Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

Mini-endoscopische evaluatie van de dikke darm bij levende muizen biedt belangrijke experimentele ondersteuning voor het onderzoeken van darmmanifestaties van acute graf-versus-gastheerziekte, GvHD, bij allogene, hematopoietische stamceltransplantatie. De niet-invasieve beoordeling van acute GvHD-gerelateerde colitis kan functioneren als een werkende substituut voor goudstandaard histopathologie, waardoor herhaalde dierenoffers om weefselmonsters te verkrijgen overbodig worden. Het aantonen van de procedure zal Vera Buchele zijn, een post-doc van mijn laboratorium.

Een dag na de totale lichaamstraling van de ontvanger BALB / c muizen, plaats een CD-45.1 live 5B6 SJL donor muis in de gevoelige positie op een schone werkende schede, en gebruik een 13-cm gebogen en gekartelde tip van een simkin tang om de vacht te heffen op een achilleshiel. Met behulp van geharde 8,5 cm fijne schaar met rechte uiteinden, insnijden van de huid tussen de tangen en een hiel, het verlengen van de incisie cranially om de verwijdering van de huid en bont uit de achterste ledematen te vergemakkelijken. Wanneer de huid is verwijderd uit de achterste ledematen, gesneden door elke heup, enkel, en knie gewricht.

Bewaar de dij en de steel van elke achterpoot in een enkele petrischaal van 92 mm gevuld met PVS op ijs en verwijder voorzichtig zoveel mogelijk spieren van elk bot, waarbij elk schoongemaakt dijbeen en scheenbeen worden overgebracht in een 50 mL-buis van steriel RPMI 1640-medium op nat ijs. Om het beenmerg te isoleren, breng je één bot tegelijk over in een nieuwe petrischaal van 92 mL gevuld met vers RPMI 1640-medium en gebruik je een scalpel om de uiteinden van elk bot af te snijden. Gebruik vervolgens een 1-mL spuit uitgerust met een 26-gauge naald om de botten met 1 mL vers medium per keer door te spoelen in een 50-mL collectiebuis met 5 mL medium.

Wanneer alle botten zijn gespoeld, voorzichtig pipette de kruimelige beenmerg stukken op en neer meerdere malen om een eencellige suspensie te genereren voordat het filteren van de cellen door middel van een 40-micrometer mesh-screen cel zeef in een nieuwe 50-mL collectie buis. Pellet de cellen door centrifugatie en schort de cellen opnieuw op in 5 mL ammoniumchloride kaliumkaliumbuffer voor een incubatie van drie minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie stopt u de reactie met 10 mL PVS en centrifugeert u de cellen opnieuw.

Schort de pellet opnieuw op in 2 mL verse PVS voor het tellen en zet een zes keer 10 tot de zesde cel aliquot opzij voor downstream flow cytometrische analyse. Gebruik vervolgens een commercieel verkrijgde celzuiveringskit om de CD90.2-positieve T-cellen magnetisch uit te putten uit de enkelcellige suspensie van het beenmerg, volgens de instructies van de fabrikant, en zet een één keer 10 opzij tot de zesde cel aliquot van de T-cel-uitgeput eluaat voor downstream flow cytometrische analyse van de celzuiverheid en samenstelling voor en na de scheiding. Gebruik vervolgens een 1-mL spuit uitgerust met een 30-gauge naald om vijf keer 10 te injecteren tot de vijfde T-cel-uitgeputte beenmergcellen in 100 microliter PVS intraveneus in de retrobulbar ruimte van de veneuze sinus van elk bestraald ontvangend dier.

De volgende dag, plaats een milt geoogst van een donor dier op een 40-micrometer mesh zeef in een 50-mL collectie buis, en gebruik een spuit zuiger om het miltweefsel pers door de zeef in de buis. Was de zeef en zuiger met PVS om alle splenocyten te verzamelen en de cellen te pelleteren door centrifugatie. Nadat rode bloedcellyse is aangetoond, opnieuw opschorten van de witte bloedcellen voor het tellen, en zet een zes keer 10 tot de zesde cel aliquot voor downstream flow cytometrische analyse.

Voor een totale CD3-positieve T-cel isolatie van totale splenocyten, gebruik maken van een commercieel verkrijgbaar celzuivering kit volgens de instructies van de fabrikant, en zet een keer 10 tot de zesde CD3-positieve T-cel aliquot van de positieve cel fractie voor downstream flow cytometrische analyse van de cel zuiverheid en samenstelling voor en na de scheiding. Injecteer vervolgens zeven keer 10 tot de vijfde alloreactive CD3-positieve T-cellen in 100 microliter pvs-cellen intraveneus in de retrobulbarruimte van elke ontvangende muis om GvHD te induceren. Om GvHD-gerelateerde laesies te scoren door mini-endoscopie van het distale colorectale gebied, til je de staart van een ontvangend dier net boven de staartwortel met één hand op en gebruik je de andere hand om de endoscoop via de anus zorgvuldig in het rectum te steken.

Terwijl de luchtstroom het colorectale lumen opblaast, beweegt u de endoscoop langzaam en voorzichtig naar voren in de aborale richting. Om darmletsels te voorkomen, houdt u de endoscoop in het middelste gedeelte van het lumen met behulp van het live videoscherm om te helpen bij deze positionering. Start het opnemen van de videostream en het scoren van de ontsteking, de evaluatie van de GvHD-gerelateerde ontsteking van de dikke darm door het scoren van de parameters zoals geïllustreerd.

Wanneer een scoreplek is gevonden, beweegt u de endoscoop voorzichtig en licht heen en weer om de verschillende parameters te beoordelen. Om de parametertranslucency en ontlastingsconsistentie te beoordelen, plaatst u de endoscoop op een grotere afstand ten opzichte van de darmwand. Om de granulariteit en vasculariteit van de laesie te beoordelen, plaats de endoscoop in de nabijheid van de darmwand en breng u zorgvuldig goed gedoseerde spanning aan op de darmwand met het puntje van de endoscoop.

Na voltooiing van het scoreproces, stop de opname. Vergeleken met controles produceert allogene hematopoieïsche stamceltransplantatie zoals aangetoond een reproduceerbaar robuuste inductie van een systemisch GvHD-fenotype, met geleidelijk toenemende klinische GvHD-scores bij ontvangende dieren. Deze mini-endoscopisch beoordelingscriteria werden specifiek aangepast aan eerder gemelde syngeneïsche colitis in de context van allo-response-driven colitis scoring parameters voor de precieze beschrijving, score, en indeling van darm-GvHD-ziekte-geassocieerde laesies in de distale dikke darm.

Inderdaad, de mini-endoscopisch gebaseerde indeling systeem maakt een gemakkelijke discriminatie van donor-lymfocyten-ontvangende muizen met ernstige tekenen van darmontsteking van controle muizen die in wezen verstoken zijn van GvHD. Invalidatie van de mini-endoscopisch gebaseerde grading systeem histopathologische studies bevestigd dat de dikke darm van muizen ernstig getroffen door GvHD-gerelateerde ontsteking vertonen eveneens sterke histopathologische tekenen van ontsteking. Daarentegen toonden darmweefsels van controlemuizen nee tegen hooguit milde histopathologische tekenen van ontsteking, in overeenstemming met de virtuele afwezigheid van mini-endoscopisch detecteerbare tekenen van colitis.

Bovendien tonen correlatiestudies tussen mini-endoscopisch en histopathologisch beoordeelde colitisactiviteit en systemische GvHD-scores aan dat mini-endoscopisch bepaalde sommige scores van minder dan of gelijk aan drie betrouwbaar voorspellen dat de afwezigheid van mid-to-higher-grade darm-GvHD-geassocieerde colonische ontstekingsscores verkregen uit histopathologische sortering. Bovendien toont de ernst van de endoscopisch beoordeelde darmgvHD een correlatie met systemische GvHD-ziekteactiviteit. Om de resultaten van mini-endoscopische evaluatie van darmontsteking te standaardiseren en om de vergelijkbaarheid tussen verschillende muizen en experimenten in de loop van de tijd te garanderen, moet een gedefinieerde anatomische site worden geselecteerd om te scoren.

Naast het scoren van colonische ontsteking, het ingebouwde werkkanaal binnen de mini-endoscopische setup maakt het ophalen van view-guided weefsel biopten van toepassing op verschillende downstream-analyses, zoals standaard histopathologie. Vanwege het niet-invasieve karakter van de mini-endoscopie kan acute GvHD-gerelateerde colitis op vrijwel elk moment herhaaldelijk binnen hetzelfde dier worden beoordeeld, waardoor fascinerende inzichten in intestinale GvHD ontstaan.