Name: Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Leer gedrags- en fysiologische analyse in een zebravis epilepsiemodel door DEPDC5 knockdown. Deze methode onderzoekt aanvalachtige activiteit en neurale excitabiliteit bij Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de medewerkers van het ICM-elektrofysiologisch platform bedanken waar de neurofysiologische experimenten werden uitgevoerd. We bedanken ook Anca Marian voor de technische hulp. SC werd ondersteund door de Trampoline Grant #21488. EK werd ondersteund door de AFM Grant #18469 en ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC werd ondersteund door PhD-prijzen van de Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) en ARSLA. Voor AD en RM werd dit werk ondersteund door drie subsidies van de Roemeense nationale autoriteit voor wetenschappelijk onderzoek en innovatie, CNCS-UEFISCDI (projectnummers PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 en COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), een subsidie van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie - subsidieovereenkomst nr. 668863-SyBil-AA, en een subsidie van de National Science Foundation NSF-IOS-1656830 gefinancierd door de Amerikaanse overheid.

Experimentele procedures werden goedgekeurd door de nationale en institutionele ethische commissies.
1. Voorbijgaande knock-down van het DEPDC5-gen in zebravisembryo
<ol><li>Voorbereiding van gereedschappen:
	<ol>
<li>Bereid silicium elastomeer-gecoate injectie Petrischalen: Meng de basis en het uithardingsmiddel van de kit (zie Tabel met materialen) in een verhouding van 10:1. Vul een petrischaaltje van 35 mm halverwege met het mengsel. Wacht tot het silicium is hard voordat u het gebruikt (dit kan enkele dagen duren).</li>
		<li>Bereid 1,2 mmol/L stamoplossingen van antisense morfolino oligonucleotiden (AMO; zie Materiaaltabel). Voeg 250 μL steriel water toe aan 300 nmole lyofiliseerde AMO om een stamoplossing van 1,2 mmol/L te verkrijgen. Voor volledige oplossing verwarmt u de injectieflacons gedurende 5 minuten op 65 °C. Vortex kort. Sluit de buisdop af met een plastic film (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Bereid voor de controlereddingsexperimenten een expressieplasmide voor dat het menselijke cDNA van DEPDC5 (zie Tabel met materialen)bevat, gekloond in de pCS2-ruggengraat of een vergelijkbaar zebraviscompatibel expressieplasmide. Als negatieve controle werd een mutatie geïntroduceerd die een vroeg stopcodon veroorzaakte (p.Arg487*) in het cDNA.</li>
		<li>Bereid embryowater voor: 0,06 g/L aquariumzout (zie Materialentabel) in omgekeerd osmosewater + 0,5 mg/L methyleenblauw.</li>
		<li>Bereid op de dag van de injectie micro-injectie borosilicaatglasnaalden met behulp van een trekker (zie Tabel met materialen). Stel de juiste temperatuurinstellingen in op de naaldentrekker. Gebruik een 10 cm lang, 1/0,5 OD/ID mm borosilicaatglascapillair om twee haarvaten van ~5 cm te genereren met dunne uiteinden met een lengte van ongeveer 1 cm.</li>
		<li>Als de punt van de naalden erg fijn is, waardoor het uitwerpen van de oplossing wordt voorkomen, breek dan het uiteinde van de taps toelopende punt met een tang onder een microscoop.</li>
		<li>Bereid vlak voor de injectie de werkoplossingen van AMO's voor. Bereid altijd een nieuwe oplossing om de reproduceerbaarheid van de resultaten te garanderen. Verwarm de injectieflacons met AMO-voorraad gedurende 5 minuten op 65 °C. Bereid een injectiemonster van 5 μL met Fast Green-kleurstof (0,02% eindconcentratie, zie tabel met materialen)en de AMO verdund bij de werkconcentratie in water.</li>
		<li>Bepaal de werkconcentratie van de AMO empirisch voor elk gen met behulp van een dosisresponscurve. De werkconcentratie vertegenwoordigt een concentratie waarbij de AMO effectief is in het neerhalen van het gen zonder algemene toxiciteit te veroorzaken, zoals grove morfologische defecten. Doorgaans liggen de AMO-werkconcentraties in een bereik van 0,2 mmol/l tot 1 mmol/l (0,4 mmol/l werd bepaald als de effectieve concentratie voor dit onderzoek18). Injecteer de controle Mismatch morpholino in dezelfde concentratie als de effectieve AMO.</li>
		<li>Vortex de buizen en centrifugeer kort om de druppels naar de bodem van de buizen te brengen.</li>
		<li>Bereid voor reddingsexperimenten een injectiemonster van 5 μL voor waarbij de AMO wordt verdund bij de werkconcentratie en het cDNA-expressieplasmide verdund in water tot een empirisch te bepalen eindconcentratie. Voor de expressie van DEPDC5 en het negatieve controleplasmide was 100 ng/μL effectief voor fenotypische redding.</li>
	</ol></li>
	<li>Embryopreparaat:
	<ol>
<li>De dag voorafgaand aan de micro-injectie, zet de zebravis paring tanks. Verwijder de ochtend van de injectie de verdelers om het paaien mogelijk te maken. Verzamel de eieren in petrischaaltjes van 100 mm gevuld met embryowater met behulp van een fijne zeef. Injecteer binnen 20-30 minuten na het verzamelen, terwijl de eieren zich in het eencellige stadium bevinden.</li>
		<li>Pluk 60-80 eieren met een plastic Pasteur-pipet en schik ze in de met silicium beklede petrischaal voor injectie. Het siliconen oppervlak voorkomt dat de eieren glijden tijdens de injecties. Verwijder het grootste deel van het embryowater en laat net genoeg over om de eieren halverwege te bedekken.</li>
	</ol></li>
	<li>Micro-injecties:<ol>
<li>Vul een glazen naald met injectieoplossing. Plaats de naald verticaal in een van de buisjes met de injectieoplossing en zorg ervoor dat het onderste uiteinde van de naald de oplossing raakt. Wacht enkele minuten totdat de gekleurde injectieoplossing capillariteit stijgt en zichtbaar is aan de punt van de naald.</li>
		<li>Monteer de gevulde naald op de injecteergreep van de micro-injector (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Schakel de luchtcompressor in en pas de drukinstelling aan om een injectievolume van ~ 2 nL te genereren.</li>
		<li>Om het volume van de geïnjecteerde oplossing te berekenen, plaatst u een druppel minerale olie op een microtoomschuif. Injecteer de kleurstofhoudende oplossing met behulp van de ingestelde druk- en tijdparameters. Meet de diameter van de geïnjecteerde vloeistofbol en bereken het totale volume met behulp van de formule Volume=4/3*π*(d/2)3, waarbij d=de gemeten diameter van de geïnjecteerde bolus.</li>
		<li>Injecteer met behulp van een ontledende binoculaire microscoop met een 4X-vergroting de eieren in het eencellige stadium door het chorion en de dooier te passeren en de oplossing rechtstreeks in de cel te projecteren.</li>
		<li>Verzamel de geïnjecteerde embryo's in een petrischaaltje van 100 mm met embryowater, label de schaal en incubeer ze bij 28 °C.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de temperatuur van de incubator stabiel is in de loop van de tijd, omdat de ontwikkelingssnelheid van embryo's thermogevoelig is. De groei zou bijvoorbeeld worden versneld bij hogere temperaturen en de ontwikkelingsfase is van cruciaal belang voor een goede beoordeling van het fenotype24.</li>
		<li>Controleer de kwaliteit van de eieren 6-8 uur na injectie en verwijder dode en onbevruchte embryo's met behulp van een plastic Pasteur-pipet.</li>
		<li>Tel en verwijder de volgende ochtend dode embryo's in elk gerecht met een plastic Pasteur-pipet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Gedragsanalyse
<ol><li>Globale activiteitsanalyse bij 28 hpf:
	<ol>
<li>Voer de test de middag van de dag na micro-injectie (28 hpf) uit en zorg ervoor dat het tijdstip van de dag waarop de test wordt uitgevoerd consistent is over experimenten om een geldige statistische analyse uit te voeren, aangezien de ontwikkeling van embryo's zeer snel is.</li>
		<li>Vul een schaal van 35 mm (testschaal) met embryowater en laat deze gedurende ten minste 15 minuten opwarmen in de couveuse (28 °C) voordat de test wordt gestart.</li>
		<li>Plaats een op maat gesneden plastic gaasrooster (1,2x1,2 mm) op de bodem van de testschaal.</li>
		<li>Laat een andere experimentator de volgorde van testen van de embryo's randomiseren en de namen van de te testen omstandigheden maskeren.</li>
		<li>Zorg ervoor dat het sterftecijfer niet verandert tussen omstandigheden en in vergelijking met niet-geïnjecteerde embryo's om de specificiteit van het fenotype te waarborgen. Het percentage dode embryo's onder alle omstandigheden mag niet hoger zijn dan 10-13%18.</li>
		<li>Plaats 10-12 embryo's nog in hun chorion op het plastic gaas met behulp van een plastic Pasteur pipet. Vul de testschaal met voldoende embryowater om de embryo's ondergedompeld te houden, maar niet te laten drijven. Verplaats de embryo's indien nodig voorzichtig met behulp van een plastic punt om ze op het rooster te plaatsen.</li>
		<li>Gebruik een videocamera (zie Tabel met materialen)die aan een dissectiemicroscoop is bevestigd, registreer de spontane spoelactiviteit gedurende een bepaalde tijdsduur (video's van 10-20 minuten zijn meestal voldoende om representatieve monsters van activiteitsuitbarstingen te verkrijgen voor de kwantificering)</li>
		<li>Breng de embryo's terug naar hun respectievelijke schaal en plaats ze terug in de couveuse. Herhaal het experiment met zoveel embryo's als nodig is voor elke aandoening (zoals bepaald door een 90% vermogensanalyse).</li>
		<li>Om de totale spontane beweging te analyseren, gebruikt u een ZebraLab-systeem (zie Tabel met materialen). Gebruik de activiteitskwantificeringsmodule om de opgenomen video te uploaden en de trackingarena's rond elk embryo te ontwerpen. Stel de vries- en barstdrempel in op respectievelijk 10 en 50.</li>
		<li>Voer de geautomatiseerde videoanalyse uit, die de totale activiteit in elk van de gedefinieerde arena's kwantificeert, herstel vervolgens de dataset als een spreadsheet en voer de analyse uit met behulp van een data-analysesoftware.</li>
	</ol></li>
	<li>Touch-Evoked-Escape-Response (TEER) bij 48 hpf:
	<ol>
<li>Voer de test 's ochtends twee dagen na de injectie uit (48 uur na de bevruchting).</li>
		<li>Ten minste 2 uur voorafgaand aan het testen, dechorioneer de embryo's met behulp van een fijne tang. Zorg ervoor dat het tijdstip van de dag voor de dechorionatie en de gedragstest consistent is ten opzichte van experimenten.</li>
		<li>Vul een schaal van 130 mm (testschaal) met embryowater en laat deze ten minste 15 minuten opwarmen in de couveuse (28 °C) voordat de test wordt gestart.</li>
		<li>Tel en verwijder dode en morfologisch misvormde larven. Noteer de nummers voor elke aandoening.</li>
		<li>Laat een andere experimentator de volgorde randomiseren en de namen van de te testen omstandigheden codificeren.</li>
		<li>Monteer de camera (zie Materialentabel) over de testschaal en zorg ervoor dat de hele testschotel zich binnen het gezichtsveld bevindt. Het plaatsen van een liniaal binnen het gezichtsveld biedt een interne kalibratie voor afstand.</li>
		<li>Plaats met een plastic Pasteur-pipet een embryo in het midden van de testschaal en begin met de opname met een acquisitiesnelheid van 30 fps.</li>
		<li>Raak met een fijne plastic punt de staart van het embryo lichtjes aan met een flikkerende beweging.</li>
		<li>Stop de opname wanneer de larve zijn beweging heeft beëindigd.</li>
		<li>Haal het embryo uit de testschaal en plaats het in een nieuwe schaal gevuld met embryowater. Herhaal de test met zoveel embryo's als nodig is voor elke aandoening (zoals bepaald door een 90% vermogensanalyse).</li>
		<li>Breng de embryo's terug naar hun oorspronkelijke schaal en plaats ze terug in de couveuse.</li>
		<li>Om de parameters van het zwemgedrag te analyseren, laadt u de opgenomen video naar ImageJ-analysesoftware. Download en installeer de Manual Tracking plugin van ImageJ (zie Tabel met materialen). Start de plug-in door Tools | Plugin | Handmatige tracking in het menu.</li>
		<li>Introduceer in het dialoogvenster de gekalibreerde schaal van de afbeelding. Het opnemen van een liniaal in het cameraveld vergemakkelijkt de conversie van cm naar pixels.</li>
		<li>Selecteer Track toevoegen en start de trajecttracering door op de afbeelding van de zebravislarve in het eerste frame te klikken. De frames gaan automatisch vooruit met elk punt dat aan de tracering wordt toegevoegd.</li>
		<li>Blijf de beweging volgen tot het einde van de zwemaflevering.</li>
		<li>Selecteer Track beëindigen in het trackingvenster, haal de X-Y-coördinaten op en bereken de totale afstand, snelheid en draaihoek.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Elektrofysiologische analyse
<ol><li>Reagens en gereedschapsvoorbereiding:
	<ol>
<li>Bereid 1% agarose voor in embryowater (zie rubriek 1.1.4). Verwerk de vloeistof in microcentrifugebuizen en bewaar deze op een verwarmingsblok bij 42 °C om te voorkomen dat de agarose uithardt.</li>
		<li>Bereid de opnameoplossing (in mmol/l): NaCl 134, KCl 2.9, CaCl2 2.1, MgCl2 1.2, glucose 10, HEPES 10, pH 7.8.</li>
		<li>Trek borosilicaatglas micropipettes met een puntopening van 1,5-2 μm (5-6 Mm2·kg·s−3· A−2 weerstand) ongepolijst.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van zebravislarven voor elektrofysiologie:
	<ol>
<li>Plaats de vis in een petrischaaltje met glazen bodem (zie Materialentabel)en verwijder overtollige extracellulaire media om ervoor te zorgen dat de vis zo dicht mogelijk bij de dekslip wordt gebracht.</li>
		<li>Voeg met behulp van een plastic Pasteur pipet warme vloeistof agarose toe op en rond de larve. Gebruik net genoeg agarose om de vis te bedekken. Terwijl de agarose uithardt, gebruik je een fijne tang om de vis in een rechte positie te oriënteren, ventrale kant naar beneden, in het midden van het gerecht.</li>
		<li>Voeg 2 ml van de opnameoplossing met 10 μM pancuroniumbromide (zie materiaaltabel)toe om neuromusculaire transmissie te blokkeren. De toevoeging van de paralyzer is nodig om artefacten als gevolg van kleine bewegingen tijdens de opnames te elimineren.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektrofysiologische opname
	<ol>
<li>Vul de micropipette met opnameoplossing.</li>
		<li>Meet met de patchklemversterker (zie Materiaaltabel) in spanningsklemconfiguratie de elektrodeweerstand in bad om de juiste waarde te bevestigen.</li>
		<li>Plaats met behulp van een 20x-objectief de kop van de larve in het centrale gezichtsveld en laat de micropipette zakken om de opnamepositie in de hersenen te bereiken, in het optische tectum.</li>
		<li>Schakel de patchklemversterker in op de stroomtang en bevestig de vasthoudstroom op 0 mA.</li>
		<li>Met behulp van een laagdoorlaatfilter van 1 kHz, een acquisitiesnelheid van 1 kHz en een digitale versterking van 10, registreert u spontane activiteit gedurende 60 minuten voor het bepalen van de basisactiviteitsniveaus.</li>
		<li>Voeg na 1 uur na de registratie bij aanvang 200 μL pentylenetetrazol (PTZ, zie Tabel van materialen)oplossing 300 mmol/L toe aan het bad voor een eindconcentratie van 20 mmol/L PTZ.</li>
		<li>Noteer de neuronale activiteit in PTZ nog eens 120 minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bepaling van depolarisatiegebeurtenis
	<ol>
<li>Veldopnamegebeurtenissen hebben een zeer langzame dynamiek (frequenties van belang liggen in het bereik van 0,005-0,2 s-1). Filter daarom het signaal met een lage doorgang (Butterworth 5e orde LPF op 100 s-1) om aliasing te voorkomen. Subsample de opgenomen spanningsgegevens van de acquisitieframesnelheid (in dit geval 1 ks-1) tot 250 s-1 (RAW-signaal).</li>
		<li>Om de tijdstempels voor elke depolarisatiegebeurtenis te identificeren, gebruikt u een DETECTIESIGNAAL, een high-pass gefilterde versie van het opgenomen signaal (Butterworth 1e orde HPF bij 0,01 s-1).</li>
		<li>Door de laagfrequente componenten te elimineren, kan de detectie van depolarisatiegebeurtenissen worden uitgevoerd met behulp van een eenvoudige drempelmethode. Gebruik een vaste drempel voor ruisonderdrukking en gebeurtenisdetectie (0,3 mV werd gebruikt voor dit onderzoek).</li>
		<li>Karakteriseer de depolarisatiegebeurtenis door een reeks drempels die optreden met tijdsintervallen kleiner dan 4 s. Bereken het begin en het einde van de depolarisatiegebeurtenis zoals bepaald uit opeenvolgende reeksen drempeloverschrijdingen. Gebeurtenissen die korter zijn dan 40 ms kunnen worden weggegooid als ruis.</li>
		<li>Bereken de amplitude van de gebeurtenissen in het ongefilterde (RAW-SIGNAAL) om fouten te elimineren als gevolg van het effect van de laagdoorlaatfiltering op de piek van de gebeurtenis. Selecteer de depolarisatiegolf van het onbewerkte signaal met behulp van de tijdstempels die in het gefilterde signaal zijn bepaald. Meet de amplitude als het verschil tussen de maximale en minimale waarden van de wavelet die uit het ruwe signaal is geselecteerd. OPMERKING: De scriptbestanden voor het uitvoeren van stap 3.4 — Bepaling van depolarisatiegebeurtenis — en voor het verkrijgen van Figuur 1 worden geleverd als aanvullend bestand dat aan dit artikel is gehecht.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kabashi, E., Champagne, N., Brustein, E., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+swim+of+things%3A+Recent+insights+to+neurogenetic+disorders+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">In the swim of things: Recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish.</a> Trends in Genetics. 26 (8), 373-381 (2010).</li>
<li>Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Zebrafish+in+personalised+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Power of Zebrafish in personalised medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2017).</li>
<li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. , (2005).</li>
<li>Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+zebrafish+toolkit+for+investigating+the+pathobiology+of+epilepsy+and+identifying+new+treatments+for+epileptic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Building a zebrafish toolkit for investigating the pathobiology of epilepsy and identifying new treatments for epileptic seizures.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2016).</li>
<li>Griffin, A., Krasniak, C., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+epilepsy+treatment+through+personalized+genetic+zebrafish+models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Advancing epilepsy treatment through personalized genetic zebrafish models.</a> Progress in Brain Research. , (2016).</li>
<li>Griffin, A., Hamling, K. R., Knupp, K., Hong, S. G., Lee, L. P., Baraban, S. C. Clemizole and modulators of serotonin signalling suppress seizures in Dravet syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffin%2C+A+%22Brain%22">Brain</a>. , (2017).</li>
<li>Orellana-Paucar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+zebrafish+and+mouse+models+on+the+activity+and+safety+of+ar-turmerone+as+a+potential+drug+candidate+for+the+treatment+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Insights from zebrafish and mouse models on the activity and safety of ar-turmerone as a potential drug candidate for the treatment of epilepsy.</a> PLoS ONE. , (2013).</li>
<li>Baxendale, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+anti-convulsant+properties+in+a+zebrafish+model+of+epileptic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures.</a> Disease Models & Mechanisms. , (2012).</li>
<li>Bar-Peled, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumor+suppressor+complex+with+GAP+activity+for+the+Rag+GTPases+that+signal+amino+acid+sufficiency+to+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1.</a> Science. 340 (6136), 1100-1106 (2013).</li>
<li>Ishida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+DEPDC5+cause+autosomal+dominant+focal+epilepsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies.</a> Nature Genetics. , (2013).</li>
<li>Dibbens, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+DEPDC5+cause+familial+focal+epilepsy+with+variable+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in DEPDC5 cause familial focal epilepsy with variable foci.</a> Nature Genetics. , (2013).</li>
<li>Baulac, S., Weckhuysen, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaulac%2C+S+%22DEPDC5-Related+Epilepsy.+GeneReviews%C2%AE%22">DEPDC5-Related Epilepsy. GeneReviews®</a>. , (1993).</li>
<li>Picard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEPDC5+mutations+in+families+presenting+as+autosomal+dominant+nocturnal+frontal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">DEPDC5 mutations in families presenting as autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.</a> Neurology. , (2014).</li>
<li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+zebrafish+lgi1a+results+in+abnormal+development%2C+brain+defects+and+a+seizure-like+behavioral+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Knockdown of zebrafish lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. , (2013).</li>
<li>Suls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+loss-of-function+mutations+in+CHD2+cause+a+fever-sensitive+myoclonic+epileptic+encephalopathy+sharing+features+with+dravet+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">De novo loss-of-function mutations in CHD2 cause a fever-sensitive myoclonic epileptic encephalopathy sharing features with dravet syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. , (2013).</li>
<li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%2C+behavioral+abnormalities%2C+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+%28STXBP1%29+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS ONE. , (2016).</li>
<li>de Calbiac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEPDC5+knockdown+causes+mTOR-dependent+motor+hyperactivity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">DEPDC5 knockdown causes mTOR-dependent motor hyperactivity in zebrafish.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. , (2018).</li>
<li>Panchaud, N., Péli-Gulli, M. P., De Virgilio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+deprivation+inhibits+TORC1+through+a+GTPase-activating+protein+complex+for+the+Rag+family+GTPase+Gtr1%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Amino acid deprivation inhibits TORC1 through a GTPase-activating protein complex for the Rag family GTPase Gtr1.</a> Science Signaling. , (2013).</li>
<li>Lim, K. R. Q., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eteplirsen+in+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Drug Design, Development and Therapy. , (2017).</li>
<li>Kok, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetic+screening+reveals+poor+correlation+between+morpholino-induced+and+mutant+phenotypes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish.</a> Developmental Cell. , (2015).</li>
<li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. , (2015).</li>
<li>Stainier, D. Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. , (2017).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+an+official+public%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics an official public. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Møller, R. S., Dahl, H. A., Helbig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+next+generation+sequencing+to+epilepsy+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , (2015).</li>
<li>Allen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+mutations+in+epileptic+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo mutations in epileptic encephalopathies.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Dunn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+methods+for+diagnosis+of+epilepsy+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing methods for diagnosis of epilepsy syndromes.</a> Frontiers in Genetics. , (2018).</li>
<li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+epilepsy+research%3A+Legacies+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Animal models in epilepsy research: Legacies and new directions.</a> Nature Neuroscience. , (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+an+antisense+knockdown+zebrafish+model+of+Dravet+syndrome%3A+Inhibition+of+epileptic+seizures+by+the+serotonin+agonist+fenfluramine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of an antisense knockdown zebrafish model of Dravet syndrome: Inhibition of epileptic seizures by the serotonin agonist fenfluramine.</a> PLoS ONE. , (2015).</li>
<li>Swaminathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+mTOR-Independent+Role+of+DEPDC5+in+Regulating+GABAergic+Network+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-canonical mTOR-Independent Role of DEPDC5 in Regulating GABAergic Network Development.</a> Current Biology. , (2018).</li>
<li>Samarut, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-Aminobutyric+acid+receptor+alpha+1+subunit+loss+of+function+causes+genetic+generalized+epilepsy+by+impairing+inhibitory+network+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">γ-Aminobutyric acid receptor alpha 1 subunit loss of function causes genetic generalized epilepsy by impairing inhibitory network neurodevelopment.</a> Epilepsia. , 2061-2074 (2018).</li>
<li>Turrini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+neuronal+activity+during+seizures+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of neuronal activity during seizures in zebrafish.</a> Scientific Reports. , (2017).</li>
<li>Rosch, R. E., Hunter, P. R., Baldeweg, T., Friston, K. J., Meyer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+and+dynamic+causal+modelling+reveal+brain-wide+changes+in+effective+connectivity+and+synaptic+dynamics+during+epileptic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging and dynamic causal modelling reveal brain-wide changes in effective connectivity and synaptic dynamics during epileptic seizures.</a> PLoS Computational Biology. , (2018).</li>
<li>Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+Electrophysiological+Recording+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2013).</li>
<li>Afrikanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+Zebrafish+Pentylenetetrazol+Seizure+Model%3A+Locomotor+versus+Electrographic+Responses+to+Antiepileptic+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Validation of the Zebrafish Pentylenetetrazol Seizure Model: Locomotor versus Electrographic Responses to Antiepileptic Drugs.</a> PLoS ONE. , (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Epilepsie is een complexe neurologische ziekte, met een breed scala aan etiologieën die beginnen te worden opgehelderd met de komst van genetische sequencingtechnologieën25,26,27. Veelzijdige diermodellen zijn essentieel voor een efficiënte translationele strategie die zowel inzichten zal opleveren in de pathologische mechanismen van genetisch verbonden epilepsieën, als gerichte therapieën voor de verschillende vormen van deze aandoening. Zebravismodellen zijn zeer effectief geweest in het reproduceren van belangrijke kenmerken van epilepsie en het bieden van betrouwbare uitlezingen voor anti-epileptische screening van geneesmiddelen5,28. Spontane aanvallen kunnen worden gedetecteerd bij genetisch gemodificeerde zebravissen15,29,30,31 en neurofysiologische analyse in deze modellen28 heeft de neuronale basis van het epileptisch-achtige gedrag bevestigd32,33. Kleine zebravislarven zijn vatbaar voor chemische schermen in 96-well-formaat met behulp van geautomatiseerde detectie van eenvoudig gedrag, zoals spontaan zwemmen, wat een snelle detectie van potentiële therapieën mogelijk maakt.
Het HIER gepresenteerde DEPDC5 knock-down model wordt verkregen door injectie van AMO in het zebravisembryo om genexpressie tijdens de ontwikkeling te blokkeren. Dit model presenteert verschillende keystone fenotypische kenmerken tijdens verschillende tijdstippen van larvale ontwikkeling, die kunnen worden gebruikt als indicatoren van therapie-efficiëntie tijdens een chemisch of genetisch screeningsprotocol. Het AMO-gemedieerde gen knock-down is een krachtige techniek, die voordelen biedt ten opzichte van chemisch geïnduceerde aanvalsmodellen, omdat het specifiek gericht is op de expressie van een gen van belang, waardoor de onderliggende pathogene mechanismen die worden veroorzaakt door een genetische mutatie kunnen worden geïdentificeerd. Chemische inductoren, die niettemin krachtige hulpmiddelen zijn voor medicijnscreenings, kunnen werken via meerdere cellulaire routes die mogelijk niet altijd relevant zijn voor de genetische mutatie die wordt bestudeerd. Hoewel AMO-injectie op zichzelf een eenvoudige techniek is wanneer deze door de experimentator wordt beheerst, biedt het ook een aantal beperkingen. De injecties moeten worden uitgevoerd in het embryo van het eencellige stadium; in onze handen verhoogden injecties in latere stadia de variabiliteit van het fenotype aanzienlijk. Dit beperkt de beschikbare tijd voor injectie; daarom is een strategie om eieren voor injectie in een tijdsvolgorde te genereren nuttig. We gebruiken routinematig 4-5 kruisen die we openen met intervallen van 15-20 minuten, waardoor de injectie van één koppeling mogelijk is voordat we de volgende verkrijgen. Verder moet ervoor worden gezorgd dat het fenotype op dezelfde tijdstippen tussen verschillende experimenten wordt beoordeeld, omdat stereotiep gedrag snel evolueert tijdens de eerste dagen van ontwikkeling. Het volume en de concentratie van AMO's moeten ook zorgvuldig worden gecontroleerd, omdat algemene toxiciteit als gevolg van het injecteren van overmatige hoeveelheden het specifieke fenotype zal maskeren. De verschillende controles die in de inleiding worden gepresenteerd, zijn essentieel voor het bepalen van de juiste injectiedosis en het bijbehorende fenotype.
Veldopnamen van het larvale zebravisbrein zijn een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van de schadelijke effecten van genetische mutaties die betrokken zijn bij verschillende hersenaandoeningen op de wereldwijde neuronale activiteit34. Depolarisatiegebeurtenissen die onder deze experimentele omstandigheden worden gezien, zijn een gevestigde methode voor het beoordelen van elektrofysiologische effecten van geneesmiddelen in verschillende epileptische omstandigheden15,35. De beoordeling van deze effecten is echter meestal kwalitatief gedaan in plaats van kwantitatief, en met een subjectieve waarnemer als actor in de analyse. Hier ontwikkelen we een automatische detectiestrategie die objectief de snelheid van depolarisaties, hun amplitude en duur kan kwantificeren en de voortgang van deze parameters in de loop van de tijd of met verschillende genetische of farmacologische interventies kan evalueren.
De hier gepresenteerde representatieve resultaten tonen de verwachte veldactiviteit van het DEPDC5 knock-down genetisch model in vergelijking met een Mismatch-controle bij 4-6 dpf zebravissen, voor en na de toepassing van PTZ om epileptiform-achtige elektrografische activiteit te introduceren. Eerder hebben we een significante toename van de basale activiteit van de DEPDC5 knockdown-toestandaangetoond 18. Hier laten we zien dat de respons van deze twee aandoeningen op PTZ, een chemische epileptiforme activiteitsinductor, een vergelijkbaar traject in de tijd heeft, beginnend met een periode van relatief lage frequentie, hoge amplitude depolarisatiegebeurtenissen en doorgaand met een periode van hogere frequentie, lagere amplitude depolarisatiegebeurtenissen. Veldopnamegebeurtenissen hebben een langzame dynamiek (frequenties van belang liggen in het bereik van 0,005-0,2 s-1), daarom worden zowel low-pass als high-pass filters in dit protocol gebruikt om de gebeurtenissen van belang te isoleren. Na het elimineren van de laagfrequente ruis, wordt de detectie van depolarisatiegebeurtenissen uitgevoerd met behulp van een eenvoudige drempel. Aangezien de statistieken van het signaal sterk worden beïnvloed door de aanwezigheid van depolarisatiegebeurtenissen, konden we de standaarddeviatie van het totale signaal niet gebruiken om deze drempel te bepalen. De variabiliteit van de waarde van de standaarddeviatie tussen datasets was groter dan de waargenomen opnameruisniveaus. Daarom hebben we na visuele inspectie van de sporen een vaste waarde van de drempel van 0,3 mV gebruikt om de vertekening veroorzaakt door verschillende niveaus van depolarisatieactiviteit te voorkomen.
Het beschreven protocol biedt een gestandaardiseerde en eenvoudige methode voor het evalueren van het motorische gedrag en de neuronale veldactiviteit, via extracellulaire stroomklemspanningsregistratie in combinatie met automatische detectie van depolarisatiegebeurtenissen in het optische tectum, om epileptiform-achtige fenotypen in zebravismodellen te karakteriseren.

Vanwege zijn kleine omvang, eileiderontwikkeling en transparantie in vroege stadia van ontwikkeling, is zebravis naar voren gekomen als een waardevol gewerveld organisme voor het modelleren van menselijke ziekten zo divers als cardiovasculaire, kanker of neurologische aandoeningen1,2. Zebravis combineert de voordelen van een gewerveld dier, waaronder het hoge behoud van orgaanarchitectuur en genetische code, met de kleine omvang en het gemak van genetische manipulatie van eenvoudigere modelorganismen, waardoor zowel fundamentele studies als translationele toepassingen worden vergemakkelijkt. Met name de toepasselijkheid voor geautomatiseerde screening van gedrag en fluorescerende markers van cellulaire processen met hoge doorvoer heeft zebravissen tot een bijzonder aantrekkelijk model voor epilepsieonderzoek gemaakt. Dit is aangetoond door een hoge toename in het laatste decennium van het aantal publicaties met chemisch geïnduceerde en / of genetische modellen van epilepsie3,4,5 en, meer recent, rapporten van veelbelovende therapieën verkregen uit chemische schermen in deze modellen6,7,8.
DEPDC5 is lid van het GATOR1-complex, een negatieve regulator van mTOR-signalering9. Mutaties in het DEPDC5-gen zijn voor het eerst ontdekt in 2013 in probands die lijden aan autosomaal dominante focale epilepsieën10,11en zijn sindsdien gemeld in een aantal klinische aandoeningen geassocieerd met focale epileptische manifestaties en focale corticale dysplasie12. De grote meerderheid van de gerapporteerde mutaties wordt voorspeld om het functieverlies van het gen12te veroorzaken , en dit werd formeel aangetoond voor een aantal DEPDC5 gemuteerde transcripten die het doelwit zijn van onzin gemedieerd mRNA-verval12,13. In overeenstemming, knock-down van de gen ortholoog in zebravissen met behulp van antisense morfolino oligonucleotiden (AMO's) resulteert in een aantal kenmerken die gebruikelijk zijn voor epileptische modellen in dit organisme, waaronder hyperactiviteit, draaiwielachtig zwemmen, spontane aanvallen en verhoogde neuronale activiteit14,15,16,17,18. Interessant is dat behandeling met rapamycine, een remmer van mTOR-signalering, de gedragskenmerken van dit model18omkeerde , ter ondersteuning van de hypothese dat DEPDC5-functieverlies epilepsie kan veroorzaken als gevolg van een misregulatie van de mTOR-route9,19.
Transient knock-down van genexpressie in vivo met behulp van antisense oligonucleotiden die de morfolinomodificatie dragen, is een waardevol hulpmiddel geweest voor het bestuderen van de rol van specifieke genen, vergelijkbaar met si / shRNA-gebaseerde technieken. Onlangs hebben op AMO gebaseerde strategieën ook klinische toepassingen gevonden, met een eerste AMO-therapie die de FDA-goedkeuring ontving voor de behandeling van Duchenne spieratrofie in 201620. Hoewel werd gemeld dat bij zebravissen het fenotype van acute AMO-gebaseerde gen knock-down niet altijd correleert met de constitutieve knock-outmodellen21, kan dit op zijn minst in sommige gevallen te wijten zijn aan compenserende mechanismen veroorzaakt door constitutieve genetische modificaties22. De kwestie van de specificiteit van het AMO-geïnduceerde fenotype is echter een onbetwistbare zorg die zorgvuldig moet worden aangepakt in studies met deze technologie23. Om de specificiteit van het op AMO gebaseerde knock-down fenotype te waarborgen, zijn verschillende belangrijke controles nodig. Deze omvatten een dosis-responscurve die de selectie van de laagste dosis AMO mogelijk maakt die effectief is voor gen-knock-down, waardoor algehele toxiciteit wordt vermeden als gevolg van de introductie van een overmaat aan genetisch materiaal. Het gebruik van een Mismatch AMO die zich niet richt op een bepaald gebied in het genoom is ook vereist voor het vaststellen van een geschikte dosis en bij het identificeren van een specifiek fenotype. Een tweede AMO die zich richt op een ander gebied van hetzelfde gen, zoals een splice-blocking AMO, is nodig om te bevestigen dat het fenotype te wijten is aan de knock-down van het doelgen. Redding van het knock-down fenotype met het cDNA van het gen, hetzij de menselijke ortholoog of een codon-gemodificeerde versie van het zebravisgen die niet door de AMO kan worden aangevallen, biedt een sterk argument ten gunste van de fenotypespecificiteit. Gebrek aan redding met hetzelfde cDNA met functieverliesmutaties (zoals de introductie van een vroege stopcodons) is een verder bewijs in deze richting.
Hier presenteren we een methode voor het genereren van een zebravis DEPDC5 verlies-van-functie model en het protocol voor gedragsfenotypering op 28 en 48 h na bevruchting (hpf). Bij 28 hpf veroorzaakt de depdc5-functieverlies algehele hyperactiviteit, zoals blijkt uit verbeterde coiling- en twitching-bewegingen van de embryo's in het chorion. Een geautomatiseerd bewegingsdetectiesysteem kan in dit stadium worden gebruikt om de totale activiteit per embryo te kwantificeren. Met 48 pkf vertonen zebravissen stereotiep ontsnappingszwemmen als reactie op aanraking. Bij zebravissen met gereguleerde expressie van DEPDC5is het zwemtraject aanzienlijk kronkeliger dan bij controles, de vis vertoont een "kurkschroef" of "draaiwiel" -achtig patroon, vergelijkbaar met andere gerapporteerde epilepsiemodellen in dit organisme3,4. Elektrofysiologische opnames werden verkregen in het optische tectum bij zebravislarven tussen 4-6 dagen na de bevruchting (dpf) en tonen een baseline toename van neuronale activiteit bij de DEPDC5 knock-down dieren. Het voordeel van dit model is dat het verschillende fenotypische kenmerken op verschillende tijdstippen presenteert, wat nuttig kan zijn bij het monitoren en beoordelen van de werkzaamheid van medicamenteuze therapieën tijdens de ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Aquarium zout&nbsp;</td><td>Instant Ocean, Blacksburg, VA</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglas met filament</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-50-10</td><td>OD: 1.5mm, ID: 0.5 mm</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Depdc5-atg antisense morpholino</td><td>GeneTools, OR, USA</td><td>N/A</td><td>sequentie 5&rsquo;- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>Depdc5-mis antisense morpholino</td><td>GeneTools, OR, USA</td><td>N/A</td><td>sequentie 5&rsquo;- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>Depdc5-splice antisense morpholino</td><td>GeneTools, OR, USA</td><td>N/A</td><td>sequentie 5&rsquo;- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3&rsquo;</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices, CA, USA</td><td>Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green kleurstof</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>F7258</td><td>Stockoplossing van 0,2%</td></tr><tr><td>Glazen bodem petrischalen</td><td>Ibidi, Duitsland</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>68270</td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper 2 camera</td><td>FLIR, BC, Canada</td><td>GRAS-03K2M-C</td><td>voorheen Point Grey Research</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Human wild-type DEPDC5 cDNA</td><td>Dharmacon, Frankrijk</td><td>NM_001242897.1</td><td>&nbsp;Toegang: BC144291 Clone ID 905</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>MathWorks, MA, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Pancuroniumbromide&nbsp;</td><td>Alomone Labs</td><td>P-130</td><td>Stockoplossing van 60 mM in water</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp versterker</td><td>Molecular Devices, CA, USA</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Computergestuurde patch clamp versterker</td></tr><tr><td>pClamp10 acquisitiesoftware</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pentylentetrazol (PTZ)</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>P6500</td><td>Stockoplossing van 300 mM (opgelost in opnameoplossing)</td></tr><tr><td>Pipettrekker</td><td>Narishige, Japan</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatische PicoPump&nbsp;</td><td>WPI, Frankrijk</td><td>PV 820</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit</td><td>Sigma-Aldrich Intl.</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>Overdracht plastic pipetten</td><td>Sigma-Aldrich, Frankrijk</td><td>Z350605</td><td></td></tr><tr><td>Zebralab</td><td>Viewpoint, Frankrijk</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsie is een van de meest voorkomende neurologische aandoeningen, die wereldwijd naar schatting 50 miljoen mensen treft. Recente ontwikkelingen in genetisch onderzoek hebben een groot spectrum van genen blootgelegd die betrokken zijn bij verschillende vormen van epilepsie, wat de heterogene aard van deze aandoening benadrukt. Geschikte diermodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van de pathologische mechanismen die worden veroorzaakt door genetische mutaties die betrokken zijn bij epilepsie en voor het ontwikkelen van gespecialiseerde, gerichte therapieën. In de afgelopen jaren is zebravis naar voren gekomen als een waardevol gewerveld organisme voor het modelleren van epilepsieën, met het gebruik van zowel genetische manipulatie als blootstelling aan bekende epileptogene geneesmiddelen, zoals pentylenetetrazole (PTZ), om nieuwe anti-epileptische therapieën te identificeren. Schadelijke mutaties in de mTOR-regulator DEPDC5 zijn geassocieerd met verschillende vormen van focale epilepsieën en knock-down van de zebravisortholoog veroorzaakt hyperactiviteit geassocieerd met spontane epileptische episodes, evenals verbeterde elektrografische activiteit en karakteristiek draaiwielzwemmen. Hier beschreven we de methode die betrokken is bij het genereren van het DEPDC5-functieverliesmodel en illustreren we het protocol voor het beoordelen van motorische activiteit op 28 en 48 uur na bevruchting (hpf), evenals een methode voor het registreren van veldactiviteit in het zebravisoptische tectum. Een illustratie van het effect van het epileptogene medicijn PTZ op neuronale activiteit in de loop van de tijd wordt ook gegeven.

Figuur 1 toont representatieve spanningssporen van 4-6 dpf zebravislarve extracellulaire veldopnamen in het geval van twee genetische aandoeningen: Mismatch control en DEPDC5 knock-down. In de basislijnperiode van de opname laat DEPDC5 knock-down een hoger voorkomen van spontane gebeurtenissen zien, terwijl de Mismatch-controle zeer weinig fluctuaties vertoont. Deze activiteitspatronen zijn representatief voor de significante toename van neuronale activiteit als gevolg van functieverlies van DEPDC5, zoals we eerder hebben gemeld18. Na PTZ-toepassing laten zowel Mismatch-controle als DEPDC5-knock-down een verhoogd aantal depolarisatiegebeurtenissen zien. Tijdens de eerste periode na PTZ-toepassing (10 - 60 min) wordt een snelheid van 0,8 gebeurtenissen per minuut waargenomen in zowel Mismatch-controle als DEPDC5-knock-down, waar de meerderheid van de gebeurtenissen een hoge amplitude (>1 mV) heeft. Tijdens de laatste responsperiode (60 - 120 min na PTZ-toepassing) neemt de snelheid van depolarisatiegebeurtenissen toe tot ongeveer 1 gebeurtenis per minuut en de meerderheid van de gebeurtenissen heeft een lage amplitude (≤1 mV).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58837/58837fig1.jpg"> Figuur 1: Voorbeeld sporen van veldopnames in het brein van de zebravislarven. (A) Overzicht van 180 min opname voor een Mismatch controlelarve en een DEPDC5 Knock-down. Eerst werd spontane baseline-activiteit geregistreerd, vervolgens werd PTZ toegepast in bad (rode balk). (B) Peri-stimulus tijd histogrammen van de depolarisatiegebeurtenissen voor Mismatch controle en DEPDC5 knock-down. De gebeurtenissen werden geclassificeerd als hoge amplitude (>1 mV - blauw) en lage amplitude (≤1 mV - zwart). (C-E) Voorbeeldsporen van de verschillende perioden van de registratie: (C) spontane activiteit, (D) Hoge amplitudegebeurtenissen tijdens de eerste periode na PTZ-toepassing, (E) Lage amplitudegebeurtenissen tijdens de laatste periode na PTZ-toepassing. Merk op dat de scriptbestanden om deze cijfers te verkrijgen worden geleverd als Aanvullend bestand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/58837fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend bestand: Scriptbestanden voor stap 3.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/Supplementary_File.zip" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en de karakterisering van een zebravismodel van epilepsie als gevolg van de voorbijgaande remming van het DEPDC5-gen.

Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Dit protocol biedt een snelle manier voor het evalueren van de effecten van het neerhalen van het WC5-gen, de meest voorkomende oorzaak van focale epilepsie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we het kunnen gebruiken om de epilepsie te beoordelen, zoals fenotype met behulp van zowel gedrags- als fysiologische kenmerken in verschillende stadia van ontwikkeling. Zet een dag voor de micro-injectie de zebravis paringstanks op.Verwijder op de ochtend van de injectie de verdelers om het paaien mogelijk te maken. Gebruik een fijne zeef om de eieren over te brengen in petrischaaltjes van 100 millimeter, gevuld met embryowater. Kies met behulp van een plastic Pasteur-pipet 60 tot 80 eieren en schik de eieren in een met siliconen gecoat petrischaaltje voor de injectie.we verplaatsen het grootste deel van het water en laten net genoeg over om de eieren halverwege te bedekken. Plaats een glazen naald verticaal in een buis met injectieoplossing. Laat de gekleurde oplossing de buis vullen door capillaire werking gedurende een periode van enkele minuten.Wanneer de injectieoplossing zichtbaar is in de punt van de naald, bevestigt u de naald op de injecteergreep van de micro-injector en schakelt u de luchtcompressor in. Pas de drukinstelling aan om een injectievolume van twee nanoliter te genereren. En om de eieren onder een Ontleedende VerrekijkerMicroscoop te leggen, met een viervoudige vergroting.Steek de naaldpunt door het chorion en de dooier van eentrapsembryo's om de oplossing rechtstreeks in elke cel te injecteren. Breng vervolgens de geïnjecteerde embryo's over in een gelabelde petrischaal van 100 millimeter embryowater en plaats de plaat in een incubator van 28 graden Celsius. Plaats 28 uur na de bevruchting een plastic gaasrooster van 1,2 bij 1,2 millimeter aan de onderkant van de testschaal.Gebruik een plastic Pasteur pipet om 10 tot 12 embryo's in hun chorionen op het plastic gaas te plaatsen. Vul de schaal met voldoende embryowater om het embryo ondergedompeld te houden, maar niet drijvend, en beweeg de embryo's voorzichtig met een plastic punt in positie op het rooster als dat nodig is. Neem vervolgens met behulp van een videocamera die is bevestigd aan een dissectiemicroscoop de spontane spoelactiviteit gedurende 10 tot 20 minuten op.Om de totale spontane beweging te analyseren, gebruikt u de activiteitskwantificeringsmodule in een Zebra-laboratoriumsysteem om de opgenomen video te uploaden en de trackingarena's rond elk embryo te ontwerpen. Stel de vries- en barstdrempels in op respectievelijk 10 en 50. En wanneer de geautomatiseerde video-analyse, die de totale activiteit binnen elk van de gedefinieerde arena's kwantificeert.Herstel vervolgens de dataset als een spreadsheet om de analyse uit te voeren, met behulp van de juiste software voor gegevensanalyse. Gebruik 46 uur na de bevruchting een fijne tang om de embryo's te dechorioneren en vul een testschaal van 130 millimeter met embryowater. Verwarm de testschaal minstens 15 minuten voor de rest in een couveuse van 28 graden Celsius.Om een aanraak-opgeroepen ontsnappingsreactietest uit te voeren, gebruikt u een plastic Pasteur-pipet om een embryo in het midden van de testschaal onder de camera te plaatsen. Begin de opname met een acquisitiesnelheid van 30 frames per seconde. Raak met behulp van een fijne plastic punt de staart van het embryo lichtjes aan met een flikkerende beweging.Het stoppen van de opname, wanneer de larve zijn beweging heeft beëindigd. Breng vervolgens het embryo over naar een nieuwe houder gevuld met vers embryowater en herhaal de test met zoveel embryo's als nodig is voor elke experimentele aandoening. Om de zebravis voor te bereiden op elektrofysiologische analyse, plaatst u één, vier tot zes dagen na de bevruchtingsvis in een petrischaaltje met glazen bodem.Verwijder overtollig, extra matrozenmedium om ervoor te zorgen dat de vis zo dicht mogelijk bij de bodem van het gerecht zit. Gebruik een plastic pasteurpipet om voldoende warme vloeibare agros toe te voegen om de larve te bedekken. Terwijl de agros hardnes, gebruik je een fijne tang om de ventrale kant van de vis naar beneden in het midden van het gerecht te oriënteren.Voeg vervolgens twee milliliter opnameoplossing, met 10 micromolair pancuroniumbromide, toe aan de schotel om neuromusculaire transmissie te blokkeren. Vul vervolgens een micropipetting met opnameoplossing en gebruik een patchklemversterker in de spanningsklemconfiguratie om de elektrodeweerstand in het bad te meten om de juiste waarde te bevestigen. Gebruik een 20x objectief, plaats de kop van de larve in het centrale gezichtsveld en laat de micropipet zakken om de opnamepositie in het optische tectum te bereiken.schakel de patchklemversterker naar de huidige klemconfiguratie en bevestig de vasthoudstroom op nul milliampisch. Met behulp van een laagdoorlaatfilter van één kilohertz en een acquisitiesnelheid van één kilohertz en een digitale winst van 10, registreert u de spontane activiteit van de vis gedurende 60 minuten om de basisactiviteitsniveaus te bepalen. Aan het einde van de nulmeting, bij 143 microliter van een pentylenetetrazoloplossing van 300 millimolair per liter, voor een eindconcentratie van 20 millimol per liter.Noteer de neuronale activiteit van het dier in pentylenetetrazoloplossing gedurende nog eens 120 minuten. Tijdens de basislijnperiode van de registratie vertonen zebravissen vier tot zes dagen na de bevruchting epileptische modellen een hoger voorkomen van spontane gebeurtenissen, terwijl mismatch-controlevissen zeer weinig fluctuaties vertonen. Na pentylenetetrazole-toepassing vertonen zowel mismatch-controle als epileptische modellen zebravissen een verhoogd aantal diepe polarisatiegebeurtenissen.Tijdens de eerste periode na toediening van pentylenetetrazol wordt een snelheid van 0,8 voorvallen per minuut waargenomen bij zowel mismatch-controle als knock-downdieren waarvoor de meerderheid van de voorvallen een hoge amplitude heeft. Tijdens de laatste reactieperiode. De snelheid van depolarisatiegebeurtenissen neemt toe tot ongeveer één gebeurtenis per minuut.En het merendeel van de evenementen heeft een lage amplitude. Bij het uitvoeren van knock-down is het erg belangrijk om de juiste dosis morfos vast te stellen met behulp van een dosisresponscurve en om controles uit te voeren om de niet-specifieke toxiciteiten te voorkomen. Deze druk om te doen maakt verschillende downstream-studies mogelijk, waaronder het testen van de effecten van genetische of chemische modifiers.En het zebravisgedrag en de neurale activiteitenactiviteit om de ontwikkelingseffecten van de DC vijf mutaties te begrijpen.

behavioral-and-physiological-analysis-in-a-zebrafish-model-of-epilepsy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een...

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Ons laboratorium ontwikkelde een nieuwe high-throughput geautomatiseerde imaging systeem dat nuttig is voor de detectie van verschillende gedragingen in 7 dagen oude zebravis larven. Het systeem kan worden gebruikt voor het detecteren van subtiele veranderingen in het gedrag na de larven zijn blootgesteld aan milieu-toxische stoffen of geneesmiddelen.

Geautomatiseerde High-throughput Behavioral Analyses in zebravis Larven

Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten opnamen en manipulatie van neurale activiteit in een intact dier mogelijk maken.

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om stress gedrag in volwassen zebravis te meten. De aanpak maakt gebruik van de aangeboren tendens dat zebravis de voorkeur aan de onderste helft van een tank, wanneer in een stressvolle toestand. Wij beschrijven ook methodes om de analyse met farmacologie te koppelen.

Gedrags benaderingen voor het bestuderen van aangeboren stress in zebravis

Hier presenteren we een protocol om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen.

Calciumbeeldvorming met twee fotonen van de activiteit van de voorhersenen bij zich gedragende volwassen zebravissen

We beschrijven de workflow en data-analyse van een screeningssysteem voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen op basis van de schrikreactie van zebravisembryo's. Het systeem registreert de bewegingen van zebravisembryo's bij blootstelling aan een trillingsstimulus en maakt een geïntegreerde evaluatie van algemene toxiciteit/letaliteit en neuromusculaire toxiciteit mogelijk.

Evaluatie van de toxiciteit van chemicaliën met behulp van een Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

De studie introduceert Zebra II, een geavanceerd systeem voor langdurige ECG-acquisitie en analyse bij zebravissen. Dit systeem beschikt over een onafhankelijk perfusiesysteem en meerpuntselektroden voor het behandelen van meerdere vissen in gecontroleerde omgevingen. De acute effecten van Amiodarone werden beoordeeld en geanalyseerd met wild-type zebravissen.

Zebra II als een nieuw systeem om elektrofysiologische signalen bij zebravissen op te nemen

Dit protocol beschrijft het gebruik van Drosophila-larven om unieke anti-epileptische verbindingen voor de behandeling van epilepsie te identificeren.

Aanvalsactiviteit geïnduceerd door elektroshocks bij Drosophila-larven

Dit protocol stelt een gedragsfenotyperingsparadigma vast bij met MPTP behandelde zebravislarven om Parkinson-achtige motorische en niet-motorische tekorten te evalueren.

Fenotypische profilering van door MPTP geïnduceerde Parkinson-achtige gedragsfenotypes bij zebravislarven op basis van gedragsexperiment

Leer gedrags- en fysiologische analyse in een zebravis epilepsiemodel door DEPDC5 knockdown. Deze methode onderzoekt aanvalachtige activiteit en neurale excitabiliteit bij Danio rerio.

Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Meer video's verkennen