Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het stamcelveld over de rol van volwassen stamcellen in de regulatie van kankercelgedrag. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt de evaluatie van kankercel-en stamcel interacties in vitro zonder het gebruik van levende organismen. Deze techniek heeft potentieel voor kankermetastase als het modellen van de bevorderende rol van volwassen stamcellen in kanker metastase aan harde weefsels zoals bot.

Demonstratie van de procedure zal worden uitgevoerd door Huseyin Apdik, een post-doctoraal in mijn laboratorium. Begin met het gebruik van steriele extractie tangen om het pulpweefsel te verwijderen uit het centrum van verstandskiezen verkregen van jonge volwassenen in de leeftijd van 17 tot 20 jaar oud. Plaats het weefsel in koude complete DMEM in 10-centimeter weefsel cultuur gerechten en gebruik een scalpel om de monsters gehakt in twee tot drie millimeter fragmenten.

Breng de stukken van elk gerecht in individuele putten van een weefselkweek behandeld zes-goed plaat en bedek de weefsels in elke put met 200 microliters van volledige DMEM. Laat de weefsels hechten aan de put bodems met een ten minste twee uur incubatie in een bevochtigde, 37 graden Celsius en 5% CO2-cel cultuur incubator. Aan het einde van de incubatie, voeden de weefsels met twee tot 2,5 milliliter vers compleet medium en cultuur de cellen voor een extra acht tot negen dagen.

Wanneer de cultuur 80% samenvloeiing heeft bereikt, was elke put met twee milliliter PBS, gevolgd door loslating van de cellen met twee milliliter trypsine bij 37 graden Celsius. Na twee minuten, stop de reactie met twee milliliter van volledige DMEM per goed en verzamel de cellen door centrifugatie. Vervolgens, resuspend de pellets in 15 milliliter vers compleet medium per twee putten van cellen en passage van de cellen in T75 kolven voor hun latere cultuur.

Na ten minste acht passages, visualiseren van de cellen door middel van lichte microscopie. De tandpulp stamcellen moeten hebben gehecht aan de cultuur gerechten en moet een spindel-achtige cel morfologie weer te geven. Voor oppervlaktemarkeringsanalyse, nadat trypsinisatie is aangetoond, bevestigt u de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in 1,5 milliliter buizen, gevolgd door drie wasbeurten in 500 microliter PBS per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt, label de cellen met de juiste antilichamen van belang in 100 microliters van PBS per buis gedurende een uur bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in PBS zoals aangetoond en label de cellen met de juiste secundaire antilichamen in 100 microliter PBS per buis gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Was vervolgens de monsters drie keer in PBS en analyseer de cellen door de stroom cytometrie volgens de standaard protocollen.

Voor differentiatie van de tandpulp stamcellen, zaad een keer 10 tot de vier cellen in individuele putten van 24-well platen in 500 microliters van volledige DMEM voor een 24-uurs incubatie in de celcultuur incubator. De volgende dag, vervang het medium in elke put met de juiste differentiatie medium en de cellen terug te keren naar de incubator, verfrissende het medium twee keer per week gedurende twee weken. Differentiatie kan worden bevestigd door von Kossa en Alcian blauwe vlekken volgens de standaard protocollen.

Na twee tot vier passages, verzamel de geconditioneerde medium supernatants van de gekweekte tandheelkundige pulp stamcellen wanneer de culturen bereiken 80%-samenvloeiing. Vervolgens centrifugeren het verzamelde medium om afvalweefsel materiaal en celafval te verwijderen en het medium op te slaan bij negatieve 20 graden Celsius tot gebruik. Voor kankercelbehandeling, zaad een keer 10 tot de vijf tumorcellen in individuele putten van een 12-well plaat voor 's nachts incubatie bij 37 graden Celsius en 5% CO2.

De volgende ochtend, gebruik maken van een steriele 200-microliter tip om een kras letsel te maken in elke put en onmiddellijk vervangen van de supernatant in elke put met verse medium met verschillende concentraties van geconditioneerd medium. Bekijk vervolgens onmiddellijk de krassen onder een omgekeerde microscoop en verkrijg beelden van de gewonde culturen op regelmatige tijdstippen. Aan het einde van de analyse, meet de kras sluiting na verloop van tijd in ImageJ.

Om de migratie van tandpulpst te beoordelen, zaad eerst drie keer 10 tot de vier tandpulpstamcellen op individuele 24-putplaatinsert met 0,4 micron poriën in 250 microliter van DMEM en de inzetstukken 's nachts uitbroeden bij 37 graden Celsius. Vervolgens zaad vijf keer 10 de vier tumorcellen in individuele putten van een 24-well plaat in 500 microliters van DMEM voor 's nachts incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend, krassen op de tumorcellen zoals aangetoond.

Vervang de supernatants door 500 microliters verse DMEM en plaats een tandpulp stamcel gezaaid insert in elke goed gevoed met vers medium. Dan onmiddellijk observeren cellen op een omgekeerde microscoop en beeld van de cellen op regelmatige tijdstippen om tandheelkundige pulp stamcel migratie te beoordelen. Om de directe interacties van tandpulpstamcellen met kankercellen te beoordelen, probeert u elke gelabelde cultuur te onderzoeken om eencellige suspensies te verkrijgen en de gescheiden cellen te verzamelen door middel van centrifugatie.

Resuspend de pellets in verschillende cel linker kleurstof oplossingen bereid in verdunningsstof C buffer, geleverd volgens de instructies van de fabrikant, en incubaat de cellen zijn kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Beëindig de kleuringsreactie met 100 microliters foetaal runderserum en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Dan centrifugeren de cellen met volledige groeimedium voor plating vijf keer 10 tot de vier tandheelkundige pulp stamcellen en tumorcellen per goed in een zes-put plaat op een een tot een verhouding in twee milliliter van compleet medium.

Verzamel de cellen na 24 of 48 uur incubatie door centrifugatie gevolgd door een wasbeurt in PBS. Dan, resuspend de cellen in 300 microliters van fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer in vijf-milliliter ronde stroom cytometriebuizen en vortex om om het even welke celaggregaten te verspreiden alvorens de cellen volgens standaard stroom cytometrische analyseprotocollen te analyseren. Tandpulp stamcellen vertonen een fibroblast-achtige celmorfologie na beplating en uitdrukken mesenchymale stamcel oppervlakte antigenen, maar niet hematopoietische cel markers.

Veranderingen op morfologisch en moleculair niveau in verband met osteo, chondro, en adipogene differentiatie worden ook waargenomen in de tandheelkundige pulp stamcelculturen na de juiste differentiatie cocktail toepassing. De behandeling van kraswonden tumorcelculturen met 10 en 20% concentraties geconditioneerd medium verhoogt de krassluiting aanzienlijk in vergelijking met controle-medium-behandelde tumorcelculturen. Uitgescheiden moleculen uit tandheelkundige pulp stamcel insert co-culturen ook toegenomen kras sluiting in gewonde tumorcellen in vergelijking met controle cel co-culturen.

Fluorescentie microscoop analyse van de interacties van tandheelkundige pulp stam en tumorcel binnen een in vitro cel cultuur onthult de oprichting van een goed georganiseerde structuur waarbinnen tumorcellen snel vermenigvuldigen na 48 uur. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om twee weefselmonsters te houden in koude medium en onmiddellijk monsters te vervoeren naar het laboratorium om celdood te minimaliseren. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in de stamcelvelden bij het verkennen van volwassen stemcelkankerinteracties bij de mens.

Na deze procedure kunnen andere methoden zoals immuunceltracering voor differentiële gelabelde cellen van verschillende stamcel- en kankertypen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe volwassen stamcellen interageren met kankercellen en kankermetastase bestrijden. Vergeet niet dat het werken met de menselijke monsters gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het analyseren van patiëntmonsters op infectieziekten en het verkrijgen van schriftelijke toestemming van de patiënt altijd moeten worden geïmplementeerd bij het uitvoeren van deze procedure.