsel over naar de gelatiniseerde vriesplaat met 50 microliter van het medium. Plaats het DNA in de couveuse, en laat de cellen groeien op 37 graden Celsius totdat ze 90% samenvloeiing bereiken. Voeg hierna 80 microliters ijskoud ijskoud medium toe aan elke put van de vriesplaat.

Verzegel de plaat met parafilm, vervang het deksel en wikkel de plaat in aluminiumfolie. Houd dan de ijskoude platen op 80 graden celsius. Nadat de klonen in de DNA-plaat 90% samenvloeiing hebben bereikt, was de plaat twee maal met PBS.

Vervolgens lyse de cellen met 50 microliter van Lysis buffer. Bedek de plaat met parafilm, vervang het deksel en wikkel de plaat in saran wrap. Daarna, incubeer de plaat op 37 graden celsius 's nachts.

De volgende dag voeg 100 microliter ethanol natriumchloride oplossing aan elke put, en laat DNA-neerslag voor zes uur of 's nachts bij kamertemperatuur. Keer de plaat vervolgens om en was deze drie keer met 200 microliter ethanol 70% per put. Voeg 20 microliter RNase Een oplossing toe aan elke put van de plaat en broed de plaat een uur lang uit op 37 graden Celsius.

Gebruik hierna drie microliters genomisch DNA voor PCR-versterking en stel de PCR-machine in. Laat de PCR-positieve klonen groeien in zes goed platen volgens het tekstprotocol. Zodra de klonen bereiken 90%-samenvloeiing, was de cellen met PBS, en voeg 250 microliters van Lysis buffer met Proteinase K aan elke put.

Gebruik een celschraper om de cellen te schrapen en breng het Lysaat over naar een buis van 1,5 milliliter. Broed het Lysaat op 37 graden celsius gedurende 16 uur. Voeg een milliliter ethanol toe aan het Lysaat en schud krachtig.

Laat de klonen groeien in F-12K medium volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens het Cre-uitdrukkende adenovirus toe aan de cellen zodra ze 70% samenvloeiing bereiken. 48 uur na infectie, split de cellen in drie 10 centimeter gerechten.

Dan cultuur de derde gerechten voor cel bevriezing, en RNA extractie. Ten eerste, plaat de TERRA-MS2 klonen en het wilde type AGS cellen in glazen bodem schotels. Voeg vervolgens Polybrene en de MS2-GFP die retrovirus uitdrukken toe aan het medium.

Na 24 uur gooi het medium met het retrovirus weg en voeg het verse medium zonder fenolrood toe aan de cellen. Ten slotte, met behulp van een omgekeerde microscoop en een gevoelige camera beeld van de cellen met de juiste doelstelling en diafragma. In dit protocol kankercel klonen met een MS2 sequentie tag op een enkele subtelomere werden gemaakt en afgebeeld.

De Neomycine resistente klonen werden gescreend met behulp van PCR. De positieve klonen werden gekweekt op lysed voor genomic DNA extractie en Zuidelijke vlek analyse. De klonen die positief zijn voor pcr- en zuidelijke vlekanalyse werden besmet met de CRE-GFP die Adenovirus uitdrukte om het Neomycine-gen in de MS2-cassette te verwijderen.

Zodra de eliminatie van het Neomycine resistentiegen werd bevestigd, werd RNA uit de klonen getest op de expressie van TERRA-MS2 transcripties. Om TERRA-MS2 transcripties in levende cellen per confocale microscopie te visualiseren, werden de geselecteerde klonen geïnfecteerd met een retrovirus dat een MS2-GFP-fusieeiwit uitdrukte. TERRA-MS2 transcripties en telomeren werden gelijktijdig gevisualiseerd in levende cellen via confocale microscopie door co-expressing de MS2-GFP fusie-eiwit en een mCherry gesmolten telomeer bind eiwit, TRF2, in de geselecteerde klonen.

Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om alles in het werk te stellen om een enkele kloon te selecteren in plaats van een gemengde populatie klonen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals een DNA FISH op chromosoom spreads worden gebruikt om de integratie van de MS2 cassette in vaste cellen te visualiseren. Na de ontwikkeling ervan kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van telomeren om de cellulaire lokalisatie van enkele telomeer TERRA moleculen in levende menselijke cellen te verkennen.

Vergeet niet dat het werken met virale vectoren en radioactieve materialen uiterst onzeker kan zijn. En voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van labjassen, handschoenen en het gebruik van plexiglas schilden om straling te minimaliseren moet altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.