Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.
16 april 2019
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om één, besmet-blaas epitheliale cellen van een lymfkliertest model van urineweginfectie te isoleren.
Intracellulaire bacteriële gemeenschappen, of IBC's, zijn waargenomen bij muizen die experimentele urineweginfecties, of RINA's hebben gekregen. Ze zijn ook gezien in de urinesedimenten van menselijke UTI-patiënten. De techniek die we vandaag beschrijven is een manier om enkele IPC's te isoleren van experimenteel geïnfecteerde muizen.
De mond micropipetting techniek is de enige momenteel beschikbare techniek voor het isoleren van intracellulaire bacteriën uit geïnfecteerde muisblazen. Om glazen mond pipetten voor te bereiden, stevig knijpen beide uiteinden van een glazen capillaire buis en gelijkmatig draaien het midden van de buis heen en weer langs zijn as over een open vlambron. Wanneer het glas zacht wordt, verwijder dan de capillaire uit de warmtebron en trek het glas onmiddellijk uit elkaar.
De ideale laatste lengte van de getrokken capillaire is drie tot vijf centimeter langer dan een ongepulteerde capillair om een geschikte inwendige diameter te garanderen voor het isoleren van epitheelcellen van één blaas. Wanneer het glas is afgekoeld, controleer dan of het midden van de glazen haarvaten smaller is en of het interieur van de buis nog hol is. Het oppakken van het grote uiteinde van de getrokken capillaire met een hand, gebruik tangen te grijpen van de capillaire op het smalste punt, ervoor te zorgen dat de tangen worden gehanteerd met voldoende kracht om de capillaire stevig grip zonder te verpletteren.
Draai de tangen snel om de getrokken capillaire op het smalste punt te breken. Plaats vervolgens de mond micropipet-sized capillaire in een 100 millimeter petrischaal en UV steriliseren de schotel gedurende 30 minuten. Om de blaas te oogsten, plaats een muis in de supine positie en steriliseren de buikstreek met 70%ethanol.
Met behulp van ethanol-gesteriliseerde tangen en chirurgische schaar, maak een eerste een-centimeter dwarse huid incisie boven de urethrale opening en vouw de incisie diagonaal naar de bovenste ledematen van de muis om een V-vormige snede langs de gehele voorste van de muis die de inhoud van het buikvlies blootstelt. Met behulp van nieuwe gesteriliseerde gereedschappen, zachtjes naar beneden te duwen op de vetpads in de buurt van het bekkengebied van de muis om de blaas te steken en greep de blootgestelde blaas aan de top. Het houden van een stevige greep op de blaas, snijd de urineleiders en urethra om de blaas te bevrijden en steek de punt van een schacht van afgeronde tangen in de opening van de blaas waar het net was ingesneden.
Laat de tangen grijpen de top en het houden van de afgeronde tangen bijna volledig gesloten, gebruik een tweede paar tangen om voorzichtig trek de buitenkant van de mond van de blaas uit de buurt van de afgeronde tangen en rond en over de andere punt van de afgeronde tangen om de blaas binnenstebuiten te draaien. Gebruik vervolgens het tweede paar tangen om de omgekeerde blaas van het puntje van de tangen voorzichtig te overhalen in een milliliter koude PBS. En schraap voorzichtig de interne epitheelcellaag aan de buitenkant van de omgekeerde blaas met twee paar schone tangen.
Wanneer alle cellen zijn geschraapt, steek het ongepulteerde uiteinde van een getrokken glazen capillair in de rubberen stekker van een aspiratorbuis en sluit het smalle uiteinde van een pipetpunt van één milliliter stevig in het andere open uiteinde van de buis. Strak passen het smalle uiteinde van een twee milliliter aspirating pipet in de open, bredere einde van de een milliliter pipet tip en plaats de geschraapte cel suspensie onder een ontleden microscoop. Met behulp van een vergroting van 20 tot 40x identificeert u de IBC's als grote fluorescerende aggregaten en dompelt u het fijne uiteinde van de glazen capillaire gedurende een seconde in een verse buis PBS om de opname van ongewenst volume door capillaire werking te verminderen.
Wanneer een IBC van belang is gevestigd, langzaam brengen het open uiteinde van de capillaire buis in de richting van de IBC en breng een zeer kleine zuigkracht aan de aspirating pipet om de IBC te begeleiden in de glazen capillaire. Verplaats vervolgens de capillaire naar een lege 1,5 milliliter centrifugebuis en breng een lichte positieve druk aan om de druppel en de IBC in de buis te verdrijven. Naast de bevestiging van de aanwezigheid van een enkele geïsoleerde IBC in de opvangbuis via de ontledenmicroscoop, kan de zuiverheid van de geïsoleerde IBC worden bevestigd door confocale microscopie.
De geïsoleerde cellen moeten vlekken hebben op zowel E.coli als uroplakine en moeten tussen de 50 en 120 micrometer groot zijn. Na isolatie kan de aanwezigheid en levensvatbaarheid van de bacteriële cellen in de individuele IBC worden bevestigd door middel van kolonievormingseenheidkwantificering of kwantitatieve polymerasekettingreactie voor genomische equivalenten. Met name niet-geïnfecteerde epitheliale cellen geïsoleerd met hetzelfde protocol tonen geen kwantificeerbare hoeveelheden bacteriën aan.
Verder bevestigt kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactieanalyse de aanwezigheid van bacteriële genen in een reeks individueel geïsoleerde en gepoolde IBC's. Zorg er altijd voor dat een mondmicropipet gemakkelijk vloeistof kan oppikken en verdrijven. Aarzel niet om de capillaire of het hele apparaat te veranderen als de mondmicropipet zich afgesloten voelt.
Deze mondmicropipetting techniek stelt ons in staat om direct en specifiek de intracellulaire populaties te bestuderen die zich vormen tijdens een experimentele UTI. Zonder deze techniek zouden deze intracellulaire populaties besmet zijn met en in de minderheid zijn door de extracellulaire bacteriën. Sommige andere infectieuze agentia kunnen gemakkelijker worden geërosoliseerd of overgedragen dan de E.coli die we in deze toepassing hebben gebruikt.
In deze gevallen kunnen daarom aanvullende controles gerechtvaardigd zijn, zoals het toevoegen van een filter of het uitbreiden van de slang, afhankelijk van de toepassing die wordt gebruikt. De IBC's geïsoleerd met behulp van deze mond micropipetting techniek kan vervolgens worden gebruikt in andere downstream eencellige analyses, zoals QRTPCR of RNA sequencing.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele, geïnfecteerde blaasepitheelcellen uit een muismodel van urineweginfectie (UTI). Deze techniek maakt de studie van intracellulaire bacteriële gemeenschappen (IBCs) mogelijk zonder besmetting van extracellulaire bacteriën.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Besmettelijke ziekten
- Celbiologie
Achtergrond
- Intracellulaire bacteriële gemeenschappen (IBCs) worden gevonden in zowel muizen als menselijke patiënten met UTI.
- De mond micropipetteringstechniek is momenteel de enige methode voor het isoleren van IBCs uit geïnfecteerde muizenblaasjes.
- Het begrijpen van IBCs is cruciaal voor het bestuderen van de pathogenese van UTI's.
- Het isoleren van IBCs kan downstream analyses zoals qPCR en RNA-sequencing mogelijk maken.
Doel van het onderzoek
- Om enkele IBCs te isoleren uit muismodellen van UTI.
- Om een gedetailleerde studie van de intracellulaire populaties gevormd tijdens UTI's mogelijk te maken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van bacteriële infecties op single-cell niveau.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van glazen mond pipetten voor celisolatie.
- Chirurgische extractie van de blaas uit geïnfecteerde muizen.
- Micropipetteringstechniek om IBCs uit de blaas te isoleren.
- Bevestiging van geïsoleerde IBCs met behulp van microscopie en moleculaire technieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van IBCs bevestigd door middel van microscopie.
- Geïsoleerde cellen verkleurden positief voor E. coli en uroplakin.
- Kwantitatieve analyse bevestigde de aanwezigheid van bacteriële genen in geïsoleerde IBCs.
- Ongeïnfecteerde cellen vertoonden geen kwantificeerbare bacteriën, wat de isolatiemethode valideert.
Conclusies
- De mond micropipetteringstechniek is effectief voor het isoleren van IBCs.
- Deze methode maakt de studie van intracellulaire bacteriële populaties mogelijk zonder besmetting.
- Verdere toepassingen kunnen verschillende single-cell analyses omvatten om de pathogenese van UTI te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating single intracellular bacterial communities (IBCs) from murine urinary tract infection models enables mechanistic de-risking of host-pathogen interactions at cellular resolution. This approach supports target validation by providing purified, viable infected epithelial cells for downstream single-cell analyses, reducing confounding signals from extracellular bacterial populations. The protocol’s reliance on widely available materials and short time-to-isolation (~8 hours) enhances feasibility for early discovery workflows focused on antimicrobial target identification and phenotypic screening in infection models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating viable IBCs containing intracellular E. coli for functional target assessment.
- Operational Value: Provides a contamination-minimized system for clarifying bacterial persistence mechanisms within host cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantifiable, single-cell resolution data on bacterial gene expression and viability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (IBC-containing epithelial cells) for standardized downstream assays such as qPCR or RNA sequencing.
- Operational Value: Ensures assay readiness through isolation of nearly contaminant-free single cells, improving reproducibility in infection model screening.
- Scalability: Enables platform reuse across infection models where rare infected cells require isolation from heterogeneous mixtures.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by isolating IBCs from a murine UTI model that mirrors human intracellular bacterial community formation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates biomarker alignment by enabling detection of bacterial genes (e.g., via qRT-PCR) in individually isolated IBCs.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by confirming absence of quantifiable bacteria in uninfected epithelial controls, validating isolation specificity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of intracellular survival pathways, progressing to lead identification through single-cell analysis of isolated IBCs, and supporting preclinical validation via gene expression and viability profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating IBCs for study of intracellular bacterial populations without extracellular contamination.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible single-cell outputs suitable for compound evaluation in infection models.
- Analytics: Generates quantitative measurements (e.g., genomic equivalents via qPCR, CFU counts) that allow comparison of bacterial load and viability across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through disease-relevant IBC isolation from a murine UTI model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare infected cells from mixtures, applicable beyond UTIs to other intracellular pathogen models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through a low-cost, widely accessible micropipetting technique.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of antimicrobial targets using physiologically relevant infection models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing single-cell resolution data on intracellular bacterial persistence and gene expression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical procedures, sterile tissue handling, and micropipette manipulation.
- Depends on glass capillary preparation, UV sterilization, and dissection microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for consistent IBC isolation and downstream molecular analysis (e.g., qPCR, RNA sequencing).
- Involves adaptation considerations when applying the technique to other infection models or cell types with varying fragility or size.
- Includes practical limitations such as the biohazard risk of mouth micropipetting, which precludes use with highly infectious agents.
