Name: Keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Leer een snelle methode voor kwantificering van anorganisch polyfosfaat in bacteriën. Deze techniek is geschikt voor Gram-negatieve, Gram-positieve en mycobacteriële soorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door de Universiteit van Alabama in Birmingham departement microbiologie opstarten middelen en NIH grant R35GM124590 (naar MJG) en NIH subsidie R01AI121364 (FW).

1. het zuiveren van gist Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>Transformeer de E. coli eiwit overexpressie stam BL21(DE3)31 met plasmide pScPPX26 door electroporation32 of33van de chemisch te worden verwerkt.</li>
	<li>Inoculeer 1 L lysogenie Bouillon (LB) met 100 µg mL-1 ampicilline in een unbaffled kolf van 2 L met een één kolonie van BL21(DE3) met pScPPX2 en incubeer 's nachts bij 37 ° C zonder schudden, aan een absorptie bij 600 nm (een600) van ongeveer 0,3, uitgedrukt in een spectrofotometer.</li>
	<li>Start van de cultuur (180 rpm) schudden en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, gedurende welke tijd de cellen tot een A600 van 0,4 toenemen zal - 0,5.</li>
	<li>Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toevoegen om een eindconcentratie van 1 mM en een extra 100 µg mL-1 ampicilline en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C met schudden bij 180 t/min. Opmerking: Dit protocol overexpressie genereert een grote hoeveelheid oplosbare ScPPX. Echter ScPPX overexpressie is zeer vergevingsgezind, en een verscheidenheid van andere gemeenschappelijke overexpressie EiwitProtocollen zijn gebruikt om met succes het zuiveren van ScPPX.</li>
	<li>De cellen overbrengen in een fles 1 L centrifuge en oogst ze door centrifugeren gedurende 20 minuten bij 5000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en de cel pellet overbrengen in een conische tube van 50 mL. Opmerking: Cel pellets kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij-80 ° C.</li>
	<li>De pellet op ijs ontdooien, dan het resuspendeer in 9 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl en 5 mM imidazool (pH 8) voor een totaal volume van ongeveer 10 mL.</li>
	<li>(Eindconcentraties) 1 mg lysozyme-1 mL, 2 mM MgCl2en 50 eenheden mL-1 voor een RNA - en DNA-vernederende endonuclease toevoegen (Zie Tabel van materialen) en incubeer gedurende 30 min op ijs. Opmerking: ScPPX bindt nucleic zuren (gegevens niet worden weergegeven), zodat de nuclease behandeling is van essentieel belang tijdens het zuiveringsproces ongehinderd.</li>
	<li>Met behulp van een ultrasoonapparaat met een microtip (Zie Tabel of Materials), lyse de cellen door 2 cycli van ultrasoonapparaat op ijs op 50% kracht, pulserende 5 s op en 5 s af, met een 2 min rust tussen de cycli. Opmerking: Gebruik juiste gehoorbescherming tijdens ultrasoonapparaat. Ook het geval met overexpressie, een scala aan cellysis methodes zijn aanvaardbaar voor de zuivering van de ScPPX.</li>
	<li>Verwijderen van de onoplosbare puin door centrifugeren de lysate gedurende 20 minuten bij 20.000 x g bij 4 ° C. Filtreer het resulterende supernatant (ongeveer 10 mL) door een 0.8 µm porie-grootte celluloseacetaat spuit-filter.</li>
	<li>Laden de lysate op een chelaat kolom nikkel-betalen 5 mL (Zie Tabel van materialen) gebruik een peristaltische pomp of een grote injectiespuit.</li>
	<li>Spoel de kolom met 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazool (pH 8).</li>
	<li>Spoel de kolom met 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazool (pH 8).</li>
	<li>Elueer ScPPX met 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl en 0.5 M imidazool (pH 8), verzamelen 15 1 mL breuken. Test deze elutie breuken voor eiwit genoegen nemen met de Bradford eiwit assay34 (Zie Tabel van materialen) en uitvoeren van een SDS-pagina gel35 om te bevestigen welke breuken bevatten gezuiverde ScPPX (moleculair gewicht = 45 kDa).</li>
	<li>Zwembad de breuken met pure ScPPX en aanpassen van de concentratie van de gebundelde proteïne tot ongeveer 2 mg mL-1 met 50 mM HEPES en 0.5 M NaCl. Hogere eiwit concentraties kunnen neerslaan in de volgende stap.</li>
	<li>Wisselen de gezuiverde ScPPX in opslag buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, 10% [v/v] glycerol) door dialyse. Plaats van gebundelde ScPPX breuken in een verzegelde lengte van 12.000-14.000 Da molecuulgewicht cutoff dialyse membraan buizen (Zie Tabel van materialen) en schorten in 1 L voor opslag buffer met continu roeren bij 4 ° C voor ten minste 4 h. Herhaal deze stap met verse de buffer van de opslag voor een totaal van 3 buffer veranderingen.</li>
	<li>De gezuiverde, dialyzed eiwit overbrengen in een centrifugebuis of buizen en Centrifugeer gedurende 20 min bij 20.000 x g bij 4 ° C tot het verwijderen van eventuele onoplosbare aggregaten. Zorgvuldig overbrengen in het supernatant een schone 15 mL conische buis.</li>
	<li>Aanpassen van de concentratie van het gezuiverde ScPPX naar 1 mg mL-1 met opslag buffer, toevoegen van 0,1% (g/v) protease-vrije bovien serumalbumine (BSA; eindconcentratie), en de opslag voor maximaal 6 maanden bij 4 ° C. Opmerking: ScPPX verliest meer dan 90% van haar activiteit wanneer het bevroren13.</li>
</ol>2. oogsten monsters voor polyfosfaat extractie
<ol><li>Groeien bacteriën onder de voorwaarden van belang voor het bepalen van de inhoud van de poliep. Voor dit protocol, Lactobacillus reuteri36 's nachts bij 37 ° C te groeien zonder schudden in malic enzym inductie (MEI) middellange37 zonder cysteïne (MEI-C).</li>
	<li>Oogst voldoende cellen door centrifugeren in een tube microcentrifuge 1,5 mL 50 – 100 µg cellulaire eiwit optellen (zie stap 3 hieronder). Voor E. coli, is dit 1 mL van een logboek fase cultuur op een A-600 van 0,2 - 0,4. Voor L. reuteriis dit 1 mL van een overnachting cultuur. Pas zo nodig voor andere soorten van belang.</li>
	<li>Verwijder het supernatant volledig uit de cel pellets.</li>
	<li>Resuspendeer de cel pellets in 250 µL van GITC lysis buffer (4 M guanidine isothiocyanaat, 50 mM Tris-HCl, pH 7) en lyse door incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min. winkel lysates bij-80 ° C. Opmerking: Verenigbaar met de lysis van de tijd, omdat uitgebreide broedtijd bij hoge temperatuur leiden aantasting van de poliep door hydrolyse38 tot kan. Lysates kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij-80 ° C. Let op: Guanidine isothiocyanaat is een chaotropic-zout en moet worden behandeld met handschoenen en afgevoerd als gevaarlijk afval.</li>
</ol>3. meten van het eiwitgehalte van cel Lysates
<ol><li>Bereiden BSA normen met 0, 0.1, 0.2 en 0.4 mg mL-1 van BSA in GITC lysis-buffermengsel. Opmerking: Het is belangrijk om de BSA-normen in GITC, want GITC de ontwikkeling van de kleur van de analyse van Bradford beïnvloedt. BSA normen kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	<li>Aliquot 5 µL van ontdooide, goed gemengde cel lysates en BSA normen te scheiden van putten in een duidelijk 96-wells-plaat.</li>
	<li>195 µL van Bradford reagens34 toevoegen aan elk putje en meten van de absorptie bij 595 nm (een595) in een afleesapparaat (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Berekenen van de hoeveelheid eiwit in elk putje door vergelijking met de standaard curve van de BSA, met behulp van de formule y = mx + b, waarbij y is een595, x µg BSA, m is de helling van de standaard curve, en b is het y-snijpunt van de standaard curve. De resulterende waarde met 0.05 om te bepalen van de totale mg van eiwitten in elk monster vermenigvuldigen.</li>
</ol>4. wordt uitgepakt polyfosfaat
<ol><li>Voeg toe 250 µL ethanol 95% aan elke steekproef lysed van GITC en vortex te mengen.</li>
	<li>Dat mengsel toepassen in een silica membraan spin kolom en centrifuge voor 30 s bij 16.100 x g.</li>
	<li>Gooi de doorstroming, dan Voeg 750 µL van 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% ethanol en centrifuge voor 30 s bij 16.100 x g.</li>
	<li>De doorstroming en Centrifugeer gedurende 2 min bij 16.100 x g negeren.</li>
	<li>Plaats van de kolom in een schone 1,5 mL microfuge buis en voeg 150 µL van 50 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, dan poliep Elueer door gedurende 2 minuten bij 8.000 x g centrifugeren. Opmerking: Indien gewenst, de eluaten kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 1 week.</li>
</ol>5. verteren polyfosfaat
<ol><li>Met 0, 5, 50 of 200 µM kalium fosfaat in 50 mM Tris-HCl (pH 8) normen voor te bereiden. Opmerking: Kalium fosfaat normen kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Aliquot 100 µL van elke standaard fosfaat en uitgepakt poliep monsters in aparte putjes van een duidelijk 96-wells-plaat.</li>
	<li>Voorbereiding van een master mix met (per monster): 30 µL van 5 x ScPPX reactie-buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2250 mM ammoniumacetaat, pH 7.5)13, 19 µL van H2O en 1 µL van gezuiverde ScPPX (1 mg mL-1).</li>
	<li>Voeg 50 µL van de master mix aan elk putje van de 96-wells-plaat. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Opmerking: Indien gewenst, het verteerd poliep monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor onbepaalde tijd.</li>
</ol>6. opsporen van gratis fosfaat24
<ol><li>Bereid detectie oplossing basis door ontbinding 0,185 g van antimoon kaliumtartraat in 200 mL water, dus het toevoegen van 150 mL 4 N H24, vervolgens toe te voegen 1,49 g van ammoniumnitraat heptamolybdate. Roer om los en breng tot een eindvolume van 456 mL. Filtreer de oplossing voor het verwijderen van deeltjes en opslaan beschermd tegen licht bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	<li>Voorbereiden van een stamoplossing van 1 M ascorbinezuur. Winkel beschermd tegen licht bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	<li>Bereid een verse voorraad van de werken van detectie oplossing elke dag door het mengen van detectie basis 9.12 mL met 0.88 mL 1 M ascorbinezuur. Toestaan dat de detectie-oplossing om te komen tot kamertemperatuur vóór gebruik.</li>
	<li>50 µL van detectie oplossing toevoegen aan elk monster en de standaard in de 96-wells-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 2 minuten om ontwikkeling van de kleur.</li>
	<li>Meten van de absorptie bij 882 nm met een afleesapparaat en bereken de concentratie van de fosfaat van elk monster in vergelijking tot de kalium fosfaat standaard curve. Let op: De detectie-oplossing bevat giftige zouten en sterke zuren. Draag handschoenen en behandelen van overtollige oplossing als giftig afval.</li>
</ol>7. berekening van de cellulaire polyfosfaat inhoud
<ol><li>Converteren van de concentraties van de fosfaat bepaald in stap 6.5 aan nanomoles van de poliep afkomstige fosfaat in elke hele cel lysate volgens de volgende formule: nmol poliep = 1.5 x (µM fosfaat / 10) Opmerking: De standaard curve gebaseerde methode in stap 6, bepaalt de concentratie van fosfaat (in µM) in elk 100 µL poliep monster aliquoted in stap 5.2. Deze concentratie om om te zetten een aantal nmol, 100 µL wordt gedeeld door 106 te geven van een volume in L, vermenigvuldigd met de concentratie (µmol L-1) en vervolgens vermenigvuldigd met 1.000 (het aantal nmol in een µmol). Dit reduceert tot de concentratie te delen door 10. Het volume van de totale extract bereid in stap 4 is 150 µL, dus het is noodzakelijk om te vermenigvuldigen de resulterende waarde met 1,5 voor de berekening van de nmol van fosfaat aanwezig in het hele extract.</li>
	<li>Normaliseren cellulaire poliep inhoud aan totale cellulaire eiwit door nmol poliep te delen door de totale proteïne van mg in elk monster bepaald in stap 3.4. Poliep niveaus zijn uitgedrukt in termen van de concentratie van individuele poliep afkomstige gratis fosfaat. Opmerking: In sommige gevallen kan het bedrag van de poliep afkomstige fosfaat aanwezig in een monster vallen buiten het lineaire bereik van de standaard curve van fosfaat (stap 6.5). Als de niveaus van de poliep erg hoog zijn, kan het overtollige poliep-bevattende eluaat uit stap 4.6 verdunde 1:10 of 1:100, als dit nodig is, en vervolgens gemeten opnieuw zoals beschreven in stappen 5 t/m 7.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hier beschreven vereenvoudigt en versnelt de kwantificering van de poliep niveaus in diverse bacteriën, met een typische set 24 monsters nemen ongeveer 1,5 h volledig verwerken. Dit maakt snelle screening van monsters en analyse van de mutant Bibliotheken, en vereenvoudigt de kinetische experimenten voor het meten van de accumulatie van poliep na verloop van tijd. We hebben aangetoond dat het protocol effectief op vertegenwoordigers van drie verschillende stammen werkt: proteobacteria, firmicutes, en Straalz...

Anorganische polyfosfaat (poliep) is een lineaire biopolymeer van phosphoanhydride-linked fosfaat eenheden die wordt gevonden in alle domeinen van het leven1,2,3. In diverse bacteriën is poliep essentieel voor de stressrespons, beweeglijkheid, vorming van biofilms, celcyclus controle, antibioticaresistentie en virulentie4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studies van de poliep metabolisme in bacteriën dus het potentieel hebben om opbrengst fundamentele inzichten in het vermogen van bacteriën om te leiden tot ziekte en gedijen in uiteenlopende omgevingen. In veel gevallen zijn de methoden die beschikbaar zijn voor de kwantificering van de poliep in bacteriële cellen echter een beperkende factor in deze studies.
Er zijn verschillende methoden die momenteel gebruikt voor het meten van de poliep in biologische materialen. Deze methoden zijn gewoonlijk twee afzonderlijke stappen: uitpakken van de poliep en kwantificeren van de poliep presenteren in deze extracten. De huidige methode van de goudstandaard, ontwikkeld voor de gist Saccharomyces cerevisiae door Bru en collega's12, extracten poliep samen met DNA en RNA met behulp van fenol en chloroform, gevolgd door ethanol neerslag, behandeling met deoxyribonuclease (DNase) en ribonuclease (RNase), en de spijsvertering van de resulterende gezuiverde poliep met de S. cerevisiae poliep-vernederende enzym exopolyphosphatase (ScPPX)13 opbrengst gratis fosfaat, dat vervolgens wordt gekwantificeerd met behulp van een Malachiet groen-gebaseerd colorimetrische bepaling. Deze procedure is zeer kwantitatieve maar arbeidsintensief, beperking van het aantal monsters dat kan worden verwerkt in een één experiment, en is niet geoptimaliseerd voor bacteriële monsters. Anderen hebben gemeld poliep extraheren uit een verscheidenheid van cellen en weefsels met behulp van silica kralen ("glassmilk") of silica membraan kolommen6,14,15,16,17, 18. Deze methoden doen niet efficiënt uitgepakt korte keten poliep (minder dan 60 fosfaat eenheden)12,14,15, hoewel dit van minder belang voor bacteriën, die over het algemeen gedacht zijn te synthetiseren voornamelijk lange-keten poliep3. Oudere methoden van poliep extractie met behulp van sterke zuren19,20 zijn niet langer gebruikte, omdat de poliep is onstabiel onder zure omstandigheden12.
Er zijn ook een aantal gerapporteerde manieren om quantifying poliep. Onder de meest voorkomende is 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), een fluorescente kleurstof meer meestal gebruikt om de vlekken van DNA. DAPI-polyP complexen hebben verschillende fluorescentie excitatie en emissie-maxima dan DAPI-DNA complexen21,22, maar er is aanzienlijke inmenging van andere cellulaire componenten, met inbegrip van RNA, nucleotiden en inositol fosfaten12,15,16,23, vermindering van de specificiteit en de gevoeligheid van de poliep metingen die worden uitgevoerd met behulp van deze methode. U kunt ook poliep en adenosinedifosfaat (ADP) kunnen worden omgezet in adenosine trifosfaat (ATP) met behulp van gezuiverde Escherichia coli poliep kinase (PPK) en de resulterende ATP gekwantificeerd aan de hand van luciferase14,17 ,18. Dit maakt de de ontdekking van zeer kleine hoeveelheden van de poliep, maar vereist twee stappen van de enzymatische reactie en zowel luciferine en zeer zuiver ADP, die dure reagentia. ScPPX specifiek verteert poliep in gratis fosfaat6,12,13,24, die kan worden opgespoord met behulp van de eenvoudiger methoden, maar ScPPX wordt geremd door DNA en RNA12, noodzakelijk DNase en RNase behandelingvan poliep-bevattende extracten. Noch PPK en ScPPX niet commercieel beschikbaar, en PPK zuivering is relatief complexe25,26.
Poliep in cel lysates of uittreksels kan ook worden gevisualiseerd op polyacrylamide gels door DAPI negatieve kleuring27,28,29,30, een methode die beoordeling van ketenlengte wel toegestaan, maar is lage-doorvoer en slecht kwantitatieve.
Nu melden we een snelle, goedkope en middellange-doorvoer poliep assay waarmee snelle kwantificering van de poliep niveaus in verschillende bacteriesoorten. Deze methode begint met het lysing van bacteriële cellen bij 95 ° C in 4 M guanidine isothiocyanaat (GITC)14 om de inactivering van cellulaire fosfatasen genaamd, gevolgd door een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters. Het resulterende poliep-bevattende extract wordt dan met een grote overmaat van ScPPX, eliminerend de behoefte aan DNase en RNase behandeling verteerd. We nemen een protocol voor eenvoudige nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden ScPPX. Ten slotte is de poliep afkomstige gratis fosfaat gekwantificeerd met een eenvoudige, gevoelige, ascorbinezuur-based colorimetrische bepaling24 en genormaliseerd naar totale cellulaire eiwit. Deze methode stroomlijnt de meting van de poliep in bacteriële cellen, en wij tonen het gebruik ervan met de representatieve soorten van gram-negatieve bacteriën, gram-positieve bacteriën en mycobacteriën.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>plasmid pScPPX2</td><td>Addgene</td><td>112877</td><td>beschikbaar voor academische en andere non-profitinstellingen</td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-2</td><td>E. coli groeimedium</td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176025</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-400-1</td><td></td></tr><tr><td>kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250500</td><td>voor het aanpassen van de pH van HEPES-gebufferde oplossingen</td></tr><tr><td>natriumchloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>imidazool</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196500</td><td></td></tr><tr><td>lysozym</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6070106</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumchloride (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Universal Nuclease</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88700</td><td>Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is een acceptabel alternatief</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-120</td><td>andere cellysismethoden (bijv. French Press) kunnen ook effectief zijn</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap chelating HP kolom</td><td>GE Life Sciences</td><td>17040901</td><td>elke nikkel-affiniteitschromatografie kolom of hars kan worden vervangen</td></tr><tr><td>nikkel(II) sulfaat hexahydraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC415611000</td><td>voor het opladen van de HiTrap kolom</td></tr><tr><td>0,8 &micro;m poriëngrootte cellulose acetaat spuitfilters</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-302-168</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagens</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp;Spectra/Por 4 RC Dialyse Membraanbuisjes 12.000 tot 14.000 Dalton MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667B</td><td>andere dialysemembranen met MWCO & lt; 30.000 Da zouden ook moeten werken</td></tr><tr><td>zoutezuur (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>voor het aanpassen van de pH van Tris-gebufferde oplossingen</td></tr><tr><td>kaliumchloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217500</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2294</td><td></td></tr><tr><td>10x MOPS medium mengsel</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td>E. coli groeimedium</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D161</td><td></td></tr><tr><td>monobasisch kaliumfosfaat (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>dibasisch kaliumfosfaat (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>gedehydrateerd gistextract</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0</td><td></td></tr><tr><td>trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-50</td><td></td></tr><tr><td>mangansulfaat monohydraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M113-500</td><td></td></tr><tr><td>guanidine isothiocyanate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP221-250</td><td></td></tr><tr><td>runde serum albumine (proteasevrij)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>heldere vlakke bodem 96-well platen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812-100EA</td><td>elke heldere 96-well plaat zal werken</td></tr><tr><td>Tecan M1000 Infinite plate reader</td><td>Tecan, Inc.</td><td>niet van toepassing</td><td>elke plate reader die in staat is om de absorptie te meten bij 595 en 882 nm zal werken</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>silica membraan spin kolommen</td><td>Epoch Life Science</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL microfuge buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9580154</td><td></td></tr><tr><td>ammoniumacetaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>antimoonkaliumtartraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1088922</td><td></td></tr><tr><td>4 N zwavelzuur (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA818-500</td><td></td></tr><tr><td>ammoniumheptamolybdaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1376630</td><td></td></tr><tr><td>ascorbinezuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC401471000</td><td></td></tr></tbody></table>

keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Anorganische polyfosfaat (poliep) is een biologische polymeer gevonden in de cellen in alle domeinen van het leven, en is vereist voor de virulentie en stressrespons bij vele bacteriën. Er zijn een aantal manieren om quantifying poliep in biologische materialen, waarvan vele zijn arbeidsintensief of ongevoelig, beperken hun nut. Wij presenteren hier een gestroomlijnde methode voor de kwantificering van de poliep in bacteriën, met behulp van een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters, vertering van poliep met de poliep-specifieke exopolyphosphatase ScPPX, en detectie van de resulterende gratis fosfaat met een gevoelige ascorbinezuur gebaseerde colorimetrische test. Deze procedure is eenvoudig, goedkoop en betrouwbaar poliep kwantificering kan in verschillende bacteriesoorten. Wij presenteren representatieve poliep kwantificering van de gram-negatieve bacterie (Escherichia coli), de gram-positieve melkzuur-bacterie (Lactobacillus reuteri), en mycobacteriële soorten (Mycobacterium smegmatis). We voegen ook een eenvoudig protocol voor nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden van ScPPX, die nog niet commercieel beschikbaar.

De belangrijkste stappen van het protocol zijn routerplan in vereenvoudigde vorm in Figuur 1.
Om aan te tonen het gebruik van dit protocol met gram-negatieve bacteriën, wild-type E. coli was MG165539 uitgegroeid tot halverwege log fase in de rijke medium LB bij 37 ° C met schudden (200 rpm), vervolgens gespoeld en een extra 2 h in ge¨ uncubeerd morpholinopropanesulfo...

Beschrijven we een eenvoudige methode voor snelle kwantificering van anorganische polyfosfaat in verschillende bacteriën, waaronder mycobacteriële, gram-negatieve en gram-positieve soorten.

Keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

Anorganisch polyfosfaat is een belangrijk element in bacteriële stressrespons. Maar oudere methoden voor het extraheren en meten van poliep in bacteriën zijn complex en arbeidsintensief. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snelle, gevoelige en goedkope kwantificering van polyP-niveaus in een verscheidenheid van verschillende bacteriële soorten mogelijk maakt.De procedure zal worden aangetoond door Arya Pokhrel, een student van mijn laboratorium. Om te beginnen, groeien lactobacillus reuteri bacteriën in malic enzym inductie medium zonder cystine op 37 graden Celsius 's nachts zonder te schudden. Centrifuge een milliliter van deze nachtelijke cultuur in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis om genoeg cellen te oogsten om een totaal van 50 tot 100 microgram cellulair eiwit opleveren.Verwijder de supernatant volledig uit de celpellet en voeg vervolgens 250 microliters GITC lyse buffer toe en opnieuw te besteden door vortexing. Incubeer bij 95 graden celsius gedurende 10 minuten om de cellen te lyse. Bewaar het lysaat op 80 graden Celsius.Bereid eerst BSA-normen voor die nul, 1, 2 en 4 milligram bsa-buffer bevatten. Aliquot vijf microliters van ontdooide, goed gemengde cel lysates en vijf microliter van BSA normen om putten te scheiden in een duidelijke 96 put plaat. Voeg 195 microliters van Bradford reagens toe aan elke put en meet absorptie op 595 nanometer in een plaatlezer.Bereken de hoeveelheid eiwit in elke put in vergelijking met de BSA-standaardcurve zoals beschreven in het manuscript. Vermenigvuldig de resulterende waarde met 05 om de totale hoeveelheid eiwit in elk monster te bepalen. Om te beginnen met polyfosfaat extractie, voeg 250 microliter van 95% ethanol aan elk GITC lysed monster, en vortex te mengen.Pipette dit mengsel om een silica membraan spin kolom geplaatst in een 1,5 milliliter centrifuge buis. Centrifuge op 16, 100 g gedurende 30 seconden. Gooi de stroom door en voeg 750 microliter van het tris-hydrochloride, natriumchloride, EDTA en ethanolmengsel toe.Centrifuge op 16, 100 gs gedurende 30 seconden. Gooi de stroom door en centrifugeren de spin kolom op 16, 100 gs gedurende twee minuten. Plaats de kolom in een schone 1,5 milliliter microfuge buis.Voeg 150 microliter van 50 millimolar pH acht tris-hydrochloride toe en broed vijf minuten op kamertemperatuur. Elute polyP door twee minuten op 8.000 g te centrifugeren. Begin met het opstellen van normen die nul, vijf, 50 of 200 micromolar kaliumfosfaat bevatten in 50 millimolar pH acht tris-hydrochloride.Aliquot 100 microliter van elke fosfaatnorm en 100 microliter van geëxtraheerde polyP monsters in afzonderlijke putten van een duidelijke 96 putplaat. Bereid een master mix met, per monster, 30 microliters van 5X ScPPX reactiebuffer, 19 microliters water, en een microliter van gezuiverde ScPPX. Voeg 50 microliter van de master mix aan elke put van de 96 put plaat.En incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Op de dag van detectie, bereid een verse werkvoorraad van detectie-oplossing door het mengen op 9,12 milliliter detectie oplossing basis met 88 milliliter van een molaire ascorbine zuur, en laat het op kamertemperatuur komen voor gebruik. Voeg 50 microliter detectieoplossing toe aan elk monster en standaarden in de 96 putplaat.Om kleurontwikkeling mogelijk te maken, ontcunooit de plaat bij kamertemperatuur gedurende ongeveer twee minuten. Gebruik een plaatlezer om de absorptie op 882 nanometer te meten en de fosfaatconcentratie van elk monster te berekenen in vergelijking met de kaliumfosfaatnormcurve. Zet vervolgens de fosfaatconcentraties om in nanomol van polyP-afgeleid fosfaat in elk cellysaat en normaliseer cellulaire polyP-gehalte naar het totale cellulaire eiwit, zoals beschreven in het manuscript.Wild-type E.coli, een gram-negatieve bacterie, geteeld in LB geproduceerd geen polyP. Maar wanneer geteeld in MOPS, geproduceerd ongeveer 192 nanomolen polyP per milligram van het totale eiwit. Een E.coli delta ppk mutant, die polyP kinase mist, produceerde geen polyP in beide medium.Een delta ppx mutant, die exopolyfotase mist, produceerde ongeveer dezelfde hoeveelheid polyP als het wilde type. En de delta phoB mutant, die defect is in fosfaattransport, produceerde aanzienlijk minder polyP dan het wilde type. Wild-type L.reuteri, een gram-positieve bacterie die 's nachts in meic medium wordt gekweekt, verzamelde ongeveer 51 nanomol per milligram totaal eiwit.Een L.reuteri ppk1 null mutant met polyP kinase bevatte minder dan de helft van dit bedrag. Deze aanwezigheid van polyP in de ppk1 null mutant is waarschijnlijk te wijten aan L.reuteri met een tweede polyP kinase. Mycobacterium smegmatis stam SMR vijf, geteeld in Hartmans-de Bont medium bij afwezigheid van ethanol verzameld ongeveer 141 nanomolen polyP per milligram totaal eiwit.Terwijl ethanol behandeling resulteerde in een drievoudige toename. Na deze procedure kan acrylamide gel elektroforese worden uitgevoerd om verschillen in polyP-ketenlengte te beoordelen. Tijdens het proberen van deze procedure, vermijd gemeenschappelijke fouten.Vergeet niet om te voorkomen dat het krijgen van bellen in microtiter plaat putten, en wees voorzichtig om uw monsters over te dragen aan de juiste buis bij het overschakelen van de kolom naar de microfuge buis. Vergeet niet dat het werken met GITC en sterke zuren gevaarlijk kan zijn, en de juiste beschermingsmiddelen moeten altijd worden gedragen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

assaying-for-inorganic-polyphosphate-in-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol beschrijft een high-throughput methode van enzymatische hydrolyse dat een microplaat lezer gebruikt om te meten en de bodem fosfor als P mono-esters, P di-esters en anorganische P. classificeren Tot 96 monsters kunnen worden gemeten op een bepaald moment in een standaard laboratorium.

High-throughput meten en indelen van organische P in milieumonsters

Inositol pyrofosfaten spelen een belangrijke rol in de menselijke ziekten zoals kanker, diabetes en obesitas, maar het exacte werkingsmechanisme is een kwestie van geschil. Het gebrek aan commercieel beschikbare inositol pyrofosfaten maakt gedetailleerde studies problematisch. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het produceren en isoleren milligram inositol pyro.

De voorbereiding van Quality Inositol pyro

Source: Pokhrel, A., et al. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates a colorimetric assay to measure inorganic polyphosphate (polyP) in bacterial samples. The procedure involves enzymatically converting polyP into free phosphate, which then reacts with molybdate and ascorbic acid to produce a blue-colored complex. By comparing the absorbance of this complex to a standard curve of known phosphate concentrations, the polyP content in bacterial...

An Assay for the Quantification of Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Source: Vidilaseris, K., et al. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a colorimetric assay to screen inhibitors of bacterial membrane-bound pyrophosphatase (mPPase) by quantifying orthophosphate release. The method enables identification of compounds that inhibit mPPase from Thermotoga maritima, a potential antimicrobial drug target.

Screening Inhibitors of Bacterial Membrane-Bound Pyrophosphatase Using a Colorimetric Assay 

Deze paper introduceert een procedure voor het onderzoek naar de adsorptie van fosfonaten op ijzer-bevattende filtermaterialen, met name granulaire ijzer(III) hydroxide met weinig inspanning en hoge betrouwbaarheid. In een gebufferde oplossing, is het fosfonaat in aanraking met het absorberend met behulp van een rotator gebracht en vervolgens geanalyseerd via de methode van een verkleinde fosfor sleutelbepaling.

Geoptimaliseerde Procedure voor de bepaling van de adsorptie van fosfonaten op granulaire Ferric Hydroxide met behulp van een methode fosfor sleutelbepaling verkleind

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

In dit manuscript opgericht wij een hoge doorvoersnelheid methode om te kwantificeren van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus biofilm cultuur van weefselkweek...

Colorimetrische analyse van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus Biofilm

De groei van van bacteriële culturen in micro titer gerechten vergemakkelijkt een hoge doorvoer bemonstering die meerdere technische en biologische repliceren assays van nucleotide zwembad overvloed, met inbegrip van die van (p) ppgpp. De effecten van groei overgangen veroorzaakt door bronnen van fysiologische stress en herstel van stress kunnen worden gecontroleerd.

Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie

Hier presenteren we een screeningsmethode voor membraan-gebonden pyrofosfatase (van Thermotoga maritima) remmers op basis van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat formaat.

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Een procedure voor capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie voor de absolute kwantificering van inositolpyrosfaten uit zoogdiercelextracten wordt beschreven.

Absolute kwantificering van inositolpyrosfaten door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie

Leer een snelle methode voor kwantificering van anorganisch polyfosfaat in bacteriën. Deze techniek is geschikt voor Gram-negatieve, Gram-positieve en mycobacteriële soorten.

Keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën

Meer video's verkennen