Keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën

Anorganisch polyfosfaat is een belangrijk element in bacteriële stressrespons. Maar oudere methoden voor het extraheren en meten van poliep in bacteriën zijn complex en arbeidsintensief. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snelle, gevoelige en goedkope kwantificering van polyP-niveaus in een verscheidenheid van verschillende bacteriële soorten mogelijk maakt.

De procedure zal worden aangetoond door Arya Pokhrel, een student van mijn laboratorium. Om te beginnen, groeien lactobacillus reuteri bacteriën in malic enzym inductie medium zonder cystine op 37 graden Celsius 's nachts zonder te schudden. Centrifuge een milliliter van deze nachtelijke cultuur in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis om genoeg cellen te oogsten om een totaal van 50 tot 100 microgram cellulair eiwit opleveren.

Verwijder de supernatant volledig uit de celpellet en voeg vervolgens 250 microliters GITC lyse buffer toe en opnieuw te besteden door vortexing. Incubeer bij 95 graden celsius gedurende 10 minuten om de cellen te lyse. Bewaar het lysaat op 80 graden Celsius.

Bereid eerst BSA-normen voor die nul, 1, 2 en 4 milligram bsa-buffer bevatten. Aliquot vijf microliters van ontdooide, goed gemengde cel lysates en vijf microliter van BSA normen om putten te scheiden in een duidelijke 96 put plaat. Voeg 195 microliters van Bradford reagens toe aan elke put en meet absorptie op 595 nanometer in een plaatlezer.

Bereken de hoeveelheid eiwit in elke put in vergelijking met de BSA-standaardcurve zoals beschreven in het manuscript. Vermenigvuldig de resulterende waarde met 05 om de totale hoeveelheid eiwit in elk monster te bepalen. Om te beginnen met polyfosfaat extractie, voeg 250 microliter van 95% ethanol aan elk GITC lysed monster, en vortex te mengen.

Pipette dit mengsel om een silica membraan spin kolom geplaatst in een 1,5 milliliter centrifuge buis. Centrifuge op 16, 100 g gedurende 30 seconden. Gooi de stroom door en voeg 750 microliter van het tris-hydrochloride, natriumchloride, EDTA en ethanolmengsel toe.

Centrifuge op 16, 100 gs gedurende 30 seconden. Gooi de stroom door en centrifugeren de spin kolom op 16, 100 gs gedurende twee minuten. Plaats de kolom in een schone 1,5 milliliter microfuge buis.

Voeg 150 microliter van 50 millimolar pH acht tris-hydrochloride toe en broed vijf minuten op kamertemperatuur. Elute polyP door twee minuten op 8.000 g te centrifugeren. Begin met het opstellen van normen die nul, vijf, 50 of 200 micromolar kaliumfosfaat bevatten in 50 millimolar pH acht tris-hydrochloride.

Aliquot 100 microliter van elke fosfaatnorm en 100 microliter van geëxtraheerde polyP monsters in afzonderlijke putten van een duidelijke 96 putplaat. Bereid een master mix met, per monster, 30 microliters van 5X ScPPX reactiebuffer, 19 microliters water, en een microliter van gezuiverde ScPPX. Voeg 50 microliter van de master mix aan elke put van de 96 put plaat.

En incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Op de dag van detectie, bereid een verse werkvoorraad van detectie-oplossing door het mengen op 9,12 milliliter detectie oplossing basis met 88 milliliter van een molaire ascorbine zuur, en laat het op kamertemperatuur komen voor gebruik. Voeg 50 microliter detectieoplossing toe aan elk monster en standaarden in de 96 putplaat.

Om kleurontwikkeling mogelijk te maken, ontcunooit de plaat bij kamertemperatuur gedurende ongeveer twee minuten. Gebruik een plaatlezer om de absorptie op 882 nanometer te meten en de fosfaatconcentratie van elk monster te berekenen in vergelijking met de kaliumfosfaatnormcurve. Zet vervolgens de fosfaatconcentraties om in nanomol van polyP-afgeleid fosfaat in elk cellysaat en normaliseer cellulaire polyP-gehalte naar het totale cellulaire eiwit, zoals beschreven in het manuscript.

Wild-type E.coli, een gram-negatieve bacterie, geteeld in LB geproduceerd geen polyP. Maar wanneer geteeld in MOPS, geproduceerd ongeveer 192 nanomolen polyP per milligram van het totale eiwit. Een E.coli delta ppk mutant, die polyP kinase mist, produceerde geen polyP in beide medium.

Een delta ppx mutant, die exopolyfotase mist, produceerde ongeveer dezelfde hoeveelheid polyP als het wilde type. En de delta phoB mutant, die defect is in fosfaattransport, produceerde aanzienlijk minder polyP dan het wilde type. Wild-type L.reuteri, een gram-positieve bacterie die 's nachts in meic medium wordt gekweekt, verzamelde ongeveer 51 nanomol per milligram totaal eiwit.

Een L.reuteri ppk1 null mutant met polyP kinase bevatte minder dan de helft van dit bedrag. Deze aanwezigheid van polyP in de ppk1 null mutant is waarschijnlijk te wijten aan L.reuteri met een tweede polyP kinase. Mycobacterium smegmatis stam SMR vijf, geteeld in Hartmans-de Bont medium bij afwezigheid van ethanol verzameld ongeveer 141 nanomolen polyP per milligram totaal eiwit.

Terwijl ethanol behandeling resulteerde in een drievoudige toename. Na deze procedure kan acrylamide gel elektroforese worden uitgevoerd om verschillen in polyP-ketenlengte te beoordelen. Tijdens het proberen van deze procedure, vermijd gemeenschappelijke fouten.

Vergeet niet om te voorkomen dat het krijgen van bellen in microtiter plaat putten, en wees voorzichtig om uw monsters over te dragen aan de juiste buis bij het overschakelen van de kolom naar de microfuge buis. Vergeet niet dat het werken met GITC en sterke zuren gevaarlijk kan zijn, en de juiste beschermingsmiddelen moeten altijd worden gedragen tijdens het uitvoeren van deze procedure.