Name: Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer hoe je TERRA-transcripten visualiseert vanuit een enkele telomeer in levende kankercellen met behulp van MS2-markering en confocale microscopie. Deze methode biedt inzicht in telomeerbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor het personeel van de geavanceerde imaging faciliteit van CIBIO bij de Universiteit van Trento en de BioOptics licht microscopie faciliteit op de Max F. Perutz laboratoria (MFPL) in Wenen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de Mahlke-Obermann-Stiftung en de zevendekaderprogramma voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie van de Europese Unie onder de Subsidieovereenkomst geen 609431 bij EG. EG wordt ondersteund door een Rita Levi Montalcini fellowship van het Italiaanse ministerie van onderwijs, Universiteit en onderzoek (MIUR).

1. Selectie van resistente neomycine klonen
<ol><li>AGS in Ham van F-12_K (Kaighn) medium aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem) en streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) bij 37 ° C en 5% CO2cellen groeien. Transfect van de cellen aan een 50-60% samenvloeiing met de sgRNA/Cas9 uiten van vector en het MS2-cassette op een 1:10 molaire verhouding21. Opmerking: In een parallelle experiment, laten verifiëren van transfectie efficiëntie door een vector van GFP-uitdrukken (dat wil zeggen, Cas9-GFP vector) transfecting. Ten minste 60-70% transfectie efficiëntie moet worden bereikt.</li>
	<li>De volgende dag, vervang het kweken medium met medium dat neomycine op 0,7 µg Mo/mL eindconcentratie (selectieve medium). Opmerking: De cellen splitsen en ze zaaien in het selectieve medium overmorgen transfectie zal versnellen van het selectieproces. Alle niet-transfected cellen zal onmiddellijk sterven. Als transfectie is uitgevoerd in 6 goed platen, in welk geval elk putje op een 60% zou samenvloeiing bevatten ongeveer 0.7 x 106 cellen, de volgende dag die de cellen uit een enkele bron aan een 10 cm schotel met selectieve medium kunnen worden verdeeld.</li>
	<li>Houden van de cellen in het selectieve medium voor 7-10 dagen, middellange eenieder wijzigen of twee dagen, totdat één klonen zichtbaar zijn.</li>
	<li>Picken van cel klonen<ol>
<li>Bereiden een 96 goed plaat met 10 µL van 0,25% trypsine in elk putje. Opmerking: Twee opstellen 96 platen goed in het geval dat meer dan 96 klonen moeten worden gepickt.</li>
		<li>Met het gebruik van een Microscoop, Markeer de positie van elke kloon zichtbaar in de 10 cm schotel doordat een stip aan de onderkant van de schotel met behulp van een markering. Elke stip komt overeen met een kolonie worden gepickt.</li>
		<li>Vervang het kweken medium met net genoeg fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vormen een dunne film van vloeistof op het klonen en niet laat de cellen droog tijdens het picken van de kloon.</li>
		<li>Kies één kolonies met behulp van een precisiepipet 10 µL. Hechten de tip met 5 µL van trypsine naar de kolonie en langzaam laat de trypsine die gelokaliseerde op de kolonie blijven zal. Toestaan trypsine loskoppelen van de cellen voor 1 min en vervolgens schrapen de kolonie met de tip en het zuigen in de tip. Opmerking: Tijdens deze procedure, spiegelen de schotel een beetje aan de ene kant, dus om het volume van PBS rond de kolonie wordt geplukt, het pickproces helpen zal door het vermijden van de trypsine rond de kolonie te verdunnen. Met behulp van een kloon ring kan ook helpen het oppakken van één klonen.</li>
		<li>Plaats de cellen uit de kolonie in een putje van de 96 goed plaat met 10 µL van 0,25% trypsine.</li>
		<li>Incubeer 5 min bij kamertemperatuur, vul de put met 150 µL van selectieve medium (Ham van F - 12K (Kaighn) medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem), streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) en bevattende neomycine op dan een concentratie van 0,7 µg/mL. Opmerking: Tijdens de incubatietijd andere klonen kunnen worden geplukt. Het is raadzaam om te plukken zo veel klonen mogelijk. De meer klonen worden geplukt hoe hoger de kans zal zijn om positieve degenen te identificeren.</li>
		<li>Zodra alle van de klonen zijn geplukt en in de 96 goed plaat overgebracht, zodat de cellen groeien voor een paar dagen in het selectieve medium Ham van F - 12K (Kaighn) medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem), streptomycine (0,2 µg per mL van medium) en met Neomycine bij een concentratie van 0,7 µg Mo/mL bij 37 ° C en 5% CO2, tot het bereiken van de samenvloeiing van de 90%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Splitsing van klonen<ol>
<li>Bereiden drie 96 goed platen bedekt met gelatine door toe te voegen 100 µL van gelatine per putje, Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, dan twee keer wassen met PBS. Deze platen zal worden gebruikt voor DNA-extractie (DNA plaat) en voor kloon bevriezing (bevriezing platen). Opmerking: Gelatine bevordert de bijlage van de cellen en het DNA in de putjes. In het bijzonder de gelatine coating zal het toestaan van het DNA te houden aan de onderkant van de putten tijdens de DNA-extractie en wassen van procedures (hieronder besproken). Tijdens de kloon-splitsing procedure is het raadzaam om het gebruik van een meerkanaalspipet.</li>
		<li>Zodra klonen 90% samenvloeiing bereiken, gecombineerd medium uit elk putje van de 96 goed plaat, wassen met PBS, Voeg 30 µL van 0,25% trypsine per putje en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Opmerking: Klonen zal groeien verschillende tarieven, die ook van het aantal cellen per kloon geplukt afhangen zal. Dus wordt deze stap uitgevoerd tijdens de verschillende dagen wanneer de verschillende klonen samenvloeiing van 90 bereikt %.</li>
		<li>Voeg 70 µL van selectieve medium per putje, cel klontjes door pipetteren op en neer in de putjes verstoren, dan 30 µL van de 100 µL naar de gelatinized DNA plaat gevuld met 120 µL van selectieve medium per µL van het goed en 30 aan de gelatinized bevriezing platen kant wit h 50 µL medium (zonder selectie).</li>
		<li>Plaats van de DNA-plaat in de incubator en laat de cellen om te groeien op 37 ° C en 5% CO2 tot 90% samenvloeiing.</li>
		<li>Toevoegen van 80 µL van ijskoude vers gemaakte 2 x bevriezing medium (80% FBS en 20% dimethylsulfoxide (DMSO)) aan elk putje van de bevriezing plaat, voeg parafilm (gespoten met 70% ethanol) op de top van de plaat zo aan elk putje zegel, plaats het deksel op de top en wikkel de plaat met aluminiumfolie. Plaats de bevriezing platen bij-80 ° C.</li>
		<li>Voeg 90 µL van selectieve medium per putje aan de oorspronkelijke 96 goed plaat met het klonen die zijn gesplitst en houd het in cultuur tot PCR screening van resultaten. Deze plaat zullen worden gebruikt als back-up-plaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. screening van neomycine resistente klonen
<ol><li>DNA-extractie van de 96 goed DNA plaat.<ol>
<li>Zodra de klonen gekweekt in de DNA-plaat 90% samenvloeiing bereiken, 2 keer wassen met PBS, dan lyse met 50 µL lysis-buffermengsel (10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0,5% SDS en 1 mg/mL proteïnase K). De afdekplaat met parafilm, afdichten van elk putje, zet het deksel op, dek af met saran omslag, en bij 37 ° C's nachts.</li>
		<li>Voeg 100 µL van koude ethanol (Et-OH) / NaCl-oplossing (0,75 M NaCl in 100% ethanol) voor elk goed en neerslag gedurende 6 uur of 's nachts bij kamertemperatuur. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
		<li>Verwijder de Et-OH/NaCl-oplossing door het omkeren van de plaat en 3 keer wassen met 200 µL van 70% ethanol per putje.</li>
		<li>Voeg 25 µL van RNAse A oplossing in gedestilleerd water en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>3 µL van genomic DNA voor PCR versterking gebruiken. Uitvoeren van PCR screening van de geselecteerde klonen gebruikend inleidingen binnen het neomycine resistentie gen en subtelomere 15q gloeien. PCR versterking wordt uitgevoerd met behulp van standaard polymerase enzymen en PCR protocollen21. Opmerking: PCR voorwaarden MS2 primers (MS2-subtel15q-primer-S en MS2 primer als) en inleidingen van de Klikfrequentie (CTR prime S en CTR primer als) zijn de volgende: 98 ° C gedurende 20 s als denaturatie stap en vervolgens 34 cycli bij 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , met behulp van polymerase enzym in een 25 µL reactie mix (Zie Tabel van materialen). Primer sequenties zijn aangegeven in tabel 1.</li>
	<li>Uitvoeren van PCR reacties op agarose gel en PCR banden positieve klonen met behulp van de standaard gel extractie procedures (Zie Tabel van materialen voor gel extractievloeistoffen) verkregen extract.</li>
	<li>Analyses van DNA sequencing van het PCR-product met gel-geëxtraheerde voor bevestiging van de aanwezigheid van de MS2 sequenties21uitvoeren. Opmerking: De sequencing analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van de inleidingen voor de screening van de PCR gebruikt.</li>
	<li>Zuidelijke vlek screening van positieve klonen van PCR<ol>
<li>De klonen positieve PCR en sequencing screening van de oorspronkelijke 96 goed plaat (de back-up-plaat) aan 6 goed platen in Ham van F - 12K (Kaighn) medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem), streptomycine (0,2 µg per groeien mL voedingsbodem) en met Neomycine bij een concentratie van 0,7 µg Mo/mL bij 37 ° C 5% CO2. Opmerking: Als alternatief, als sommige van deze klonen verloren zijn, ontdooi ze uit een van de bevriezing platen (zie protocol 2.6).</li>
		<li>Zodra de klonen zijn aan 90% samenvloeiing in de 6 goed plaat, wassen van de cellen met PBS en voeg 250 µL van lysis buffer met 0,5 µg proteïnase K per putje.</li>
		<li>De cellen met behulp van een cel schraper Schraap en breng de lysate in een 1,5 mL-buis.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur.</li>
		<li>Voeg 1 mL ethanol 100%, schud krachtig en toestaan van het DNA te precipiteren van ten minste 2 uur of overnachting bij-20 ° C. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
		<li>Spin bij 13.400 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant en wassen van de pellets met 70% ethanol. Laat de lucht van de pellets drogen bij kamertemperatuur. Ook gebruiken een vacuüm concentrator.</li>
		<li>Resuspendeer de DNA-pellets in 50 ÂµL van gedistilleerd water met RNAse A en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>Het verteren van 5-10 µg genomic DNA via NcoI en BamHI restrictie-enzymen (twee onafhankelijke spijsvertering) in 100 µL reactie volume het broeden van de reacties van de spijsvertering bij 37 ° C's nachts.</li>
		<li>4 µL van de spijsvertering op agarose gel (0,8% agarose) voor volledige spijsvertering bevestiging uitgevoerd.</li>
		<li>1/10 volume van natrium acetaat 3 M oplossing pH 5.2 en 2 volumes van 100% ethanol toevoegen met de reacties van de spijsvertering beperking en incubeer ten minste 2 uur of overnachting bij-20 ° C te precipiteren DNA. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
		<li>Centrifugeer bij 13.400 x g bij 4 ° C gedurende 20 min, gooi het supernatant en wassen van de pellets met 70% ethanol. Laat de korrels in de lucht droog bij kamertemperatuur. Ook gebruiken een vacuüm concentrator.</li>
		<li>Resuspendeer pellets in 20 ÂµL van gedistilleerd water en laadt u het verteerd DNA op een agarose gel van 0,8%. Opmerking: Voor een betere resolutie van verteerd DNA, bereiden een gel ten minste 15 cm lang en 's nachts draaien op lage spanning (volt ̴30). De elektroforese ingesteld moet worden geoptimaliseerd.</li>
		<li>De volgende dag, vlek de gel met een DNA-etikettering agent, zoals ethidiumbromide op 1 µL/10 mL eindconcentratie, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en neem een foto met een liniaal dichtbij de gel op een gel imaging instrument.</li>
		<li>De overdracht van DNA instelt met een nylon membraan en het uitvoeren van membraan kruising met een MS2 sequentie-specifieke sonde met behulp van standaardprocedures21.</li>
		<li>Ontdooi de klonen die positief op PCR, DNA sequencing en zuidelijke vlek uit een van de twee bevriezing platen (zie volgende stap).</li>
	</ol></li>
	<li>Ontdooien van klonen<ol>
<li>Bereiden van een tube van 15 mL met 5 mL voor de voorverwarmde Ham F - 12 K (Kaighn) medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem) en streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) voor elke kloon worden ontdooid.</li>
		<li>Verwijder een van de bevriezing platen van-80 ° en voeg 100 µL voorverwarmde F12K compleet medium naar de goed met de positieve kloon worden ontdooid. Opmerking: Deze procedure moet snel worden uitgevoerd en de 96 goed plaat moet worden gelegd op droog ijs na elke kloon is ontdooid, zodat de andere klonen te blijven bevroren. Dit is vooral van belang als meerdere klonen moeten worden ontdooid van de dezelfde 96 goed plaat.</li>
		<li>De cellen overbrengen in de tube van 15 mL met 5 mL van medium en centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Het medium gecombineerd, resuspendeer de cellen in 500 µL voorverwarmde volledige F12K medium en elke kloon overbrengen in een enkel putje van een 12 goed plaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Afschaffing van het neomycine resistentie gen van de cassette MS2 op subtelomere 15q geïntegreerd.<ol>
<li>Laat het klonen te groeien van een 12 goed plaat naar een 10 cm schotel in volledige F12K medium. Opmerking: Neomycine moet niet worden opgenomen in het medium tenzij anders aangegeven.</li>
		<li>Het adenovirus Cre-uiten aan de gekweekte cellen in een 10 cm schotel aan 70% samenvloeiing in 10 mL van volledige F12K medium toevoegen. Opmerking: Met behulp van een Cre-GFP waarin adenovirus kan evaluatie van de efficiëntie van de infectie, die 100% moet benaderen. De replicatie-defecte adenovirus zullen verloren gaan na enkele passages in cultuur.</li>
		<li>48 uur na infectie, splitst u de cellen in drie 10 cm schotels. Twee gerechten zullen worden gebruikt voor verificatie van het neomycine gene wegnemen door negatieve selectie, groeiende cellen in neomycine-bevattende medium (eerst schotel), en door de zuidelijke vlek (tweede schotel).</li>
		<li>Cultuur van de derde schotel met de kloon voor cel invriezen en RNA extractie.</li>
	</ol></li>
</ol>3. verificatie van de TERRA-MS2 Transcript expressie door RT-qPCR
<ol><li>Na verificatie van neomycine gene verwijdering, totaal RNA extractie van TERRA-MS2 klonen met behulp van organische oplosmiddelen (fenol en guanidine isothiocynate oplossing)21uit te voeren.<ol>
<li>Resuspendeer de RNA geëxtraheerd uit een 10 cm schotel in 100 ÂµL van diethyl pyrocarbonate (DEPC) water.</li>
		<li>3 µL van RNA op gel in werking een denaturating (1% formaldehyde-bevattende) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic zuur (MOPS) om na te gaan van concentratie en de integriteit van het RNA. Ook analyseren RNA concentratie met een spectrofotometer.</li>
		<li>Behandelen van 3 µg van RNA met DNAse mij using 1 eenheid van DNAse ik enzym in 60 µL definitieve reactie volume.</li>
		<li>Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reverse transcriptie reactie en qPCR analyses<ol>
<li>De volgende onderdelen toevoegen aan een nuclease-gratis microcentrifuge-buis: 2 µL van een specifieke primer bij 1 µM TERRA, 1 µL van dNTPs mix (elke 10 mM), 6 µL van DNAse ik behandelde RNA (overeenkomend met ̴300ng RNA). Stel het volume in op 13 µL met 4 ÂµL van DEPC water. Opmerking: Voor elke RNA te analyseren, een tweede buis met dezelfde reagentia maar een referentie specifieke primer, in plaats van TERRA specifieke primer, moet worden opgesteld.</li>
		<li>Verwarm het mengsel tot 65 ° C gedurende 5 minuten en incubeer in ijs voor minstens 1 min.</li>
		<li>Verzamelen van de inhoud van de buizen door kort centrifugeren en voeg 4 µL van 5 X RT enzym Buffer, 1 µL 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 µL (4 eenheden) van RNAse remmer en 1 µL van reverse-transcriptase (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 60 min, gebruik dan 2 µL van de RT-reactie voor qPCR analyses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>QPCR reactie mix in een eindvolume van 20 µL bestaande uit 10 µL van 2 x qPCR master mix, 2 µL van cDNA sjabloon, 1 µL van voorwaartse primer (10 µM), 1 µL van omgekeerde primer (10 µM), en 6 ÂµL van water voor te bereiden.</li>
	<li>QPCR reactie in een thermocycler via standaardprotocollen21uitvoeren.</li>
</ol>4. productie van een retrovirussen MS2-GFP uitdrukken
<ol><li>Wilt genereren waarin retrovirus MS2-GFP, transfect 80% confluente phoenix verpakking cellen met een MS2-GFP fusieproteïne uitdrukken retrovirus vector (pBabe-MS2-GFP PURO) en een env gen uiting van vector (zoals pCMV-VSVG) met behulp van een molaire verhouding 4:1 van de twee vectoren.</li>
	<li>De volgende dag, door het kweken medium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine en Pen/Strep) te vervangen door verse medium met 10mM natrium butyraat.</li>
	<li>Incubeer gedurende 8 uur bij 37 ° C, 5% CO2, dan vervangt het medium met verse kweken medium waar het virus verzameld worden zal.</li>
	<li>Na 48u, het retrovirus-bevattende medium van de phoenix cellen te verwijderen. Dit medium is direct inzetbaar voor infectie van TERRA-MS2 klonen, in welk geval Filtreer het medium door een 0,45 µm filter toevoegen polybrene (eindconcentratie is 30 µg/mL) en toe te voegen aan de cellen (in dit geval het protocol blijft bij stap 5). Als alternatief kan retrovirus in een tube van 50 mL falcon worden neergeslagen door toevoeging van 1/5th volume van 50% PEG-8000/900 mM NaCl-oplossing en 's nachts het broeden bij 4 ° C op een rotator-wiel.</li>
	<li>De volgende dag, pellet retrovirus deeltjes door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 30 min, verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in F12K medium zonder serum. Opmerking: De virusdeeltjes kunnen worden resuspended in 1/100,th van het oorspronkelijke supernatant volume. Een infectie test moet worden verricht om te verifiëren of de minimale hoeveelheid retrovirus vereist om de cellen efficiënt te infecteren.</li>
</ol>5. visualisatie van TERRA-MS2 afschriften in levende cellen
<ol><li>Plaat TERRA-MS2 klonen en WT AGS cellen in glazen bodem gerechten. Op de dag van de infectie, voeg toe polybrene aan het medium (eindconcentratie is 30 µg/mL) en het MS2-GFP waarin retrovirus.</li>
	<li>Na 24 uur verwijderen van het virus-bevattende medium en toevoegen van verse medium zonder fenol-rood.</li>
	<li>Het analyseren van de cellen in een omgekeerde Microscoop met behulp van de instelling van de juiste Microscoop. Het imago van de cellen met een 100 X of 60 X doelstelling met grote numerieke diafragma (1.4 X) en het gebruik van een gevoelige camera (EMCCD). Een milieucontrole-systeem gebruiken om de monsters bij 37 ° C en 5% CO2 tijdens imaging.</li>
</ol>

<ol><li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li>
<li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li>
<li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA%3A+from+Darkness+to+Dawn%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li>
<li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li>
<li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548(2018).</li>
<li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114(2017).</li>
<li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220(2014).</li>
<li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li>
<li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li>
<li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).</li>
<li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li>
<li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li>
<li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smc5%2F6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268(2016).</li>
<li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li>
<li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li>
<li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li>
<li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li>
<li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li>
<li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+noncoding+RNA%3A+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li>
<li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li>
<li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li>
<li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910(2016).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+%28TERRA%29+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li>
<li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li>
<li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li>
<li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379(2014).</li>
<li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714(2012).</li>
<li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li>
<li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li>
<li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen

In dit artikel presenteren we een methode voor het genereren van menselijke kanker cel klonen met MS2 sequenties geïntegreerd binnen subtelomere 15q. Met behulp van deze klonen, worden de transcriptie van de subtelomere-15q MS2-gelabeld TERRA-moleculen gedetecteerd door fluorescentie microscopie door co uitdrukking van een fusieproteïne MS2-GFP. Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van TERRA uitgedrukt uit een eenpersoons telomeer in levende cellen21. In dit protocol, worden TERRA-M...

De lange noncoding RNA TERRA is transcriptie van de subtélomérique regio van chromosomen en de transcriptie opbrengst naar de uiteinden van chromosomen, afgifte binnen de Telomere herhalen tract1,2. Om deze reden, TERRA Transcripten bestaan uit subtelomeric afkomstige sequenties aan hun 5'-eind en beëindigen met Telomere herhalingen (UUAGGG in Vertebraten)3. Belangrijke rollen zijn voorgesteld voor TERRA, met inbegrip van de heterochromatin formatie bij telomeren4,5, DNA replicatie6, bevordering van homologe recombinatie tussen chromosoom eindigt7,8 , 9, telomeer structuur10en telomeer lengte homeostase2,11,12,13te reguleren. Verder, TERRA afschriften communiceren met talrijke extratelomeric sites te reguleren van wijdverbreide genexpressie van muis embryonale stamcellen (ES) cellen14. In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA afschriften lokaliseren op telomeren1,2,15. Daarnaast is TERRA gemeld aan nucleaire aggregaten formulier lokaliseren op de X en Y chromosomen in2,16van de cellen van de muis. Deze bevindingen wijzen erop dat TERRA afschriften complexe dynamiek binnen de kern ondergaan. Inzicht in de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen definiëren hun functie en de mechanismen van de actie.
Het MS2-GFP-systeem is wijd verbeid gebruikt om te visualiseren de molecules van RNA in levende cellen van verschillende organismen17,18. Dit systeem is eerder gebruikt voor tag en visualiseren van single-telomeer TERRA moleculen in S. cerevisiae12,19. Met behulp van dit systeem, werd onlangs aangetoond dat gist TERRA afschriften binnen het cytoplasma tijdens de post-diauxie shift fase lokaliseren, suggereren dat TERRA extranuclear functies20kan uitoefenen. Onlangs hebben we het MS2-GFP-systeem gebruikt om te studeren van single-telomeer TERRA afschriften van kanker cellen21. Voor dit doel, wij het uitgeven hulpmiddel van CRISPR/Cas9 genoom te integreren MS2 sequenties op een enkele telomeer (telomeer 15q, hierna Tel15q) in dienst en verkregen klonen uiten MS2-gelabeld endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 klonen). Co uitdrukking van een GFP-gesmolten MS2 RNA-bindende eiwit (MS2-GFP) dat herkent en bindt MS2 RNA opeenvolgingen maakt visualisatie van single-telomeer TERRA afschriften in levende cellen21. Het doel van het protocol geïllustreerd hier is om te beschrijven in detail de stappen die nodig zijn voor de generatie van TERRA-MS2 klonen.
Voor het genereren van TERRA-MS2 klonen, een MS2 cassette is geïntegreerd in de regio subtélomérique telomeer 15q, stroomafwaarts van de TERRA promotor regio en transcriptie begin site. De MS2 cassette bevat een neomycine resistentie gen geflankeerd door lox-p sites, en zijn integratie op subtelomere 15q wordt uitgevoerd met behulp van het systeem CRISPR/Cas922. Nadat de transfectie van het MS2 cassette, enkele klonen zijn geselecteerd en subtélomérique integratie van de cassette wordt gecontroleerd door PCR, DNA sequencing en Southern blot. Positieve klonen zijn besmet met een adenovirus Cre-uiten ter opheffing van de markering van selectie in de cassette, waardoor alleen MS2 sequenties en een enkele lox-p-site op de subtelomere-15q. Expressie van TERRA MS2-gelabeld transcripties van Tel15q wordt gecontroleerd door RT-qPCR. Tot slot het MS2-GFP fusieproteïne wordt uitgedrukt in TERRA-MS2 klonen via retrovirale infectie om te visualiseren MS2-TERRA afschriften door fluorescentie microscopie. TERRA afschriften kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door RNA-vis en live-cel geschikt zijn met behulp van Telomere herhalen-specifieke sondes1,2,15,23. Deze benaderingen leveren belangrijke informatie over de lokalisatie van de totale bevolking van TERRA moleculen bij eencellige resolutie. De generatie van klonen met MS2 sequenties op een enkel subtelomere kunnen onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA afschriften in levende cellen, die zal helpen bij het definiëren van de functie en de mechanismen van de actie van TERRA.

<table><tbody><tr><td>AGS cellen</td><td>-</td><td>-</td><td>Gift van Christian Baron (Universit&eacute; de Montr&eacute;al).</td></tr><tr><td>F12K Nut Mix 1X</td><td>GIBCO</td><td>21127022</td><td>Kweekmedium voor AGS-cellen</td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>MT25005CI</td><td>Component van kweekmedium</td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine Oplossing</td><td>CORNING</td><td>30-002-CI</td><td>Component van kweekmedium</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Component van kweekmedium</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>GIBCO</td><td>21068028</td><td>kweekmedium voor phoenix-cel</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>gebruikt bij de phoenix-celtransfectie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing)</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing) en retrovirus precipitatie</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td>gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing)</td></tr><tr><td>TRYPSIN EDTA OPLOSSING 1X</td><td>CORNING</td><td>59430C</td><td>gebruikt bij celsplitsing</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>GIBCO</td><td>14190250</td><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>Component van celvriesmiddel (80% FBB en 20% DMSO)</td></tr><tr><td>G-418 Disulfaat</td><td>Formedium</td><td>G4185</td><td>selectiemiddel voor&nbsp;</td></tr><tr><td>Gelatine oplossing Bioreagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>coating van 96-well DNA-plaat en vriesplaat</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>10376743</td><td>Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71729</td><td>Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2546</td><td>Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Fisher</td><td>12091021</td><td>RNA degradatie tijdens DNA extractie</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>DNA gel voorbereiding</td></tr><tr><td>Atlas ClearSight</td><td>Bioatlas</td><td>BH40501</td><td>Kleurmiddel gebruikt voor het detecteren van DNA en RNA monsters in agarose gel</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP28184</td><td>DNA precipitatie</td></tr><tr><td>Natriumacetaat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td>Gebruikt voor DNA precipitatie op een 3M concentratie pH5.2</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel en PCR clean-Up systeem</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Extractie van PCR fragmenten uit agarose gel tijdens PCR screening van neomycin positieve klonen</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>AMBION</td><td>15596018</td><td>Organisch oplosmiddel gebruikt voor RNA extractie</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>89836</td><td>degradatie van genomisch DNA uit RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>dNTPs mix</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>gebruikt in RT en PCR reacties</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>707265ML</td><td>gebruikt in RT reacties</td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>gebruikt om RNAses in water te inactiveren (1:1000 verdunning)</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td><td>RNase inhibitor</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9381</td><td>voorbereiding van RNA gel</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>voorbereiding van denaturerende RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td></tr><tr><td>Superscript III Reverse transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>Retrotranscriptiereactie</td></tr><tr><td>Pfu DNA polymerase (recombinant)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0501</td><td>PCR reactie</td></tr><tr><td>2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td><td>PCR BIOSYSTEMS</td><td>PB 20.14</td><td>qPCR reactie</td></tr><tr><td>Cre-GFP adenovirus</td><td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td><td>1174-HT</td><td>gebruikt om TERRA-MS2 klonen te infecteren om het neomycn-gen te verwijderen</td></tr><tr><td>Natrium Butyraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td>gebruikt om de retrovirusdeeltjesproductie in phoenix-cellen te bevorderen</td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89510</td><td>Precipitatie van retrovirusdeeltjes</td></tr><tr><td>35&micro;-Schaal Glasbodem</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>gebruikt bij live cel beeldvorming analyses van TERRA-MS2 klonen</td></tr></tbody></table>

generatie van kanker cel klonen te visualiseren telomere repeat-bevattende rna terra uitgedrukt uit een enkele telomere in levende cellen

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeren zijn getranscribeerd, die aanleiding geven tot Telomere herhalen-bevattende lang noncoding RNAs (TERRA), die zijn voorgesteld om te spelen belangrijke rollen in de telomeer biologie, met inbegrip van de heterochromatin formatie en telomeer lengte homeostase. Recente bevindingen bleek dat TERRA moleculen ook met interne chromosomale regio's communiceren te regelen van genexpressie in cellen van muis embryonale stamcellen (ES). In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA lokaliseren afschriften aan chromosoom uiteinden. Een beter begrip van de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen bepalen hun functie en de mechanismen van de actie. Hier beschrijven we een methode om te etiketteren en visualiseren van single-telomeer TERRA afschriften in kankercellen met behulp van het MS2-GFP-systeem. Voor dit doel presenteren we een protocol voor het genereren van stabiele klonen, opdrachtregel de AGS menselijke maag kanker cel, met MS2 sequenties op een één subtelomere geïntegreerd. Transcriptie van TERRA van het MS2-gelabeld telomeer resulteert in de expressie van TERRA MS2-gelabelde moleculen die worden gevisualiseerd door live-cel fluorescentie microscopie op co expressie van een MS2 RNA-bindende eiwit gesmolten tot GFP (MS2-GFP). Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA moleculen in kankercellen, en het kan worden toegepast op andere cellijnen.

Figuur 1 geeft een overzicht van de experimentele strategie. De belangrijkste stappen van het protocol en een indicatief tijdschema voor de generatie van TERRA-MS2 klonen in AGS cellen worden weergegeven(figuur 1). Op dag 1, zijn meerdere putjes van een 6 goed plaat transfected met de MS2 cassette en sgRNA/Cas9 uiten van vectoren (afgebeeld in figuur 1B...

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van kanker cel klonen met een MS2 sequence tag op een enkele subtelomere. Deze aanpak, afhankelijk van het MS2-GFP-systeem, maakt de visualisatie van de endogene transcripten van Telomere herhalen-bevattende RNA (TERRA) uitgedrukt uit een enkele telomeer in levende cellen.

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over Telomeren, zoals gist telomeric noncoding RNA TERRA lokaliseren, en ik kan erop aandringen dat het telomeer van oorsprong of in trans, een andere cromes-mants Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om TERRA moleculen te visualiseren uitdrukken van een enkele telomeer in levende cellen. Demonstreren van de procedure zal Claudio Oss Pegorar en Nicole Bettin, twee afgestudeerde studenten van mijn laboratorium. Om te beginnen met het kweken van AGS-cellen volgens het tekstprotocol.Wanneer de cellen 50 tot 60% samenvloeiing bereiken, transpect ze dan met sgRNA Cas9 uitdrukkende vector en de MS2 cassette. De volgende dag vervang het culturing medium door medium met Neomycine. Voeg hierna 10 microliter van 0,25% Tripsyn toe aan elke put van een 96 putplaat.Met behulp van een microscoop en een marker, markeer de positie van elke kloon zichtbaar in de schotel. Vervang het Neomycine kweekmedium door voldoende PBS om een dunne laag vloeistof op de klonen te vormen. Met behulp van een 10 microliter pipet met vijf microliters trypsin, langzaam laat de Trypsin op de kolonie.Laat

generation-cancer-cell-clones-to-visualize-telomeric-repeat

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van levende cellen en de primaire kweek van myogene en fibroblastcellijnen uit spier- of huidweefsel. Er wordt ook een techniek beschreven voor het onvergankelijk maken van deze cellijnen. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbare tool om afgeleide cellen van patiënten te genereren en te bewaren voor downstream-toepassingen.

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

Telomeren en telomerase spelen essentiële rollen bij veroudering en tumorigenese. Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe je twee muis-induceerbare telomerase knock-in allelen kunt genereren en hoe je ze kunt gebruiken in de studies van weefseldegeneratie/regeneratie en kanker.

Gebruik makend van Muriene Induceerbaar Telomerase Allelen in de Studies van weefseldegeneratie / Regeneration en Kanker

Hier beschrijven we een methode van lange-termijn tijds-lapse microscopie om individuele cellen longitudinaal te volgen in reactie op anti-kanker therapieën.

Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

We rapporteren een beknopte procedure van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in de geslachtsklieren en embryo's van Caenorhabditis elegans voor het observeren en kwantificeren van repetitieve sequenties. We hebben met succes twee verschillende repetitieve sequenties waargenomen en gekwantificeerd, telomeer herhalingen en sjabloon van alternatieve verlenging van telomeren (TALT).

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Menselijke telomerase reverse-transcriptase (TERT) synthetiseert niet alleen Telomere DNA, maar ook double-stranded RNA door RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit. Hier beschrijven we een nieuw opgerichte assay voor het detecteren van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van endogene TERT.

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

We hebben met succes omgezet de standaard Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) assay te worden gebruikt in druppel digitale polymerase chain reacties. Deze nieuwe Assay, genaamd ddTRAP, is gevoeliger en kwantitatieve, waardoor een betere opsporing en statistische analyse van telomerase activiteit binnen verschillende menselijke cellen.

Druppel digitale val (ddTRAP): aanpassing van de Telomere Herhaal versterking protocol aan druppel digitale polymerase kettingreactie

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Dit protocol beschrijft een techniek voor cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen als een hulpmiddel om de rol van mitochondriën in het tumorogene proces te bestuderen.

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

Dit rapport beschrijft een werkwijze biotechnologie ontwerpen en bouwen van nieuwe kunstmatige splicingfactoren (ASFS) die specifiek de splitsing van doelgenen te moduleren in zoogdiercellen. Deze werkwijze kan verder worden uitgebreid met verschillende kunstmatige engineering factoren andere aspecten RNA metabolisme manipuleren.

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Leer hoe je TERRA-transcripten visualiseert vanuit een enkele telomeer in levende kankercellen met behulp van MS2-markering en confocale microscopie. Deze methode biedt inzicht in telomeerbiologie.

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen (Video) | JoVE Journal

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Meer video's verkennen