Oprichting van virale infectie en analyse van Host-Virus interactie bij Drosophila Melanogaster

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het virus-host interactie veld over hoe effectief vast te stellen een virale infectie in Drosophila melanogaster. Deze nanoinjectiemethode maakt een nauwkeurige controle van de infectiedosis van het virus mogelijk en kan gemakkelijk worden toegepast op infecties met andere microbiële pathogenen. Begin met het kweken van een keer 10 tot de zevende levensvatbare S2-stercellen per milliliter als losse, semi-aanhangende monolaag in een 10 centimeter celkweekschotel met 10 milliliter complete Schneiders Drosophila Medium zonder extra kooldioxide bij 25 graden Celsius gedurende een uur.

Tijdens de incubatie, resuspend vers ontdooid Drosophila C Virus of DCV tot een veelheid van infectie van 0,01 in een milliliter van compleet medium en virus oplossing toe te voegen aan de celkweek gerechten. Breng de plaat vervolgens drie tot vijf dagen terug naar de 25 graden Celsius incubator. Het virus is klaar voor verzameling wanneer de celmorfologie ziet er wazig en de cultuur medium is vol met zwarte deeltjes indicatief voor celpuin.

Meng de supernatant door pipetting een paar keer voor de overdracht van de hele celcultuur naar een 15 milliliter buis voor lyse van de gastheer cellen op min 80 graden Celsius. Om werkconcentraties van het virus te genereren, ontdooit u de celsuspensie in een waterbad van 25 graden Celsius met constant schudden voordat het celpuin wordt gepeld door centrifugatie. Breng vervolgens de supernatant over in een nieuwe steriele buis van 15 milliliter voor vortexen en aliquot tot 200 microliter virusoplossing per buis.

Om de gemiddelde virusweefselkweek te bepalen, eerste zaad een keer 10 tot de vijf S2-sterrencellen in 100 microliter van compleet medium in acht putten per kolom in 12 rijen van een 96 putplaat. Breng de plaat vervolgens terug naar de 25 graden Celsius incubator. Selecteer willekeurig vijf buisjes virus uit min 80 graden Celsius opslag.

Terwijl de cellen zich vestigen, vul 10 steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen met 450 microliter van steriel compleet medium en voeg 50 microliter virusvoorraad toe aan de eerste 1,5 milliliter buis met 450 microliter van steriel compleet medium dat de suspensies 10 keer per stap verdunt tot de 12e put. Voeg aan het einde van de incubatie 50 microliters van elke verdunning toe aan de juiste put in elke kolom voor die buis van het virus en voeg 50 microliters cultuurmedium zonder virus toe aan één put per kolom als de negatieve controle goed. Plaats vervolgens de plaat in de 25 graden Celsius incubator voor drie dagen en beoordeel het cytopathische effect van elk virus voorraad onder een Brightfield microscoop op een 20X vergroting per dag.

Classificeer een put waarin de cellen er wazig uitzien en het medium vol fragmenten zit als een positieve put en een put waarin de celmorfologie normaal is als negatieve put. Meng voor het fokken grondig 400 microliter van 50 microgram per milliliter Tetracycline met vier gram verse standaard maïsmeelvliegvoedsel en plaats het voedsel 's nachts op vier graden Celsius om de ethanol te verdampen. De volgende ochtend, warm het voedsel op kamertemperatuur en plaats het voedsel en plaats het voedsel en 20 vrouwelijke en 10 mannelijke nieuw afgeschermde volwassen vliegt in een broedfuit voor een drie tot vier dagen fokken incubatie bij 25 graden Celsius en 60% vochtigheid onder een normale licht / donkere cyclus.

Wanneer er genoeg eieren zijn gelegd, verzamel de nieuw afgeschermde volwassen vliegen onder een lichte stroom van kooldioxide en ras de Drosophila weer twee keer zoals net aangetoond. Na drie generaties van Tetracycline behandeling, verzamel vijf vliegen onder een lichte stroom van kooldioxide en homogeniseren de vliegen met 250 microliters van dubbel gedestilleerd water en een paar 0,5 millimeter steriele keramische kralen. Voeg na een minuut 250 microliter 2x buffer A toe aan het monster voor vortexing voordat u de monsters bij min 80 graden Celsius bevriest.

Vervolgens snel ontdooien monsters van min 80 graden Celsius opslag in een 25 graden Celsius waterbad, gevolgd door een 30-minuten incubatie in een 70 graden Celsius waterbad voor het extraheren van de genomische DNA en het versterken van het DNA door polymerase kettingreactie volgens standaard protocollen. Bevestig de afwezigheid van Wolbachia 16 kleine RNA en wsp in elke vlieg homogenaat door gel elektroforese volgens standaard protocollen. Dan achter de Wolbachia-vrije vlieg voorraad op standaard maïsmeel vlieg voedsel zoals aangetoond.

Voor virale infectie, eerst gebruik maken van een stereomicroscoop en dunne tangen om het puntje van een glas capillaire naald te breken om de juiste diameter voor nanoinjectie. Om de injector te monteren, plaats de plafond O-ring en een witte spacer op de metalen zuiger van de injector met de grote kuil naar buiten gericht. Gebruik een spuit uitgerust met een 30-meter naald om de glazen naald te vullen met minerale olie en plaats de naald door de kraag.

Plaats de grotere O-ring rond de basis van de kraag ongeveer een millimeter van het stompe uiteinde van de naald en monteer de naald op de zuiger van de injector. Zet de naald op de zuiger en druk op de lege knop om de zuiger van de microinjector uit te breiden tot er een hoorbaar signaal wordt gehoord. Druk nu op fill om de zuiger vijf millimeter in te trekken en dompel de naald in een 100 plaque-vormende eenheid virale suspensie.

Schud voorzichtig een of ten minste drie flesjes van 20 Wolbachia-vrije mannelijke Drosophila op de injectieschaal. Mannelijke begiftigde vliegen hebben de voorkeur tijdens de paring en reproductie kan vrouwen beïnvloeden. Injecteer vervolgens de thorax van elke vlieg met 50,6 nanoliters van virusoplossing in het iets lichter gekleurde gebied tussen de mesopleura en de pteropleura en meet de DCV-belasting door cytopathische effecttest en kwantitatieve RT PCR van grondvliegen zoals net aangetoond.

Breng na de injectie de vliegen voorzichtig over naar een verse flacon en plaats de flacon in een horizontale positie om te voorkomen dat de vliegen aan het medium blijven plakken terwijl ze herstellen van de anesthesie. De injectie is tijdrovend, maar de DCV replicatie is zeer snel, dus het is erg belangrijk om op te schrijven de exacte tijd op de buis zodra alle van de vliegen van elke flacon zijn geïnjecteerd. Virusinfectie kan leiden tot cellyse en cytopathische effecten worden waargenomen op drie dagen na infectie.

Wolbachia 16s rRNA en wsp primers kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van Wolbachia en Drosophila te detecteren zoals aangetoond. Wolbachia-vrije vliegen vertonen een aanzienlijk verminderde overlevingskans na dcv-infectie en op een dosis-afhankelijke manier. DCV activeert antivirale signaleringstrajecten in de gastheer die van cruciaal belang zijn voor antivirale infectie in Drosophila, zoals blijkt uit de verminderde overlevingskans en verhoogde virale belasting in Dicer-2 mutantvliegen.

Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat besmetting met Wolbachia genotype de gevoeligheid van de Drosophila melanogaster vliegt naar de DCV-infectie kan beïnvloeden. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals een genetisch scherm op grotere schaal worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over onder gedefinieerde gastheergenen die nodig zijn voor virale infectie of antivirale reacties. Na de ontwikkeling ervan maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van menselijke virale ziekte om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan uitbraken van endemische menselijke virale infecties in het Melanogaster-model van Drosophila.

Vergeet niet dat het werken met het virus zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van de juiste beschermingsmiddelen altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.