Name: Diagnose van de ziekte van Hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor Calretinin, S100 proteïne en eiwit gen product 9,5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Leer een betrouwbaar immunokleuringprotocol voor rectale zuigbiopten om de ziekte van Hirschsprung te diagnosticeren. Deze methode detecteert calretinine, S100 en PGP9.5 met hoge sensitiviteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Weibing Tang voor zijn grote hulp bij het verstrekken van de filmen Lab. Dit artikel wordt gesteund door het openbare welzijns onderzoek, en de speciale fondsen werden ontvangen van de nationale gezondheid en de familie planning van China (toelage nr. 201402007).

Dit protocol werd goedgekeurd door de onderzoek Ethiekraad van het ziekenhuis van de Unie van Huazhong Universiteit van wetenschap en technologie.
1. rectale zuig biopsie
<ol><li>Voer de rectale zuig biopsie door een goed opgeleide pediatrische chirurg en een assistent met behulp van een Rbi2 zuig rectale biopsie systeem na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming van de voogd.<ol>
<li>Voer RSB op patiënten die de volgende indicaties hebben: onvermogen om meconium te passeren bij zuigelingen of langdurige opgeblazen gevoel met of zonder constipatie bij kinderen; kinderen met lange-termijn constipatie die behoefte hebben aan paraffineolie om de ontlasting te voltooien; intestinale obstructie of intestinale perforatie met onbekende redenen bij kinderen ondergaan een enterostomy. Opmerking: de contra-indicaties voor RSB zijn als volgt: kinderen die ernstige symptomen, die in slechte fysieke conditie, of die niet kunnen tolerant de RSB; kinderen met acute-stage enterocolitis; kinderen ondergaan intestinale anastomosis zonder volledige genezing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer een normale zoutoplossing retentie klysma als darm voorbereiding 36 h voor de procedure om losse ontlasting en overmatige oedeem van het slijmvlies te voorkomen. Voeg magnesiumsulfaat oplossing als het kind heeft ernstige constipatie. Toediening van vitamine K (1 mg/kg) aan pasgeborenen. Opmerking: Voer geen preoperatieve bloedtesten of het beheer van antibiotica, omdat ze niet nodig zijn.</li>
	<li>Zet de patiënt in de lithotomy positie. Bedek het oppervlak van de buis met paraffineolie. Plaats de stompe-end buis 4-7 cm in de endeldarm met de zijkant gat tegenover de achterste of laterale muren.</li>
	<li>Breng zachte druk op de buis om een adequate hechting van de zijkant gat te vergemakkelijken aan de rectale wand. Druk op de trigger en trek het gereedschap onmiddellijk in.</li>
	<li>Gebruik de biopsie-instrument om 4 zuig biopten te verkrijgen met een diameter van 2 mm op 3 cm en 6 cm boven de tand lijn, anteriorly en posteriorly. Gebruik een naald om het monster te plaatsen op een gaasje bevochtigd met een zoutoplossing.</li>
	<li>Observeer de patiënt tot 2 uur na de procedure uit te sluiten rectale bloeden. Vermijd verdere rectale en anale manipulaties in de eerste 24 uur na RSB.</li>
</ol>2. voorbereiding van de RSB secties
<ol><li>Plaats de rectale zuig biopten in 4% Paraformaldehyde voor 6 uur om het weefsel vast te stellen. Gebruik een fixatief volume 5 keer meer dan het weefsel volume.</li>
	<li>Dehydrateer het weefsel met behulp van de pathologische weefsel dehydrater voor 11 h. Het hele geprogrammeerde proces bestaat uit de volgende 5 stappen:<ol>
<li>Plaats het weefsel in formaldehyde en bevestig voor 1 uur.</li>
		<li>Plaats het weefsel in 75% ethanol voor 4 uur.</li>
		<li>Plaats het weefsel in absolute ethanol (twee veranderingen, 1 h elk).</li>
		<li>Plaats het weefsel in absolute ethanol (twee veranderingen, 30 min elk).</li>
		<li>Plaats het weefsel in xyleen (drie veranderingen, 1 h elk).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats het weefsel in paraffine (58-60 °C) (drie veranderingen, 1 h elk). Embed de RSB weefsels in paraffineblokken.</li>
	<li>Trim de paraffineblokken met behulp van een microtome totdat het weefsel volledig is blootgesteld met een complete sectie vliegtuig.</li>
	<li>Snijd de blokken in 0,4 μm secties met een microtome.</li>
	<li>Plaats de secties in 45-50 °C water voor een paar seconden elk om de secties toe te laten om in een vlakke plaat te verspreiden.</li>
	<li>Breng de paraffine secties over op dia's.</li>
	<li>Bak de dia's in een 60 °C oven voor 3-5 h. Vermijd bakken te lang, wat kan leiden tot het verlies van de antigenen.</li>
	<li>Plaats de ontparaffine dia's in xyleen (2 veranderingen, 15 min elk).</li>
	<li>Hydrateren de dia's in absolute ethanol, 95%, 80%, en 75% ethanol voor 5 min elk. Vervolgens spoel ze in omgekeerde osmose (RO)-gezuiverd water voor nog eens 5 minuten.</li>
</ol>3. het herwinning van het antigeen
<ol><li>Maakwerk verdunningen voor calretinin ophalen door het mengen van 4 mL EDTA-antigeen ophalen buffer met 200 mL van RO-gezuiverd water. Maakwerk verdunningen voor S100 en PGP 9.5 ophalen door het mengen van 1 mL citroenzuur natrium citraat buffer (100x) met 99 mL van RO-gezuiverd water. Opmerking: Calretinin kan bij voorkeur worden opgehaald door EDTA-oplossing voor het ophalen. Echter, citroenzuur natrium citraat buffer is meer geschikt voor het ophalen van S100 en PGP 9.5.</li>
	<li>Plaats de dia's in een coplin kleuring jar. Vul de pot met ophalen oplossing en plaats deze in een voorverwarmd kokend waterbad. Na het koken voor 20 min, verwijder de pot uit het waterbad en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Het koelproces duurt ongeveer 10 minuten. Verwijder de dia's en spoel ze voorzichtig af met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Teken een cirkel met een marker pen rond het weefsel en voor te bereiden een natte doos voor de volgende procedures.</li>
</ol>4. blokkeren
<ol><li>Maakwerk verdunningen door 3 mL 30% H2O2 te mengen met 27 ml ro-gezuiverd water.</li>
	<li>Voeg twee of drie druppels van 3% H2O2 oplossing dropwise op het weefsel te blokkeren peroxidates. Voeg de H2O2 oplossing onmiddellijk toe om ervoor te zorgen dat de oplossing niet van de cirkel overloopt. Voer blokkering van peroxidates uit in een incubator van 37 °C voor 20 min.</li>
	<li>Spoel de dia's voorzichtig met PBS (drie wasbeurten, 5 min elk).</li>
	<li>Blokkeer de dia's voor 20 min bij 37 °C met 5% boviene serum albumine (BSA, bereid door het mengen van 1,5 g van BSA poeder met 30 mL RO-gezuiverd water). Opmerking: blokkeren met 3% H2O2 kan voorkomen dat 95% van de niet-specifieke kleuring en blokkering met 5% BSA kan voorkomen dat de andere 5% van de niet-specifieke kleuring. Combineer de twee methoden om een betrouwbaar resultaat te verkrijgen.</li>
</ol>5. antigeen-antilichaam reactie
<ol><li>Verwijder de 5% BSA en voeg 50 l van primair antilichaam (calretinin, S100, of PGP 9.5) toe aan de dia. Incubeer overnachting bij 4 °C.</li>
	<li>Was de dia met PBS (drie keer, 3 min elk).</li>
	<li>Voeg 50 l van de polymeer versterker toe (reagens A; Zie de lijst van materialen) aan de sectie en Incubeer het 20 min in een incubator van 37 °c. Dan, was de dia met PBS (drie keer, 3 min elk).</li>
	<li>Voeg 50 l van secundair antilichaam B (geit anti-konijn/muis IgG secundair antilichaam) aan de sectie toe en incubeer 30 min in een incubator van 37 °C. Was de sectie met PBS (drie keer, 5 min elk).</li>
</ol>6.3, 3-Diaminobenzidine en hematoxyline kleuring
<ol><li>Voeg 850 l van RO-gezuiverd water toe aan een buis van 1,5 mL en voeg de kleurstoffen reagentia toe (Zie de materiaallijst) in de volgorde a; B, en C. Voeg 50 l van elk reagens toe om een totaal van 1 ml 3, 3-DIAMINOBENZIDINE (DAB) werkoplossing te verkrijgen. Als er precipitaten, gebruik de oplossing na filtratie.</li>
	<li>Voeg een druppel van DAB werkende oplossing om het weefsel sectie en vlek voor 3-10 min. Incubeer de dia's in schar bij kamertemperatuur tot bruine kleuring wordt gedetecteerd. Monitor zorgvuldig met behulp van een helderveld Microscoop. Houd de DAB-werkoplossing weg van het licht. Dan, was de dia met PBS 5 min.</li>
	<li>Voeg een druppel hematoxyline aan eosine de kernen voor ongeveer 1 min. Dan, houd de coplin pot en was het onder een straaltje water voor ongeveer 30-40 s tot de overtollige kleurstof wordt verwijderd. Zorg ervoor dat u de weefselsecties niet beschadigt.</li>
	<li>Dompel de RSB dia's in een coplin jar met PBS voor 25-30 s. Dan, onderscheid in 1% hydrochloric zuur-ethylalcohol voor 10 s. was de dia's met PBS 1 min.</li>
	<li>Dehydrateer de dia's in de omgekeerde volgorde van hydratatie: 75%, 80%, 95%, en absolute ethanol (5 min elk).</li>
	<li>De dia's blootstellen aan xyleen (2 veranderingen, 5 min elk).</li>
	<li>Monteer de dekglaasje met ultraclean montage. Laat dia's drogen voordat visualisatie met behulp van een microscoop.</li>
</ol>

<ol><li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung%27s+disease%3A+A+bridge+for+science+and+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung%27s+disease%3A+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).</li>
<li>Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+hematoxylin+and+eosin+staining+in+patients+with+suspected+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Surgery%22%5BJournal%5D)">The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease.</a> BMC Surgery. 17 (1), 71(2017).</li>
<li>Agrawal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+histochemistry+%28AChE%29+-+A+helpful+technique+in+the+diagnosis+and+in+aiding+the+operative+procedures+of+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease.</a> Diagnostic Pathology. 10 (1), 208(2015).</li>
<li>Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry+in+Hirschsprung%27s+disease%3A+An+adjunct+to+formalin-based+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Turkish+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis.</a> The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+and+protein+gene+product+9.5+immunostaining+of+rectal+suction+biopsies+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease.</a> American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159(2016).</li>
<li>Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+procedures+update+on+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+%26+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Laboratory procedures update on Hirschsprung disease.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598(2015).</li>
<li>Meier-Ruge, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+activity+in+suction+biopsies+of+the+rectum+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).</li>
<li>Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+calretinin+expression+indicates+aganglionosis+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease.</a> Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).</li>
<li>Kapur, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Stop+Looking%3F+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry%3A+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li>
<li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li>
<li>Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+submucosal+nerve+trunk+caliber+in+aganglionosis%3A+a+%26%2334%3Bpositive%26%2334%3B+and+objective+finding+in+suction+biopsies+and+segmental+resections+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a &#34;positive&#34; and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55(1992).</li>
<li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we beschreven een procedure met behulp van drie verschillende immunohistochemische antistoffen aan RBS secties vlek voor de diagnose van HD. De gevoeligheid van ons diagnostisch protocol was 96,49% (95% CI, 0.88-0.99), en de specificiteit was 100% (95% CI, 0.97-1.00).
De meest kritieke stappen van het protocol zijn RSB en antigeen-antilichaam reactie. De grootte van de biopsie bepaalt de nauwkeurigheid van de kleuring. Een kleine biopsie zal niet genoeg weefsel om een precieze diag...

De ziekte van Hirschsprung (HD) is een gemeenschappelijke aangeboren darm darmaandoening die wordt gekenmerkt door een gebrek aan ganglioncellen in verschillende segmenten van het distale darmkanaal1. De menselijke enterische zenuwstelsel wordt gevormd wanneer de invasie van de embryonale neurale cellen is voltooid. Als er een storing van het proces is en de invasie niet voltooit, wordt de distale darm van pasgeboren aganglionic2. Deze potentieel fatale aandoening heet de ziekte van Hirschsprung. Proliferatie, beweeglijkheid, en darm groei zijn de drie belangrijkste componenten van succesvolle kolonisatie.
Traditionele hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van een beperkte submucosale biopsie kan niet bereiken als bevredigend van een resultaat als H & E kleuring van een full-dikte weefsel verkregen uit een operatie. Bovendien, acetylcholinesterase (pijn) kleuring van rectale zuig weefsel is theoretisch uitdagende vanwege de onvoldoende gevoeligheid, die is 91%, en complexe verwerking van bevroren secties3,4. Verschillende andere immunohistochemische markers van ganglioncellen en zenuwvezels die kunnen worden gekleurd in formaline-vaste en paraffine-embedded specimens zijn geleidelijk aan steeds de mainstream HD diagnostiek. Calretinin is een vitamine D-afhankelijke calcium-bindende eiwit dat niet wordt uitgedrukt in de myenteric en submucosale plexus van HD-getroffen segmenten5. S100 eiwit wordt uitgedrukt in cellen afgeleid van de neurale kuif, zoals zenuwvezels en glial cellen, die vaak aanwezig neurale hypertrofie in de submucosale weefsel van HD-getroffen segmenten6. Proteïne gen product 9,5 (PGP 9.5) betrouwbare vlekken zenuwvezels en ganglioncellen; PGP 9.5 kleuring fungeert als een aanvulling op calretinin kleuring, vooral in geval van geïsoleerde hypoganglionosis. De dubbele kleuring met S100 en PGP 9.5 kan het vals-negatieve tarief verminderen en de gevoeligheid verhogen. Als voorwaarde, de huidige studie is gericht op een adequate specificiteit en hoge gevoeligheid van deze nieuwe diagnostische methode te waarborgen. Onze nieuwe protocol gebruikt alle drie de markers voor de discriminatie van aganglionic darm en hypertrofische zenuwvezels. Een prospectieve studie van 318 kinderen werd uitgevoerd door ons lab en eerder gepubliceerd zonder een gedetailleerd protocol7. Het gedetailleerde protocol en de voorzorgsmaatregelen worden besproken in dit artikel. Elke pasgeborenen die leed aan een ernstige ontlasting probleem sinds de geboorte of kinderen met chronische constipatie met uitzondering van andere gemeenschappelijke ziekten zijn potentiële kandidaten voor rectale zuig biopsie (RSB). Onze nieuwe protocol is geschikt voor het bevlekken van niet alleen RSBs, maar ook full-dikte biopten of chirurgische specimens om een definitieve diagnose te stellen.

<table><tbody><tr><td>calretinin antibody</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MAB-0716 170416405c</td><td>antibody: primaire antilichaam</td></tr><tr><td>S-100 antibody</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>Kit-0007</td><td>antibody: primaire antilichaam</td></tr><tr><td>PGP9.5 antibody</td><td>Shanghai long island antibody Co. Ltd</td><td>R-0457-03</td><td>antibody: primaire antilichaam</td></tr><tr><td>versterker reagens</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-A 170416405a</td><td>antibody: secundair antilichaam A</td></tr><tr><td>Geiten anti-konijn/muis IgG secundair antilichaam</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-B</td><td>antibody: secundair antilichaam B</td></tr><tr><td>DAB kleuringskit (bevat reagens A B en C)</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>DAB-0031</td><td>kleuringskit</td></tr><tr><td>Hitte-incubator</td><td>Shanghai yiheng instrument Co. Ltd</td><td>DHP-9082</td><td>instrument</td></tr><tr><td>Rbi2 zuig rectale biopsie systeem</td><td>Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australië</td><td>CP1200 HP1000 SS1000</td><td>instrument</td></tr><tr><td>microtoom</td><td>Leica</td><td>leica RM2016</td><td>instrument</td></tr><tr><td>citroenzuur natriumcitraat buffer (100X)</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MVS-0101</td><td>antigen retrievaal buffer</td></tr><tr><td>pathologische weefsel ontwateringsapparaat</td><td>Wuhan junjie electronic Co. Ltd</td><td>JT-12F</td><td>instrument</td></tr></tbody></table>

diagnose van de ziekte van hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor calretinin, s100 proteïne en eiwit gen product 9,5

Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

De ziekte van Hirschsprung (HD) is een aangeboren darmziekte die klinisch manifesteert zich als een onvermogen om meconium door te geven bij zuigelingen of als langdurige constipatie bij kinderen. Rectale zuig biopsie (RSB) om de afwezigheid van ganglioncellen en neurale hypertrofie te bepalen is de meest accurate test voor de diagnose van HD op dit moment. Traditionele hematoxyline-eosine kleuring ontbreekt gevoeligheid en specificiteit. Acetylcholinesterase kleuring kan niet op grote schaal worden gebruikt vanwege zijn complexe proces. Onze nieuwe protocol van immunokleuring voor calretinin, S100 Protein, en Protein Gene product 9,5 (PGP 9.5), die we uitgevoerd op RSBs, vertoont hoge gevoeligheid en specificiteit van 96,49% (95% betrouwbaarheidsinterval, 0.88-0.99) en 100% (95% vertrouwen interval, 0.97-1.00), respectievelijk. De HD-getroffen segmenten vaak aanwezig als de afwezigheid van de expressie van calretinin, S100 Protein, en PGP 9.5, die markers van neurale hypertrofie in de submucosale weefsel. Dit protocol beschrijft het gedetailleerde werkproces van deze nieuwe diagnostische methode.

In totaal werden 318 patiënten ingeschreven in onze studie. Alle patiënten onderging RSB, en de weefsels werden gekleurd voor calretinin, S100, en PGP 9.5. De diagnose op basis van onze nieuwe protocol was HD in 97 gevallen, niet-HD in 213 gevallen, en vermoed HD in 8 gevallen. Onder de 132 chirurgische patiënten, 99 patiënten werden gediagnosticeerd met HD door immunokleuring van volledige dikte specimens na de operatie. S100 en PGP 9.5 kleuring bleek dat 92% en 93% van de 99 patiënten, ...

Dit protocol beschrijft het proces van immunokleuring rectale zuig biopten voor calretinin, S100 proteïne, en proteïne gen product 9,5. Deze nieuwe adjuvante diagnostische methode voor de ziekte van Hirschsprung heeft de voorkeur gevoeligheid en specificiteit tarieven.

Diagnose van de ziekte van Hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor Calretinin, S100 proteïne en eiwit gen product 9,5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen bij de diagnose van de ziekte van Hirschsprung. De methode en functies van deze techniek, als je protocol volgt, vertoont een hoge gevoeligheid en de specificiteit tarieven die proces op hetzelfde moment. Het aantonen van de procedure zal Mijing Fang zijn, een technicus van mijn laboratorium.Begin met het bevestigen van de rectale zuigbiopsieën in vijf keer het volume van het weefsel in 4% paraformaldehyde gedurende zes uur bij kamertemperatuur. Dehydrateer de vaste weefsels in een pathologische weefseldehydrator gedurende 11 uur en verdun de verwerkte rectale zuigbiopsieweefsels in paraffineblokken. Trim de blokken op een microtome tot een volledig sectievlak van het weefsel wordt blootgesteld.Gebruik vervolgens de microtome om een 0,4 micrometer secties van het ingebedde weefsel te verkrijgen. Plaats in 45 tot 50 graden Celsius water om de secties te verspreiden in een vlak plan. Breng de afgeplatte secties op glazen platen en bak ze in een 60 graden Celsius oven voor drie tot vijf uur.Plaats de gedeparaffiniseerde dia's in twee 15 minuten durende veranderingen van xyleen, gevolgd door hun hydratatie in opeenvolgende vijf minuten ethanol onderdompees. Spoel vervolgens de glijbanen in omgekeerde osmose gezuiverd water voor een extra vijf minuten. Voor antigeen ophalen, plaats de glijbanen in een Coplin kleurpot van retrieval oplossing en plaats de pot in een voorverwarmd bad van kokend water.Laat de pot na 20 minuten ongeveer 10 minuten afkoelen tot kamertemperatuur en spoel de glijbanen voorzichtig af met PBS. Gebruik vervolgens een hydrofobe marker om elke weefselsectie te omsingelen en de glijbanen in een natte doos te plaatsen. Om eventuele peroxidaties te blokkeren, voeg twee of drie druppels van 3% waterstofperoxide oplossing op elk weefsel en plaats de dia's op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.Aan het einde van de incubatie, spoel de dia's met drie vijf minuten PBS wast, gevolgd door het blokkeren met 5% runder serum albumine gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius. Gooi vervolgens het overtollige runderserum albumine weg en label de cellen met 50 microliter van het primaire antilichaam van belang bij 4 graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, spoel de dia's met drie drie minuten wasbeurten in PBS en voeg 50 microliters van polymeer versterker aan elke dia.Na 20 minuten bij 37 graden Celsius, was de dia's drie keer in PBS en voeg 50 microliter secundaire antilichaam B aan elke weefselsectie. Na 30 minuten bij 37 graden Celsius spoel je de secties af met drie wasbeurten van vijf minuten in PBS en voeg je een druppel vers bereide DAB-werkoplossing toe aan elke dia. Wanneer het juiste niveau van bruine vlekken wordt gedetecteerd door lichte microscopie, spoel de dia's in PBS gedurende vijf minuten en tegen vlek de kernen met een druppel hematoxylin gedurende een minuut.Verwijder de overtollige vlek onder een straaltje water gedurende ongeveer 30 tot 40 seconden, gevolgd door een 25 tot 30 seconden wassen in verse PBS. Onderscheid de weefsels in 1%zoutzuur ethanol gedurende 10 seconden, gevolgd door een PBS-wasbeurt van één minuut. Dehydrateer de dia's met vijf minuten onderdompeinaties in de omgekeerde volgorde van hydratatie en stel de dia's bloot aan twee veranderingen van xyleen van vijf minuten.Monteer vervolgens de cover slip met behulp van ultra-schone montage en laat de dia's te drogen voordat hun visualisatie op een lichtmicroscoop. In deze representatieve studie van 318 rectale sectie biopsie patiënten, 99 patiënten werden in eerste instantie gediagnosticeerd door rectale sectie biopsie. Veel ganglion cellen die calretinine uitdrukken werden waargenomen in normale weefselbiopten.Er werden echter geen ganglioncellen gedetecteerd in enig gebied van het weefsel uit de ziektesegmenten van de Hirschsprung. S-100 en PGP9.5 immunostaining onthulden hypertrofie zenuwstammen in de submucosa van het zieke weefsel met slechts korrelige vlekken van enkele kleine zenuwtakjes waargenomen in de normaal binnenverdende darm. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om aandacht te besteden aan details zoals de grootte van rectale zuigbiopsieën en dikte van secties.Nadat het is gedefragmenteerd, zal deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoeken op het gebied van pediatrische chirurgie ter ondersteuning van een diagnose van de ziekte van Hirschsprung.

diagnosis-hirschsprung-s-disease-immunostaining-rectal-suction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the assessment of chemical-induced colitis via immunohistochemical staining of mouse colon tissue. In a stained tissue section, the presence of a large number of immune-responsive cells in the damaged tissue represents the infiltration of immune cells during colitis.

Assessment of Chemical-Induced Colitis via Immunohistochemical Analysis of Colon Tissue Sections

This video demonstrates the immunohistochemical staining for S-100 protein in rectal suction biopsy sections. Antigen-retrieved sections are blocked and treated with primary, followed by secondary antibodies against S-100, a marker of Hirschsprung's disease. Chromogenic substrate is added to stain the targeted cells. Samples are dehydrated and mounted before visualizing under the microscope.

Immunohistochemical Staining of S-100 Protein in Human Rectal Suction Biopsy Sections

Source: Ear, P. H., et. al. Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the immunofluorescence staining of small bowel neuroendocrine tumor spheroids. The spheroids are fixed, permeabilized, and blocked and are then incubated with primary and secondary antibodies. A dye is added to stain nuclei before mounting and visualizing them under a fluorescent microscope.

Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids Using Immunofluorescence

We presenteren een ex vivo celmigratie analyse die exacte kwantificering van enterische neurale celmigratie potentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren maakt.

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Het enterische zenuwstelsel wordt gevormd door neurale crestcellen die zich vermenigvuldigen, migreren en het darmkanaal koloniseren. Neurale crestcellen differentiëren zich in neuronen met markers die specifiek zijn voor hun neurotransmitterfenotype. Dit protocol beschrijft een techniek voor het dissekeren, fixeren en immunokleuring van het muis embryonale gastro-intestinale kanaal om de expressie van enterische zenuwstelsel neurotransmitters te visualiseren.

Immunokleuring om Murine Enteric Nervous System Development Visualiseer

We rapporteren significante verbeteringen voor de reproduceerbare meting van somatische colonische stamcelmutaties na blootstelling van muizen aan potentieel DNA-beschadigende stoffen.

Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties

Dit protocol beschrijft de methode voor het opstellen van een rattenmodel van pouchitis. Het ileumpouch-model is gemaakt door ileumpouch-anale anastomose (IPAA) chirurgie uit te voeren met behulp van microchirurgische technieken. Na de operatie werd de rat gedurende 4 dagen behandeld met 4% dextraansulfaatnatrium (DSS).

Een rattenmodel van pouchitis na proctocolectomie en ileale pouch-anale anastomose met behulp van dextransulfaatnatrium

Aptameren zijn korte ribo-/deoxyribo-oligonucleotides geselecteerd...

Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer

Een demonstratie van de fabricage en het gebruik van een extracellulair zuigkracht elektrode gebruikt om de elektrofysiologische opnamen van neonatale knaagdieren ruggenmerg te...

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

Hier beschrijven een werkwijze om direct zichtbaar microregional weefselhypoxie in de muis...

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

Leer een betrouwbaar immunokleuringprotocol voor rectale zuigbiopten om de ziekte van Hirschsprung te diagnosticeren. Deze methode detecteert calretinine, S100 en PGP9.5 met hoge sensitiviteit.

Diagnose van de ziekte van Hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor Calretinin, S100 proteïne en eiwit gen product 9,5 (Video) | JoVE Journal

Diagnose van de ziekte van Hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor Calretinin, S100 proteïne en eiwit gen product 9,5

Meer video's verkennen