Tests voor de specifieke groeisnelheid en cel-bindend vermogen van Rotavirus

Met behulp van de hier gepresenteerde tests kan het verschil in fenotype tussen rotavirusstammen worden geëvalueerd, waarbij unieke stammen geïsoleerd zijn. Specifiek wordt de fenotypische verandering van ontsmettingsmiddelresistente stammen van rotavirus onderzocht. Om duidelijke kwantitatieve output te bereiken met behulp van de plaquetest, is het van cruciaal belang om een geschikte combinatie van rotavirusstam en serum te selecteren, waarbij het rotavirus goed is aangepast aan het serum.

Het aantonen van de procedure zal Syun-suke Kadoya zijn, een promovendus van mijn laboratorium. Verwijder een CryoTube met MA104-cellijnen uit de vloeibare stikstofcontainer. Plaats de CryoTube in een waterbad op 37 graden Celsius om de cellen te ontdooien.

Voeg een milliliter van de celsuspensie toe aan 20 milliliter serumhoudend medium in een T75-kolf. Incubeer de kolf in een couveuse bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende twee tot drie dagen. Zodra de celmonolaag 80% samenvloeiing bereikt, verwijdert u de supernatant en wast u de cellen twee maal met vijf milliliter PBS van 1X Dulbecco.

Voeg vier milliliter van 0,05% trypsin-EDTA toe aan de kolf en broed vijf minuten lang uit bij 37 graden Celsius om de cellen uit de kolf te halen. Breng de celsuspensie over op een buis van 15 milliliter en vercentrifugeer vijf minuten op 190 g. Gooi het supernatant weg en verhoog de gepelde cellen in één milliliter serumhoudend medium.

Verdun vervolgens de opnieuw opgespente cellen 100-voudig met het medium. Voeg drie milliliter van de verdunde celsuspensie toe aan elke put van een zes-put plaat voor de plaquetest. Voeg een milliliter van de verdunde celsuspensie toe aan elke put van een 24-putplaat voor de celbindende test.

Incubeer de platen in een couveuse bij 37 graden Celsius en 5% CO2 onderverzadigde damp gedurende twee of drie dagen. Breng een buis met een milliliter van de virussuspensie in serumvrij medium van opslag bij min 80 graden Celsius over naar een 37 graden Celsius waterbad om te ontdooien. Voeg een microgram per microliter van trypsine uit varkensalvleesklier aan een milliliter van het virus suspensie en vervolgens vortex.

Incubeer de virussuspensie bij 37 graden Celsius en 5% CO2 onderverzadigde damp gedurende 30 minuten. Verdun de geactiveerde virussuspensie met serumvrij medium om de veelheid van infectie, of MOI, aan te passen aan 0,1 pfu per cel. Voeg drie dagen na de celbeplating een milliliter van de verdunde virussuspensie toe aan MA104-cellen in een T75-kolf.

Incubeer de cellen met virus op 37 graden Celsius gedurende een uur, zachtjes schudden van de kolf om de 15 minuten. Voeg vervolgens 30 milliliter serumvrij medium met vier microgram per milliliter trypsine uit de varkensvleesklier toe aan de kolf. Incubeer de kolf bij 37 graden Celsius en 5% CO2 onderverzadigde damp.

Verzamel een milliliter van de supernatant in de kolf op nul, zes, 12, 18, 24 en 36 uur na infectie, en vervang de supernatant in de 1,5 milliliter types met behulp van een pipet. Voer een vriesdooi cyclus binnen 15 minuten bij min 80 graden Celsius, gevolgd door een 15 minuten smelten in een waterbad op 37 graden Celsius. Dan centrifugeren de buizen op 12, 600 g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.

Verzamel de supernatant. Filter de supernatant met een gedestilleerd 0,2 micron-filter om de celfractie te verwijderen. Bewaar de supernatant op min 80 graden Celsius tot het toepassen van het op de plaque test voor het meten van het virus titer.

Wanneer klaar om de plaque test uit te voeren, plaats de buizen met de verzamelde supernatant in een waterbad op 37 graden Celsius. Voeg trypsine toe aan een milliliter 10-voudig verdund monster en broed gedurende 30 minuten in op 37 graden Celsius. Tijdens deze 30 minuten durende incubatie, zorgvuldig wassen van de MA104 cellen in een zes-put plaat met twee milliliter 1X PBS na het verwijderen van het serum-bevattende medium.

Verdun de geïncubeerde monsters in serie met serumvrij medium en inent in elke put een milliliter van het verdunde monster. Incubeer de plaat gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius en 5% CO2 onderverzadigde damp, zachtjes schudden van de plaat om de 15 minuten. Na incubatie, verwijder het entmateriaal van de zes-put plaat.

Voeg vier microgram per milliliter trypsine toe aan het bereide medium. Voeg voorzichtig maar onmiddellijk drie milliliter van het medium gemengd met agarose gel toe aan elke put. Laat de agarosegel meer dan 10 minuten stollen bij kamertemperatuur.

Vervolgens broeden de plaat voor twee dagen op 37 graden Celsius en 5% CO2 onderverzadigde damp. Voeg vervolgens een milliliter van 0,015%Neutrale Rode oplossing verdund met 1X PBS aan elke put, en uitbroeden met dezelfde voorwaarden. Verwijder de kleurstof na drie uur en blijven incubeer voor een dag.

De volgende dag, tel het aantal plaques in elke put en bereken de pfu per milliliter. Controleer de cel samenvloeiing zorgvuldig voor de plaquetest om de plaquenummers te verzekeren. Voor de celbindende test voegt u één microgram per microliter trypsine van een varkensalvleesklier toe aan een milliliter van de virussuspensie en vervolgens vortex.

Verdun de virussuspensie met serumvrij medium om de MOI aan te passen aan één pfu per cel. Was de MA104 cellen twee keer in een 24-well plaat met een milliliter tris-gebufferde zoutoplossing. Nu inenten de cellen met 100 microliters van verdunde virus suspensie in elke put van de 24-put plaat.

Incubeer de plaat op vier graden Celsius gedurende 90 minuten met zachte schudden om de 15 minuten. Verwijder het virus en en was de cellen twee maal met een milliliter tris-gebufferde zoutoplossing. Om het dubbelstrengs RNA van het rotavirus te extraheren, voeg 140 microliters van 1X PBS en 560 microliters van de RNA-extractiebuffer toe aan elke put.

Meng voldoende met een pipet totdat de waas van cellen in de buffer niet wordt gezien. Na het herstellen van het dubbelstrengs RNA, volgens het protocol van de fabrikant, plaats de 1,5 milliliter buizen, met het dubbelstrengs RNA-extract, vijf minuten op een warmteblok bij 95 graden Celsius om het RNA te denatureren. Plaats de buizen dan onmiddellijk op ijs en broed gedurende meer dan twee minuten.

Synthetiseer de cDNA met behulp van een omgekeerde transcriptie kit. Voeg vier microliters van gedenatureerde virale RNA-oplossing toe aan een PCR-buis met 16 microliters reactiemengsel en meng het zorgvuldig met een pipet om geen bellen te genereren. Na het draaien van de buizen, voer de omgekeerde transcriptie met een thermocycler.

Voor kwantitatieve PCR, gebruik maken van een quencher-inserting sonde gericht op de 963 tot 1, 049 regio van de NSP3 genoom segment van rotavirus. Verdun de standaard plasmid in serie met water van PCR-kwaliteit en maak de mastermix voor kwantitatieve PCR. Voeg 20 microliter van de master mix toe aan de putten van een 96-well PCR plaat.

Meng vervolgens vijf microliter cDNA-monsters of vijf microliter van de standaard plasmide door 10 keer te pipetten. Uitvoeren van kwantitatieve PCR volgens de voorwaarden in het tekstprotocol. Bereken ten slotte het rotavirusgenoom dat gebonden is aan het MA104-celoppervlak zoals beschreven in het tekstprotocol.

Hier is een groeicurve van rotavirus te zien. Door de minst vierkante methode toe te passen op een gewijzigd Gompertz-model, wordt het specifieke groeipercentage geschat op 0,197 en wordt de vertragingsperiode geschat op 6,61 uur. De relatieve virustiter in de stationaire fase van de initiële titer is 3,15.

Van de zes geteste rotavirusklonen varieerden de geschatte waarden van de specifieke groei van 0,19 tot 0,27. Deze geschatte waarden zijn betrouwbaar omdat de bepalingscoëfficiënt in de modelmontage meer dan 0,98 bedraagt. Het resultaat van de celbindende test wordt weergegeven als bindende efficiëntie, dat is de verhouding van gebonden virale deeltjes tot die aanwezig zijn in het entmateriaal.

Onze RV virions binding aan celoppervlakken zijn ongeveer 10.000 exemplaren per milliliter met een bindende efficiëntie van ongeveer 1%bij gebruik van een 24-well plaat voor de celbindende test. Aangezien gecultiveerde cellen gevoelig zijn voor fysieke spanningen, zorg ervoor dat de buffer en agar voorzichtig maar snel giet. In wezen is een nieuw systeem voor de virussen geïntroduceerd.

Met behulp van dit systeem kunnen we de reële celbindende vermogen en specifieke groeisnelheid evalueren met instrumenten. Ons protocol is voordelig bij het meten van de fenotypische eigenschap. Door het controleren van verschillende van nieuw opkomende stammen, u helpen om de nieuwe vaccins voor de virussen te evalueren.

De virussen zijn aangewezen als BSL-2 pathogenen, dus je moet BSL-2 experimentele kamers voor te bereiden om deze procedure uit te voeren.