Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cerebrale vasculaire fysiologie als het gaat om cerebrale bloedstroom verordening tijdens veroudering en ontwikkeling van chronische ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gelijktijdige meting van intracellulair calcium- en membraanpotentieel van cerebrale arteriële endotheel in zijn oorspronkelijke vorm onder fysiologische omstandigheden mogelijk maakt. Om de muishersenen te isoleren, verwijder onder de microscoop de huid en het haar over de schedel.

En verwijder overmatig bloed met koude calciumvrije PSS. Maak vervolgens een incisie met alleen de uiteinden van de standaard dissectie schaar. Vanaf het occipitale bot en zich uitstrekt door het neusbeen van de schedel.

Dan open ze schedel zorgvuldig langs de incisie, met behulp van grof-getipt tangen en scheiden het bindweefsel om de hersenen bloot. Was de geïsoleerde hersenen voorzichtig met koude calciumvrije PSS in een beker om het bloed te verwijderen. Plaats de hersenventilatiezijde omhoog in een kamer met koude dissectieoplossing voor de isolatie van hersenslagaders.

Om de cerebrale slagaders te isoleren, zet u de geïsoleerde hersenen in koude dissectieoplossing door er twee roestvrijstalen pinnen doorheen te plaatsen, in een met houtskool doordrenkte siliciumpolymeerlaag aan de onderkant van een glazen petrischaal. Vervolgens isoleer je chirurgisch de achterste cerebrale slagaders van ongeveer 0,3 tot 0,5 centimeter segmenten van de achterste communiceren en basilaire slagaders. Gebruik roestvrijstalen pinnen om beide geïsoleerde achterste hersenslagaders in de dissectieoplossing in de petrischaal te beveiligen.

Reinig vervolgens de geïsoleerde achterste cerebrale slagaders zorgvuldig door het verwijderen van bindweefsel met behulp van geslepen fijngepuntige tangen. Snijd de intacte slagaders in een tot twee millimeter segmenten voor enzymatische spijsvertering. Bereid in deze procedure het trituratieapparaat voor met behulp van een microscoop, een camera en een aluminiumfase met een kamer en micromanipulatoren.

Zet een microsysuit met een pompcontroller naast het podium en het monster. Volgende volledig backfill een titratie pipet met minerale olie en zet het over de microsyreren zuiger. Dan met behulp van de microsyringe met de pomp controller trekken ongeveer 130 nanoliter van dissociatie oplossing in de pipet, terwijl de afwezigheid van luchtbellen.

Plaats vervolgens intacte arteriële segmenten in één milliliter dissociatieoplossing met de vereiste concentraties enzymen in een glazen buis van 10 milliliter. Incubeer bij 34 graden Celsius gedurende 10 tot 12 minuten voor gedeeltelijke spijsvertering. Vervang na de spijsvertering de enzymoplossing door vijf milliliter verse dissociatieoplossing.

Breng met behulp van een pipet van één milliliter één segment over in de kamer met dissociatieoplossing bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de pipet in de dissociatieoplossing in de kamer en plaats deze dicht bij het ene uiteinde van het verteerde vat. Stel een snelheid in binnen het bereik van twee tot vijf nanoliters per seconde op de pompcontroller voor zachte trituratie.

Tijdens het bekijken door 100 keer tot 200 keer vergroting in te trekken en uitwerpen van de arteriële segment te scheiden gladde spiercellen, terwijl de productie van een endotheel buis. Gebruik indien nodig zorgvuldig fijngepunte tangen om gescheiden adventitia en interne elastische lamina van de endotheelbuis te scheiden. Bevestig dat alle gladde spiercellen zijn gescheiden en dat alleen endotheelcellen blijven als intacte buis.

Met behulp van micromanipulatoren, zet elk uiteinde van de endotheelbuis op de glazen deksel slip van de superfusie kamer met borosilicaat glas pinning pipetten. Was de gescheiden adventitia en gladde spiercellen uit de kamer. En vervang de dissociatieoplossing door twee molaire meer calciumchloride PSS.

Breng het mobiele platform met beveiligde endotheelbuis over op de microscoop van superfusie en experimentele installatie. Gebruik vervolgens zes schone reservoirs van 50 milliliter voor continue levering van PSS en de respectieve geneesmiddelenoplossingen tijdens het experiment. Gebruik de in-line flow control valve om handmatig de stroomsnelheid zo consistent als laminer stroom, terwijl bijpassende stroom feed vacuüm zuigkracht.

Breng PSS ten minste vijf minuten naar de kamer voor de superfusie van de endotheelbuis voordat u de achtergrondgegevens opneemt en de kleurstof laadt. Om het membraanpotentieel gelijktijdig te meten met intracellulaire calciumconcentratie, trekt u een scherpe elektrode en vult deze met twee molaire kaliumchloride om cellen met fura-2 kleurstof op te nemen. Om de intracellulaire koppeling via kleurstofoverdracht te bestuderen, vult u de micro-elektrodrode op met 0,1%propidiumjodide opgelost in twee molaire kaliumchloride.

Plaats vervolgens de elektrode over een zilverdraad bekleed met chloride in de pipethouder bevestigd aan een elektrometer hoofdtrap beveiligd met een micromanipulator. Gebruik de micromanipulator om de punt van de elektrode kort in de stromende PSS in de kamer te plaatsen, terwijl u door de viervoudige doelstelling kijkt. Vervolgens, stel het rustende membraan potentieel op nul als consistent met geaard bad potentieel.

Gebruik indien gewenst hoorbare basislijnmonitoren die zijn gekoppeld aan elektrometers om geluidspitch te associëren met mogelijke opnames. Verhoog daarna de vergroting tot 400 keer met behulp van een 40-keers objectieve en plaats de punt van de elektrode net over de cel van de endotheelbuis. Pas het fotometrische venster aan met behulp van de fotometriesoftware om zich te concentreren op ongeveer 50 tot 80 endotheelcellen.

Plaats vervolgens voorzichtig de elektrode in een van de cellen van de endotheelbuis met behulp van de micromanipulator en wacht minstens twee minuten tot het rustende membraanpotentieel is gestabiliseerd. Zodra het rustmembraanpotentieel stabiel is bij de verwachte waarde, schakelt u de fotomultiplierbuis op de fluorescentie-interface in bij afwezigheid van licht en begin met de verwerving van de intracellulaire calciumconcentratie door fura-2 afwisselend op 340 en 380 nanometer te opwekken terwijl ze de bloeiemissie op 510 nanometer verzamelt. Zodra gelijktijdige metingen van membraanpotentieel en intracellulaire calciumconcentratie zijn vastgesteld, moet de superfusie van endotheelbuis met PSS bij een constante laminaire stroomsnelheid vóór de toepassing van geneesmiddelen ongeveer vijf minuten toestaan.

Breng het geneesmiddel bereid in PSS aan op de superfusiekamer met een constante stroomsnelheid. Tijdens de behandeling van geneesmiddelen meet het membraanpotentieel in de F340/F380-verhoudingen tegelijkertijd. Zodra het experiment is gedaan, trek de elektrode uit de cel.

Stop vervolgens de respectievelijke opnames van membraanpotentieel en intracellulaire calciumconcentratie en sla de bestanden op voor gegevensanalyse. Dit is een differentiële interferentie contrast beeld van een muis cerebrale arteriële endotheel buis, aangepast voor experiment in fotometrische venster met behulp van een 40 keer doelstelling. Een scherpe elektrode wordt in een cel geplaatst, zoals bovenaan het beeld wordt weergegeven.

Hier zijn de voorbeelden van ruwe sporen voor gelijktijdige meting van F340/F380 ratio en membraan potentieel in reactie op 100 micromolar ATP. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals confocale fluorescerende microscopie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot microdomeinsignalering van endotheelcalcium en reactieve zuurstofsoorten, als voorbeelden. In het algemeen zal deze techniek de weg blijven effenen voor onderzoeken in cellulaire fysiologie om vasculaire functie en veroudering in de bloed- en lymfecirculatie te onderzoeken.